肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)基因的篩選與鑒定-動(dòng)物科學(xué)實(shí)踐教學(xué)中心

1、項(xiàng)目類別學(xué)科名稱1學(xué)科代碼1學(xué)科名稱2學(xué)科代碼2項(xiàng)目受理號(hào)一般項(xiàng)目獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)C180803S2011J5043湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目申 請(qǐng) 書（表二）項(xiàng)目名稱：肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)基因的篩選與鑒定湖南省自然科學(xué)基金委員會(huì)二0一0年制一、內(nèi)容摘要（不超過 400字）子宮內(nèi)膜炎是造成母牛不孕的主要原因之一，其發(fā)病率高，嚴(yán)重影響著母牛的繁殖與 受胎率，而且增加飼料消耗和治療費(fèi)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約了養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)的正常發(fā)展。 近年來國內(nèi)外對(duì)牛子宮內(nèi)膜炎的研究集中在病原菌的分離、鑒定及其對(duì)病原微生物抑制的相關(guān) 研究上，然而對(duì)于子宮內(nèi)膜炎的抗病的分子機(jī)制尚不清楚，關(guān)于肉牛子宮內(nèi)膜炎的分子研究未 見相關(guān)

2、報(bào)道。本研究擬采用抑制性消減雜交（ SSH方法構(gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)cDNA文庫，篩選和鑒定差異表達(dá)基因，為肉牛子宮內(nèi)膜炎的抗病機(jī)理和生物治療奠定分子基礎(chǔ)，對(duì)肉 牛業(yè)的快速發(fā)展具有重要的意義。二、立項(xiàng)依據(jù)研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析，需結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢(shì)來論述科學(xué)意義；或結(jié)合國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中迫切需要解決的關(guān)鍵科技問題來論述其應(yīng)用前景。附主要參 考文獻(xiàn)目錄?！卷?xiàng)目的研究意義】子宮內(nèi)膜炎是造成母牛不孕的主要原因之一，其發(fā)病率高，嚴(yán)重影響著母牛的繁殖與受 胎率，而且增加飼料消耗和治療費(fèi)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約了養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)的正常發(fā)展。 根據(jù)病情的急緩和臨床癥狀的輕重，可分為急性型

3、、膿毒血癥型、慢性型和隱性型四種，其 中隱性型臨床上難以診斷，潛在對(duì)牛的繁殖性能危害更大1,2。牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病原因較為復(fù)雜，該病的發(fā)生主要與病源因素、繼發(fā)因素、機(jī)體的激素水平和免疫力等因素有關(guān)。治療方 案大多為抗生素治療，近年來隨著廣譜高效抗菌藥物的廣泛使用或?yàn)E用，出現(xiàn)大量的新型耐 藥菌株，尤其是多重耐藥菌臨床感染日益增多，同時(shí)伴隨著新耐藥譜的變異。近年來國內(nèi)外對(duì)牛子宮內(nèi)膜炎的研究集中在病原菌的分離、鑒定及其對(duì)病原微生物抑制 的相關(guān)研究上5,然而對(duì)于子宮內(nèi)膜炎的抗病機(jī)制尚不清楚，關(guān)于肉牛子宮內(nèi)膜炎的分子研 究未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用抑制性消減雜交（SSH）方法構(gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)cD

4、NA文庫，篩選和鑒定差異表達(dá)基因，為肉牛子宮內(nèi)膜炎的抗病機(jī)理和生物治療奠定分子基 礎(chǔ)，對(duì)肉牛業(yè)的快速發(fā)展具有重要的意義?！緡鴥?nèi)外研究現(xiàn)狀分析】牛子宮內(nèi)膜炎的研究重在奶牛，奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病原因較為復(fù)雜，該病的發(fā)生主要與 病源因素、繼發(fā)因素、機(jī)體的激素水平和免疫力等因素有關(guān)2,6。但是肉牛子宮內(nèi)膜炎也頻繁發(fā)生。其研究情況如下:1 .奶牛子宮內(nèi)膜炎研究進(jìn)展目前，關(guān)于奶牛子宮內(nèi)膜炎的研究較多，包括：(1)主要病原微生物的分離、鑒定和耐藥性分析；(2)子宮內(nèi)膜炎的治療方法研究。(1)子宮內(nèi)膜炎的主要病原微生物的分離、鑒定和耐藥性分析結(jié)合申請(qǐng)者近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，引起子宮內(nèi)膜炎的細(xì)菌主要有葡萄球菌、鏈球菌

