(4) 絮凝沉淀技術

1、原料液原料液細胞分離細胞分離( (離心，過濾離心，過濾) )細胞胞內產物細胞胞內產物路線一路線一路線二路線二細胞破碎細胞破碎碎片分離碎片分離路線一路線一A A路線一路線一B B清液胞外產物清液胞外產物粗分離粗分離( (沉淀沉淀/ /超過濾超過濾/ /萃取萃取) )純化純化( (層析、離子交換、吸附層析、離子交換、吸附) )脫鹽脫鹽( (凝膠過濾、超濾凝膠過濾、超濾) )濃縮濃縮( (超濾超濾) )精制精制( (結晶、干燥結晶、干燥) )包含體包含體溶解溶解( (加鹽酸胍、脲加鹽酸胍、脲) )復性復性破碎方法介紹破碎方法介紹1.機械破碎法機械破碎法2.物理破碎法物理破碎法3.化學破碎法化學破碎法

2、4.酶學破碎法酶學破碎法1. 高壓勻漿破碎高壓勻漿破碎2. 珠磨破碎珠磨破碎3. 噴霧撞擊破碎噴霧撞擊破碎4. 超聲波破碎超聲波破碎機械破碎機械破碎450 m/s50-70 MPa剪切力剪切力在超聲波作用下在超聲波作用下液體發(fā)生空化作液體發(fā)生空化作用（用（cavitation），），空穴的形成、增空穴的形成、增大和閉合產生極大和閉合產生極大的沖擊波和剪大的沖擊波和剪切力，使細胞破切力，使細胞破碎。碎。（2）壓力差破碎法）壓力差破碎法 滲透壓沖擊滲透壓沖擊將細胞先放入高滲透壓的介質中，如高濃度的甘將細胞先放入高滲透壓的介質中，如高濃度的甘油或蔗糖溶液，在達到平衡后，介質被突然稀釋，油或蔗糖溶液，

3、在達到平衡后，介質被突然稀釋，或將細胞轉入水中或緩沖液中，水就會迅速進入或將細胞轉入水中或緩沖液中，水就會迅速進入細胞內，致使細胞膨脹，引起細胞壁的破裂細胞內，致使細胞膨脹，引起細胞壁的破裂.此法適用于細胞壁比較脆弱的，或者細胞壁預先此法適用于細胞壁比較脆弱的，或者細胞壁預先用酶處理過的，或細胞壁合成受到抑制的微生物。用酶處理過的，或細胞壁合成受到抑制的微生物。 在各種細胞破碎法種是最為溫和的一種。在各種細胞破碎法種是最為溫和的一種。(3)干燥破碎干燥破碎 干燥破碎可采用空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥破碎可采用空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。干燥和冷凍干燥等。 干燥過程能使細胞膜滲透性

4、改變，再用丙酮、干燥過程能使細胞膜滲透性改變，再用丙酮、丁醇或緩沖液等處理時，胞內物質就容易被抽丁醇或緩沖液等處理時，胞內物質就容易被抽提出來。提出來。 沉淀分離技術廣泛應用于抗生素、有機酸等小分子物質和沉淀分離技術廣泛應用于抗生素、有機酸等小分子物質和蛋白質、多糖、核酸等大分子物質的分離。蛋白質、多糖、核酸等大分子物質的分離。通過沉淀技術可以達到產物濃縮的目的。通過沉淀技術可以達到產物濃縮的目的。沉淀可以將已經純化的產品由液態(tài)變成固態(tài)加以保存或進沉淀可以將已經純化的產品由液態(tài)變成固態(tài)加以保存或進一步處理。一步處理。沉淀可以進行間歇或連續(xù)操作。沉淀可以進行間歇或連續(xù)操作。沉淀的方法和技術應具有

5、一定的選擇性，以使要分離的目沉淀的方法和技術應具有一定的選擇性，以使要分離的目標成分得以很好的分離。（選擇性越好，純度越高）標成分得以很好的分離。（選擇性越好，純度越高）對于酶類和蛋白質，除了選擇性之外，還需要注意沉淀方對于酶類和蛋白質，除了選擇性之外，還需要注意沉淀方法對目標成分活性和結構的破壞作用。法對目標成分活性和結構的破壞作用。對用于食品和醫(yī)藥中的目標成分，還需要考慮沉淀劑殘留對用于食品和醫(yī)藥中的目標成分，還需要考慮沉淀劑殘留對人體是否有害。對人體是否有害。待處理溶液待處理溶液加入沉淀劑加入沉淀劑沉淀物的陳化（沉淀析出）沉淀物的陳化（沉淀析出）收集沉淀收集沉淀離心或過濾離心或過濾收集上

