質(zhì)粒提取和酶切分析

1、 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析的限制性內(nèi)切酶酶切分析1. 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、掌握對重組質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶掌握對重組質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切的原理和方法切的原理和方法 ，并理解限制性內(nèi)切，并理解限制性內(nèi)切酶是酶是DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵工具。重組技術(shù)的關(guān)鍵工具。 2. 相關(guān)基礎(chǔ)知識相關(guān)基礎(chǔ)知識 限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于體外剪切基因片段的重要工具酶。 上世紀七十年代，當(dāng)人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進行研究時，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。首批被發(fā)現(xiàn)的限制性

2、內(nèi)切酶包括來源于大腸桿菌的EcoR I和EcoR II，以及來源于流感嗜血桿菌(Heamophilus influenzae)的Hind II和Hind III。這些酶可在特定位點切開DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達非常有用的工具。 1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細菌細胞的一種防衛(wèi)手段。各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來限制外源DNA存在于自身細胞內(nèi)，但合成這種酶的細胞自身的DNA不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的DNA進行了修飾，限制性酶對修飾過的DNA不

3、能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。2)限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性 按限制酶的亞基組成和切斷核酸情況 的不同，分為三類： 型 型* 型第一類（I型）限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。 第三類（III型）限制性內(nèi)切酶也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定

4、長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。第二類(II型)限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數(shù)也有識別5個核苷酸以及7個、8個、9個、10個和11個核苷酸的。這種酶的切割可以有兩種方式：粘性末端粘性末端；是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識別順序為： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5在雙鏈

5、上交錯切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV 的識別位置是： 5 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 切割后形成5 GAT ATC 33 CTA TAG 5 這種末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來。平頭末端：平頭末端：異源同工酶：又稱同裂酶有時兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，這些有相同切點的酶稱為同裂酶（或同切酶）。同裂酶差別只在于當(dāng)識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內(nèi)

6、切酶可以切割，另一種則不能。例如Hpa和Msp的識別順序都是5G|CG G33G GC|G53） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶同尾酶的切割產(chǎn)物可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞。同尾酶：同尾酶：如Xba1和Nhe1: 5T|CTAGA3 5G|CTAGC3 3AGATC|T5 3CGATC|G5 5T CTAGA3 5G CTAGC3 3AGATC T5 3CGATC G5 5TCTAGC3 3AGATCG5 這些粘性末端連接后，Xba1和Nhe1酶將不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切

7、識別位點為GATC)來進行再切割。4) 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法限制性核酸內(nèi)切酶的命名法v 用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用Eco表示，所以用斜體字。v 用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。v 如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示，如Hind, Hind，Hind等。3. 酶切反應(yīng)的設(shè)計一般應(yīng)注意問題酶切反應(yīng)的設(shè)計一般應(yīng)注意問題: : 1) 大多數(shù)限制酶貯存在50甘油溶液中，以避免在-20條件下結(jié)冰。當(dāng)最終反應(yīng)液中甘油濃度大于12時，某些限制酶

8、的識別特異性降低，從而抑制酶活性。因此加入反應(yīng)的酶體積不超過反應(yīng)總體積的10%。 2) 反應(yīng)混合物中基因組DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的基因組DNA會形成粘性DNA溶液,從而抑制酶的擴散，并降低酶活性。建議酶切反應(yīng)的基因組DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。同時RNA應(yīng)該盡量消化去除。3) 當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時，必須選擇好通用緩沖液，則兩種酶才可同時切割。 4) 酶切底物DNA應(yīng)具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會不同程度地影響限制酶的活性。5) 反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的

9、BSA，可維持酶的穩(wěn)定性。酶單位定義酶單位定義:活性單位：活性單位： 在最適反應(yīng)條件下在最適反應(yīng)條件下(溫度、溫度、PH值、離子值、離子濃度）濃度）1小時內(nèi)完全酶切小時內(nèi)完全酶切1g特定特定DNA底物所需的底物所需的限制酶的量。限制酶的量。4. 酶切實驗中的注意事項酶切實驗中的注意事項: :1) 反應(yīng)取酶時應(yīng)使用無菌吸頭，以免污染酶液，同時應(yīng)盡量縮短酶在溫室的放置時間。2) 反應(yīng)混合物混勻時，應(yīng)避免強烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。 3) 反應(yīng)前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。4) 終止酶反應(yīng)可根據(jù)需要采用不同的方法： 酶切后不需進行下一步反應(yīng)，