5、、大腸 埃希菌、棒狀桿菌、假單胞菌、變形桿菌、生殖器桿菌、嗜血桿菌、乳酸菌、化膿性放線桿 菌、壞死性梭菌和擬桿菌等 5。劉明春等2009年研究發(fā)現(xiàn)，可通過病原菌的16SrRNA進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，通過 PCR方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定6,發(fā)現(xiàn)隱秘桿菌整合子基因的攜帶與牛子宮內(nèi) 膜炎密切相關(guān)7,此外，還發(fā)現(xiàn)奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌耐藥性及其與整合子奶牛子宮內(nèi)膜炎 致病性大腸桿菌的耐藥性和多重耐藥性與整合子攜帶有著密切關(guān)系8。(2)子宮內(nèi)膜炎的治療方法研究。用于母牛子宮內(nèi)膜炎治療的藥物主要為各種抗生素、化學(xué)制劑和激素等，但使用這些藥物進(jìn)行治療的主要缺點(diǎn)是細(xì)菌容易產(chǎn)生耐藥性，治療成本較高，易產(chǎn)生藥物殘留和降低子宮

6、的 防御機(jī)制9。隨之而來，生物制劑對(duì)子宮內(nèi)膜炎的治療研究納入到研究者的視野之內(nèi)，用微生態(tài)制劑、溶菌酶制劑和免疫制劑治療的應(yīng)用研究已經(jīng)展開10。生物制劑雖然在奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療中已經(jīng)顯示出了較好的療效，但到目前為止，還沒有一種用于防治奶牛子宮內(nèi)膜炎 的生物制劑上市，因此還需要進(jìn)行更多的試驗(yàn)研究。2 .肉牛子宮內(nèi)膜炎研究進(jìn)展。迄今為止，關(guān)于肉牛子宮內(nèi)膜炎的研究工作還未開展，但是子宮內(nèi)膜炎潛在的影響著肉 牛的繁殖，嚴(yán)重的影響著肉牛的經(jīng)濟(jì)效益。因而，肉牛子宮內(nèi)膜炎的分子機(jī)理研究迫在眉睫。 【存在的問題】子宮內(nèi)膜炎受外界因素的影響，與肉牛自身的免疫和抗病能力密切相關(guān)。目前雖然對(duì)于 子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生基礎(chǔ)

7、和治療研究很多，但是對(duì)于子宮內(nèi)膜炎的抗病機(jī)理是什么？其分子機(jī) 制又是什么？其機(jī)制尚不清楚。倘若這些研究清楚，我們可采用生物治療的方法，對(duì)子宮內(nèi) 膜炎抗性途徑進(jìn)行正向調(diào)控，從而達(dá)到治療的目的?！狙芯克悸泛皖A(yù)期目標(biāo)】1 .研究方法抑制性消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization , SSH)方法是一種篩選組織或細(xì)胞系差異表達(dá)基因的有效方法。1996年Diatchenko等將“抑制性PCR”理論與代表性差異分析相結(jié)合，建立了一種分離差異表達(dá)基因的新方法一抑制性消減雜交11。抑制性消減雜交方法將需要檢測(cè)的組織 mRNA稱為“tester”，將對(duì)照組織mRNA稱

8、為“driver” ,以mRNA合成cDNA 后，通過僅僅兩輪雜交和兩次PCR過程，就能有效地分離到在tester'中表達(dá)，而在driver中不表達(dá)或表達(dá)豐度較低的 mRNA。抑制性消減雜交方法通過兩次特異雜交和兩次特異PCR擴(kuò)增使假陽性率大大降低，真陽性率高達(dá)94%12。SSH能得到某種組織中相對(duì)其他組織的差異表達(dá)基因 的較全面的信息，它較好地克服了其它方法中低豐度基因難以得到的問題。該技術(shù)與其他分 子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，具有假陽性率低、敏感性高、效率高等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用于差異表 達(dá)基因的篩選上。2 .研究思路本研究擬采用抑制性消減雜交(SSH)方法構(gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)cDNA