6、清收集上清原理：原理： 利用金屬離子與酸根在形成鹽類時溶利用金屬離子與酸根在形成鹽類時溶解度低而進行的分離操作。解度低而進行的分離操作。檸檬酸工業(yè)生產檸檬酸工業(yè)生產檸檬酸有溫和爽快的酸味，普遍用于各種飲料、汽水、葡萄檸檬酸有溫和爽快的酸味，普遍用于各種飲料、汽水、葡萄酒、糖果、點心、餅干、罐頭果汁、乳制品等食品的制造。酒、糖果、點心、餅干、罐頭果汁、乳制品等食品的制造。檸檬酸屬于果酸的一種，主要作用是加快角質更新，常用于乳檸檬酸屬于果酸的一種，主要作用是加快角質更新，常用于乳液、乳霜、洗發(fā)精、美白用品、抗老化用品、青春痘用品等。液、乳霜、洗發(fā)精、美白用品、抗老化用品、青春痘用品等?；?、紡織化

7、工、紡織醫(yī)藥醫(yī)藥環(huán)保環(huán)保禽畜生產禽畜生產中和中和酸解酸解沉淀法從發(fā)酵液中提取檸檬酸沉淀法從發(fā)酵液中提取檸檬酸2C6H8O7H2O+3CaCO3-Ca3(C6H5O7)24H2O+3CO2+H2OCa3(C6H5O7)24H2O+3H2SO4+H2O -2C6H8O7H2O+3CaSO4H2O谷氨酸谷氨酸+Zn+鋅鹽法鋅鹽法鈣鹽法鈣鹽法谷氨酸谷氨酸+Ca2+谷氨酸谷氨酸氨基酸一級結構二級結構三級結構四級結構血紅蛋白疏水作用力疏水作用力氫鍵作用力氫鍵作用力離子鍵作用力離子鍵作用力二硫鍵二硫鍵蛋白質蛋白質NaClMgSO4(NH4)2SO4Na2SO4磷酸鹽磷酸鹽檸檬酸鈉檸檬酸鈉-乳球蛋白0.63馬

8、血紅蛋白0.330.710.761.000.69人血紅蛋白2.00馬肌紅蛋白0.94卵清蛋白1.22纖維蛋白原1.071.46溶解度大，能配制高離子強度的鹽溶液；溶解度大，能配制高離子強度的鹽溶液；鹽析作用強，一般多價陰離子較強，而多價陽離子容鹽析作用強，一般多價陰離子較強，而多價陽離子容易使鹽析作用降低；易使鹽析作用降低；溶解度受溫度影響小，便于在低溫下操作溶解度受溫度影響小，便于在低溫下操作在生物學上惰性，不能影響蛋白質的分子活性，而且盡在生物學上惰性，不能影響蛋白質的分子活性，而且盡量不引入分離和測定的新雜質。量不引入分離和測定的新雜質。鹽溶液的密度不高，便于蛋白質沉淀的沉降和離心分離。

9、鹽溶液的密度不高，便于蛋白質沉淀的沉降和離心分離。來源豐富、經濟，常用鹽有硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。來源豐富、經濟，常用鹽有硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。TCIC鹽的種類鹽的種類鹽析作用鹽析作用溶解度溶解度溶解度受溶解度受T影響影響緩沖能力緩沖能力其他性質其他性質硫酸銨硫酸銨大大大大小小小小含氮、便宜含氮、便宜硫酸鈉硫酸鈉大大較小較小大大小小不含氮、較貴不含氮、較貴磷酸鹽磷酸鹽小小較小較小大大大大不含氮、貴不含氮、貴目標蛋白目標蛋白來源來源硫酸銨飽和濃度硫酸銨飽和濃度收率收率純化倍數(shù)純化倍數(shù)一次沉淀二次沉淀人干擾素細胞培養(yǎng)液 30（上清液） 80（沉淀）991.7白細胞介素2細胞培養(yǎng)液 35（上清

10、液） 85（沉淀）73.57.0組織纖溶酶原激活物豬心抽提液50（沉淀）751.8蛋白質鹽析沉淀實例100ml血清+100ml PBS滴加200ml飽和硫酸銨 pH7.2上清液 含清蛋白（Ab）沉淀溶于PBS，定容100ml沉淀含纖維蛋白質上清液上清液沉淀主要含-球蛋白和少量-球蛋白上清液為-球蛋白及小量清蛋白及球蛋白沉淀主要為-球蛋白溶于PBS中定容100ml上清液為-球蛋白沉淀主要為球蛋白溶于PBS中定容100ml上清液沉淀主要為-球蛋白滴加飽和硫酸銨至45%飽和度上清液為-球蛋白及小量清蛋白及-球蛋白沉淀主要為-球蛋白滴加飽和硫酸銨至20%飽和度滴加飽和硫酸銨至30-33%飽和度滴加飽和