10、可加入含EDTA的終止液終止反應(yīng)。 若需進一步反應(yīng)(如連接，切割等)，可將反應(yīng)管置65保溫20-30分鐘，以滅活酶，終止反應(yīng)。 可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。4. 酶切實驗設(shè)計的一般思路酶切實驗設(shè)計的一般思路: : 軟件檢測目的需要轉(zhuǎn)移操作的目的基因片段含有的酶切位點情況，選擇基因內(nèi)部不存在的內(nèi)切酶。 確定雙酶切的通用buffer 確定內(nèi)切酶的最適用量和酶切時間 進行酶切實驗3. 3. 實驗材料與儀器實驗材料與儀器質(zhì)粒：重組質(zhì)粒BamH核酸內(nèi)切酶（Takara）酶解緩沖液(10K buffer)離心機，水浴鍋10ml微量移液器，無菌的0.5mL EP管4. 實驗方法和步驟實驗方法和步驟 Tota

11、l ddH2O 10Buffer BamH DNA(50ng/ml)10ml 7.2ml 1ml o.8ml 1ml2) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶解的限制性內(nèi)切酶酶解1) 質(zhì)粒中質(zhì)粒中RNA的酶解的酶解 向30ml質(zhì)粒溶液中加入10mg/mL Rnase 2ml， 37水浴酶解0.5小時。 置于30水浴酶解3小時。酶解完成后，分別進行電泳分析。Sac1 4-12U/Sac1 4-12U/m ml lXba1 8-20U/Xba1 8-20U/m ml lDNADNA限制性內(nèi)切酶對基因組限制性內(nèi)切酶對基因組DNADNA完全酶切的酶量完全酶切的酶量和所用的時間是負相關(guān)的和所用的時間是負相關(guān)的

12、如如Xba1:Xba1:50U50U完全酶切需要完全酶切需要5h, 5U5h, 5U完全酶切則需要完全酶切則需要20h20h 堿裂解法小量制備質(zhì)粒堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA一實驗?zāi)康募氨尘耙粚嶒災(zāi)康募氨尘百|(zhì)粒圖譜的閱讀質(zhì)粒圖譜的閱讀質(zhì)粒特點質(zhì)粒類型質(zhì)粒的應(yīng)用分離質(zhì)粒DNA方法堿裂解法基本原理實驗試劑實驗試劑q堿裂解法流程圖堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體對數(shù)期菌體溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重懸充分重懸溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀質(zhì)粒質(zhì)粒DNA溶液溶液三實驗方法三實驗方法 四、結(jié)果檢測1. 1.菌體老化菌體老化2.2.堿裂解不

13、充分堿裂解不充分3.3.菌體中無質(zhì)粒菌體中無質(zhì)粒4.4.溶液使用不當(dāng)溶液使用不當(dāng)1. 1.請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)選新菌落進行液體培養(yǎng)2.2.可減少菌體用量或增加溶液可減少菌體用量或增加溶液的用量的用量3.3.不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。檢查抗生素應(yīng)接種單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。使用濃度是否正確。4.4.溶液溶液在溫度較低時可能出在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，置于現(xiàn)渾濁，置于3737保溫片刻保溫片刻直至溶解為清亮的溶液直至溶解為清亮的溶液。q問題一：未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決？問題一：未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決？ 原原因因?qū)Σ卟?. 1.混有蛋白混有蛋白2.2.混有混有RNARNA3.3.混有基因組混有基因組DNADNA1. 1.不要使用過多菌體。重新純化不要使用過多菌體。重新純化DNADNA，去除蛋白、多糖、多酚，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)等雜質(zhì)2.2.加入加入RNaseARNaseA室