9、文庫，篩選和鑒定差異表達(dá)基因，進(jìn)行差異基因的克隆，測(cè)序，為肉牛子宮內(nèi)膜炎的抗病機(jī)理和生物 治療奠定分子基礎(chǔ)。3 .預(yù)期目標(biāo)本項(xiàng)目如能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，將對(duì)構(gòu)建子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)cDNA文庫，可篩選出差異表達(dá)基因，為闡明子宮內(nèi)膜炎的分子機(jī)制基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究牛子宮內(nèi)膜炎的生物治療提供重要 線索。參考文獻(xiàn)1Pleticha S, Heuwieser W. Definition and diagnosis of chronic endometritis in cattle: a review. Dtsch Tierarztl Wochenschr, 2009,116(5):164-172.2李世宏，楊國

10、林，楊銳樂，嚴(yán)作廷.奶牛子宮內(nèi)膜炎研究進(jìn)展.中國奶牛，2007,7: 34-38.3王良娟，李躍民，馬勛，等.產(chǎn)后健康母牛與子宮炎牛子宮內(nèi)細(xì)菌分離與鑒定.甘肅畜牧獸醫(yī)，1996, 26(2): 11-12.4Sheldon IM, Cronin J, Goetze L, Donofrio G, Schuberth HJ.Defining postpartum uterine disease and the mechanisms of infection and immunity in the female reproductive tract in cattle. Biol Reprod, 2

11、009, 81(6):1025-1032.5Sheldon IM, Price SB, Cronin J, Gilbert RO, Gadsby JE.Mechanisms of infertility associated withclinical and subclinical endometritis in high producing dairy cattle. Reprod Domest Anim, 2009,44 Suppl 3:1-9.6劉明春,劉耀川，趙敬翠.牛子宮內(nèi)膜炎化膿隱秘桿菌16SrRNA基因的鑒定與分析.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009,29(3): 343-345.7Liu

12、MC, Wu CM, Liu YC, Zhao JC, Yang YL, Shen JZ. Dentfication, susceptibility, and detection of integron-gene cassettes of Arcanobacterium pyogenes in bovine endometritis.J Dairy Sci, 2009, 92(8):3659-3666.8趙紅霞，李培鋒，吳聰明，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌耐藥性及其與整合子關(guān)系的研究.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2009, 40(1): 142-144.9Singh J, Sidhu SS, Dhaliwal

13、 GS, et al. Effectiveness of lipopolysaccharide as an intrauterine immunomodulator incuring bacterial endometritis in repeat breeding cross-bred cows. Anim Reprod Sci, 2000, 59,(3/4): 159-166.10嚴(yán)作廷，劉永明，王東升，岳魁.生物制劑在奶牛子宮內(nèi)膜炎防治方面的研究概況.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008, 10: 66-67.11Diatchenko L, Lau Y F, Campbell A P, et al.

14、 Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:6025-6030.12Von Stein O D, Thies W G, Hofmann M. A high throughput screening for rarely transcribed differentially expressed genes.

15、Nucleic Acids Res, 1997, 25(13):2598-602.三、研究方案1 .研究內(nèi)容、研究目標(biāo)以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題?！狙芯磕繕?biāo)】篩選肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)基因，試圖發(fā)現(xiàn)與肉牛子宮內(nèi)膜炎密切相關(guān)的基因，為子 宮內(nèi)膜炎抗病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究肉牛子宮內(nèi)膜炎的生物治療提供重要線索。【研究內(nèi)容】第一、構(gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎 SSH消減cDNA文庫。第二、消減cDNA文庫中差異表達(dá)基因的篩選、克隆鑒定。第三、差異表達(dá)基因的表達(dá)譜分析，揭示差異基因在肉牛子宮內(nèi)膜炎中的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選、克隆和鑒定肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)基因，確定差異表達(dá)基因在乳牛子宮內(nèi)膜炎

16、中的作用，揭示肉牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，為肉牛子宮內(nèi)膜炎的快速診斷和治 療奠定基礎(chǔ)。2 .擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析?！狙芯糠椒ā繕?gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎 SSH消減cDNA文庫I消減cDNA文庫的篩選、克隆測(cè)序，進(jìn)行生物信息學(xué)分析差異表達(dá)基因的組織表達(dá)譜分析I確定差異表達(dá)基因在肉牛子宮內(nèi)膜炎中的作用【技術(shù)路線/實(shí)驗(yàn)方案】實(shí)驗(yàn)一、構(gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎 SSH消減cDNA文庫樣品采集（分別采集肉牛正常子宮和患有子宮內(nèi)膜炎的子宮）I提取總RNA的制備mRNA的分離、純化3mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNAI接頭連接I二輪消減雜交與PCR擴(kuò)增消減效率檢測(cè)連接載體，轉(zhuǎn)化“互補(bǔ)，篩選陽性克