11、硫酸銨至45%飽和度滴加飽和硫酸銨至30-33%飽和度滴加飽和硫酸銨至30-33%飽和度穩(wěn)定穩(wěn)定Structure of the pentapeptide Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu. N terminusC terminusProtein structure“Acidic” amino acids : containing additional carboxyl groups which are usually ionized aspartic acid (Asp, D，天冬氨酸)glutamic acid (Glu, E，谷氨酸)“Basic” amino acids : co

12、ntaining positively charged groupsLysine (Lys, K, 賴氨酸)A imidazole group (咪唑基)Arginine (arg, R,精氨酸)d de ea guanidino group (胍基）Histidine (His, H，組氨酸)-+pH=pIpH pIpH Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+硫酸鋁硫酸鋁 Al2(SO4)318H2O（明礬）；（明礬）；氯化鋁氯化鋁 AlCl36H2O;三氯化鐵三氯化鐵 FeCl3;硫酸亞鐵硫酸亞鐵 FeSO47H2O ；石灰；石灰；ZnSO4；MgCO3真溶劑分子： 11

13、0-7cm膠體顆粒： 110-4cm-110-7cm懸浮物顆粒： 110-4cm-110-2cm溶解狀態(tài)、穩(wěn)定，可透過濾紙，擴散很快，可滲析、不沉淀。膠體狀態(tài)、較穩(wěn)定，能透過濾紙，擴散極慢，不能滲析、不易沉淀。不能透過濾紙、不擴散、不滲析、短時間內不沉淀。膠體和懸浮物的特點：均為不溶物。均具有布朗運動，碰撞使小顆粒聚集，進而絮凝。均帶有電荷，這也是膠體和懸浮物顆粒在液體中穩(wěn)定存在的原因。l絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質量可高達數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結構，其鏈節(jié)上含有量可高達數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結構，其鏈節(jié)上含有許多活性官能

14、團，包括離子基團以及非離子型基團。許多活性官能團，包括離子基團以及非離子型基團。l它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。吸附在膠粒的表面。l當一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒當一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產生架橋聯(lián)結時，就形成較大絮團，產生絮凝作表面上，產生架橋聯(lián)結時，就形成較大絮團，產生絮凝作用。用。 絮絮 凝凝絮凝作用機理絮凝作用機理1、顆粒凝集2、雙電層的壓縮和電荷的中和作用3、橋連作用4、沉淀的網捕機理膠體由于所帶電荷的斥力大于顆粒布朗運動的動能，所以能夠在液體中穩(wěn)定存在

15、。當平衡被打破，即出現(xiàn)脫穩(wěn)狀態(tài)。幾種脫穩(wěn)狀態(tài)：（1）膠體顆粒水化膜具有粘滯力，顆粒間范德華力不足以把顆粒間夾層水化膜完全排斥，此時顆粒雖能夠集結，但不能直接接觸，稱之為凝聚凝聚。（2）當顆粒的水化膜粘滯較弱時，顆粒間的范德華力足以把水夾層排擠出去，顆粒間直接接觸，這樣的過程成為凝結凝結。（3）顆粒的凝聚和凝結都是膠體脫穩(wěn)并形成細小凝聚體的過程，這些細小的凝聚體在絮凝劑的作用下生成體積較大的絮凝體，從水中分離出來，稱之為絮凝過程絮凝過程。1、顆粒凝集、顆粒凝集雙電層的壓縮和電荷的中和作用雙電層的壓縮和電荷的中和作用電解質可以中和顆粒表面的電荷而壓縮膠體中的雙電層。膠體的電荷中和作用膠體的電荷中和

16、作用指由于膠體顆粒表面對帶相反電荷的異電吸附而中和了膠粒的部分電荷，是膠體的點位降低到足以克服斥力產生絮凝沉淀。雙電層的壓縮雙電層的壓縮絮凝劑的分類：絮凝劑無機絮凝劑有機絮凝劑無機低分子絮凝劑無機高分子絮凝劑天然有機高分子絮凝劑人工合成有機高分子絮凝劑無機陽離子絮凝劑無機陰離子絮凝劑鋁鹽無機高分子絮凝劑鐵鹽無機高分子絮凝劑人工合成陽離子有機高分子絮凝劑人工合成陰離子有機高分子絮凝劑人工合成非離子有機高分子絮凝劑可分為三類：人工合成有機高分子聚合物、天然有可分為三類：人工合成有機高分子聚合物、天然有機高分子聚合物、無機高分子聚合物機高分子聚合物、無機高分子聚合物1 1）目前常用的是人工合成有機高

17、分子聚合物，如聚）目前常用的是人工合成有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚乙烯亞胺衍生物；聚丙烯酸丙烯酰胺類衍生物、聚乙烯亞胺衍生物；聚丙烯酸類和聚苯乙烯類衍生物。類和聚苯乙烯類衍生物。工業(yè)上使用的絮凝劑工業(yè)上使用的絮凝劑 高分子聚合物絮凝劑根據活性基團在水中解離情高分子聚合物絮凝劑根據活性基團在水中解離情況不同，可分為三類：陰離子型（含有羧基況不同，可分為三類：陰離子型（含有羧基) )、陽離、陽離子型（含有胺基）子型（含有胺基） 、非離子型、非離子型聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點l 用量少，一般以用量少，一般以mg/L計量；計量；l 絮凝體粗大，分離效果好；絮凝體粗大

18、，分離效果好；l 絮凝速度快；絮凝速度快；l 種類多，適用范圍廣種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點：聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點：存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應謹慎。時應謹慎。目前最常見：聚丙烯酰胺類絮凝劑目前最常見：聚丙烯酰胺類絮凝劑微生物絮凝劑微生物絮凝劑1、微生物絮凝劑的商業(yè)化生產始于、微生物絮凝劑的商業(yè)化生產始于20世紀世紀90年代，年代，如紅平紅球菌及由此制成的如紅平紅球菌及由此制成的NOC-1NOC-1是目前發(fā)現(xiàn)的最佳微生物絮凝劑是目前發(fā)現(xiàn)的最佳微生物絮凝劑 2、微生物絮凝劑或將大部

19、分替代普通絮凝劑、微生物絮凝劑或將大部分替代普通絮凝劑3、浮游藻類、草分枝桿茵、硅酸鹽芽孢桿菌。、浮游藻類、草分枝桿茵、硅酸鹽芽孢桿菌。1、pH對絮凝作用的影響對絮凝作用的影響;2、溫度對絮凝作用的影響，一般選擇、溫度對絮凝作用的影響，一般選擇20-30;3、攪拌速度和時間，一般、攪拌速度和時間，一般40-80r/min;4、高分子絮凝劑的性質和結構對絮凝作用的影響，線形環(huán)、高分子絮凝劑的性質和結構對絮凝作用的影響，線形環(huán)形形;5、有機高分子絮凝劑的相對分子量對絮凝作用的影響，一、有機高分子絮凝劑的相對分子量對絮凝作用的影響，一般在般在25000以上；以上；6、絮凝劑的用量、絮凝劑的用量;本章

20、內容回顧1.機械破碎法2.物理破碎法3.化學破碎法4.酶學破碎法1. 高壓勻漿破碎2. 珠磨破碎3. 噴霧撞擊破碎4. 超聲波破碎1. 溫度差破碎法（凍融破碎）2. 壓力差破碎法沉淀技術的特點沉淀技術的特點鹽析法的優(yōu)點：鹽析法的優(yōu)點： 成本低；操作簡單、安全；對許多生物活性物質穩(wěn)定。成本低；操作簡單、安全；對許多生物活性物質穩(wěn)定。鹽析的作用原理：鹽析的作用原理： 破壞了兩性電解質的雙電層和水化層，使其聚合沉淀。破壞了兩性電解質的雙電層和水化層，使其聚合沉淀。鹽析常數(shù)鹽析常數(shù)ks鹽析方法的分類1. Ks分段鹽析法2. 分段鹽析法影響鹽析的因素（1） 蛋白質濃度的影響溶解度大溶解度大鹽析作用強鹽析

21、作用強溶解度受溫度影響小溶解度受溫度影響小在在生物學上惰性生物學上惰性，鹽溶液的鹽溶液的密度不高密度不高，來源豐富、來源豐富、經濟。經濟。（3）pH 對鹽析的影響硫酸銨鹽析法沉淀劑添加方式固體加入法飽和溶液法透析平衡法等電點等電點(pI)：溶液中蛋白質分子所帶凈電荷為零時的：溶液中蛋白質分子所帶凈電荷為零時的pH值。值。等電點沉淀法等電點沉淀法生物大分子的等電點易受鹽離子的影響而發(fā)生變化：生物大分子的等電點易受鹽離子的影響而發(fā)生變化：（1 1）若蛋白質結合鈣鎂鋅等陽離子多，則等電點升高；若蛋白質結合鈣鎂鋅等陽離子多，則等電點升高；（2 2）若蛋白質結合若蛋白質結合HPOHPO4 42-2- 、SOSO4 42-2- 、ClCl- -等陰離子多，則等電點降低；等陰離子多，則等電點降低；（3 3）自然界中許多蛋白質較易結合陰離子，使等電點向酸側移動。自然界中許多蛋白質較易結合陰離子，使等電點向酸側移動。概念：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質的概念：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。有機溶劑沉淀