17、隆，保存I獲得消減cDNA文庫實(shí)驗(yàn)二、從消減cDNA文庫中篩選差異表達(dá)基因，并進(jìn)行克隆測(cè)序、組織表達(dá)譜分析，確定其在肉牛子宮內(nèi)膜炎中的作用消減cDNA文庫的篩選I標(biāo)記正、反向消減 cDNA和未消減 Driver cDNA的探針I(yè)有效陽性克隆的PCR產(chǎn)物點(diǎn)膜3張I分別進(jìn)行斑點(diǎn)雜交I陽性克隆篩選(取雜交信號(hào)僅在用正向消減cDNA作探針雜交時(shí)出現(xiàn)、或信號(hào)強(qiáng)度明顯高于用反向消減cDNA和未消減的Driver cDNA作探針雜交時(shí)5倍以上者)I測(cè)序生物信息學(xué)分析I確定差異表達(dá)基因片段I差異表達(dá)基因的組織表達(dá)譜分析I初步確定差異表達(dá)基因在肉牛子宮內(nèi)膜炎中的作用【可行性分析】(1)成熟的相關(guān)技術(shù)項(xiàng)目組成員已

18、經(jīng)熟練掌握本研究所依賴的關(guān)鍵技術(shù)，如消減抑制雜交技術(shù)、基因克隆技術(shù)和基因的生物信息學(xué)分析等相關(guān)的理論和操作技術(shù)，為本項(xiàng)目的開展打下了堅(jiān)實(shí)的的基礎(chǔ)。(2)較強(qiáng)的研究工作經(jīng)驗(yàn)申請(qǐng)者有多年從事研究工作的經(jīng)驗(yàn)，主持和參與過許多項(xiàng)目的研究，在學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表研究論文和綜述文章多篇。項(xiàng)目組第二成員，獲得動(dòng)物遺傳博士學(xué)位，掌握了cDNA文庫構(gòu)建等分子生物學(xué)技術(shù)，在基因分離、克隆和功能研究方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。項(xiàng)目組第三成員 為國家肉牛疾病控制中心專家組成員，近年來主要從事肉牛、奶牛子宮內(nèi)膜炎和乳房炎等肉牛疾病相關(guān)課題的調(diào)研與科學(xué)研究。20052006年在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室訪問學(xué)習(xí)期間，開展分子生

19、物學(xué)、微生物學(xué)與免疫學(xué)等領(lǐng)域研究，參與了湖北省奶牛常見病的防治、1型菌毛體內(nèi)介導(dǎo)沙門氏菌侵襲樹突狀細(xì)胞及對(duì)免疫反應(yīng)的影響等省級(jí)、國家級(jí) 自然科學(xué)基金的部分研究工作；對(duì)實(shí)驗(yàn)必需的先進(jìn)儀器設(shè)備及技術(shù)平臺(tái)相當(dāng)熟悉；其所從事 的前期工作為本項(xiàng)目積累了相關(guān)技術(shù)知識(shí)和研究材料。項(xiàng)目組其他組成成員，均為引進(jìn)博士、 碩士，具有扎實(shí)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)方面的理論知識(shí)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作技能。申請(qǐng)者和項(xiàng)目組成員有充分的時(shí)間保障從事該項(xiàng)研究。(3)較完善的研究條件本課題研究依托的創(chuàng)新平臺(tái)是湖南省動(dòng)物學(xué)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物科學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，所屬學(xué)科動(dòng)物學(xué)學(xué)科為湖南省“十一五”重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科。目前擁有近500萬元的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，屬省內(nèi)同類實(shí)驗(yàn)室先進(jìn)水平，圖書資料及信息來源齊全。具有較成熟的技術(shù)分析條件，具備本研 究中各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試所需要的相關(guān)儀器設(shè)備。同時(shí)湘西北地區(qū)擁有漣源市天華科技牧業(yè)有限公司、湖南懷化振鑫牧業(yè)有限責(zé)任公司和湖南加華生物科技發(fā)展有限公司，確保實(shí)驗(yàn)材料的供給。項(xiàng)目組第三成員為國家肉牛體系中心肉牛疾病控制功能研究室科學(xué)家團(tuán)隊(duì)成員，可