第四章離心技術(shù)

1、儀器分析曾曾 瑾瑾生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院是將含有微小顆粒的懸浮液置于轉(zhuǎn)頭中，利用轉(zhuǎn)頭繞軸旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，將懸浮的微小顆粒按密度或質(zhì)量的差異將其分離的方法。 通常把微粒等速沉降運(yùn)動(dòng)時(shí)的速度稱(chēng)為沉降速度，可寫(xiě)為：m(1-0/)g=f(dx/dt) 此式可見(jiàn)粒子的沉降速度與m(1-0/)成正比，與阻力系數(shù)f成反比。 二、相對(duì)離心力二、相對(duì)離心力 離心機(jī)所產(chǎn)生的離心場(chǎng)(G)，通常以如下方程式表示:G=2r 式中，為轉(zhuǎn)頭的角速度，以rads表示；r為旋轉(zhuǎn)半徑(物質(zhì)質(zhì)點(diǎn)所處位置與旋轉(zhuǎn)中心的距離) 離 心 場(chǎng) 通 常 用 相 對(duì) 離 心 力 ( R e l a t i v eCentrifugal F

2、orce，RCF，用符號(hào)FRC表示)，也就是離心力的大小相當(dāng)于地心引力(即重力加速度g)的倍數(shù)來(lái)表示，即FRC=(2r/g)g 公式進(jìn)一步推導(dǎo)FRC=(2n)2r/602gg=1.11910-5n2rg 式中，n為轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速，以轉(zhuǎn)分(revolutions per minute，簡(jiǎn)寫(xiě)成rmin)表示；g為重力加速度，等于9806cms2 例如：在某個(gè)角度轉(zhuǎn)頭中，離心管口到旋轉(zhuǎn)中心的距離為4.8cm，而離心管底到旋轉(zhuǎn)中心的距離是8.0cm，當(dāng)轉(zhuǎn)速為12 000rmin時(shí)，離心管口和離心管底所受到的相對(duì)離心力FRC分別是： FRC(管口)=1.11910-5(12 000)24.8g =7 734g

3、 FRC(管底)=1.11910-5(12 000)28.0g =12 891g 三、沉降速度三、沉降速度 沉降速度(sedimentation velocity)：是指在強(qiáng)大的離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)顆粒沿半徑方向運(yùn)動(dòng)的距離。 被分離物質(zhì)顆粒(或大分子)在離心管中與轉(zhuǎn)頭一同旋轉(zhuǎn)時(shí)承受著沿半徑方向的直接離心力作用，用Fc來(lái)表示，那么Fc=M2r 由于顆粒處在液體介質(zhì)中，還必須考慮浮力的作用，因此我們用有效質(zhì)量來(lái)表示被分離顆粒物質(zhì)在離心場(chǎng)中質(zhì)量的大小，即M=V(-m) 假定顆粒為球形，則 這樣我們就得到公式 Fc=16D3 (-m) 2r 式中，M為顆粒有效質(zhì)量，用克(g)表示為轉(zhuǎn)頭角速度，

4、用弧度秒(rads)表示r為旋轉(zhuǎn)半徑，用厘米(cm)表示和m分別為顆粒和介質(zhì)的密度，用克厘米3(gcm3)表示V為顆粒體積，用立方厘米(cm3)表示D為顆粒的直徑，用厘米(cm)表示 361DV 顆粒受Fc作用沿半徑方向運(yùn)動(dòng)，即沉降，當(dāng)顆粒以速度v(cms)沉降時(shí)，又受到摩擦力(Ff)的作用。Ff=fv 式中，f為摩擦系數(shù)， 與介質(zhì)的粘度(m，單位帕秒、Pas)和顆粒的線性大小有一定關(guān)系，對(duì)一個(gè)球形顆粒來(lái)說(shuō)，按照Stokes定律f=3mD 顆粒受Fc、Ff的合力作用向管底沉降。當(dāng)Fc=Ff時(shí)，顆粒即達(dá)到其最終速度，并保持勻速運(yùn)動(dòng)。即16D3 (-m)2r=3mDv 移項(xiàng)整理得: v=（1/18

5、）D2 (-m) 2r/m 因?yàn)?=2n/60 所以 v=6.09210-4D2(-m)n2r/m 由此可以看出，顆粒沉降速度與三方面的因素有關(guān)： (1)(1)顆粒本身的性質(zhì)顆粒本身的性質(zhì) 沉降速度與顆粒直徑和密度成正比。密度相同時(shí)大顆粒比小顆粒沉降快；大小相同時(shí)，密度大的顆粒比密度小的沉降快。 (2)(2)介質(zhì)的性質(zhì)介質(zhì)的性質(zhì) 沉降速度與介質(zhì)的粘度、密度成反比，介質(zhì)粘度、密度大，則顆粒沉降慢。 (3)(3)離心條件離心條件 顆粒沉降速度與離心時(shí)轉(zhuǎn)速和旋轉(zhuǎn)半徑成正比。如果其他的條件不變，沉降速度隨著r的增大而增大。四、沉降系數(shù)四、沉降系數(shù)(一一)沉降系數(shù)沉降系數(shù)沉降系數(shù)(sedimentati

6、on coefficient)是指單位離心場(chǎng)作用下顆粒沉降的速度，以s來(lái)表示，s=v(2r)。我們已經(jīng)提到顆粒的沉降速度v與2r成正比。即 s=KD2 (-m)/m 假定顆粒為球形 K=1/18 從上式可看出：沉降系數(shù)s的值與顆粒的大小、形狀和密度，以及離心所使用的介質(zhì)的密度和粘度有關(guān)，而與轉(zhuǎn)頭的速度和類(lèi)型無(wú)關(guān)。 (二二)沉降常數(shù)沉降常數(shù) 公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)是20的水，它的密度和粘度(20,w，20，w)是已知的。在這種標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)中所確定的顆粒的沉降系數(shù)只依賴(lài)于顆粒本身的兩個(gè)參數(shù)，即顆粒大小和密度，而這兩個(gè)參數(shù)可以用離心的方法確定。顆粒在20水中的沉降系數(shù)稱(chēng)為其沉降常數(shù)S20 w。S20 w =KD

7、2 (-20w)/20w S20 w與它的測(cè)量狀態(tài)無(wú)關(guān)，因而具有通用的特性。 確定沉降常數(shù)沒(méi)有必要一定在水中進(jìn)行離心。如果已知介質(zhì)的特征值(Pm，m)，就可利用在該介質(zhì)中離心的數(shù)據(jù)確定沉降系數(shù)s，再將S20 w的表達(dá)式除以s的表達(dá)式，即可求出顆粒的沉降常數(shù)。 S20 w/s= KD2 (-20w)/20w/ KD2 (-m)/m S20 w=sKD2 (-20w) m / (-m) 20w = v(2r)(-20w) m / (-m) 20w 由此看出，如果已知在一定角速度和旋轉(zhuǎn)半徑r時(shí)的沉降速度v以及顆粒的浮力密度及其所在介質(zhì)的密度與粘度(、m)，就可以確定顆粒的沉降常數(shù)S20 w。，S20

8、 w的單位命名為Svedberg，以S表示：l S=10-13s(秒） (三三)沉降系數(shù)與物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量沉降系數(shù)與物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量 由沉降系數(shù)根據(jù)Svedberg公式可以計(jì)算出物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量：Mr=RTS20 w/D20 w(1- )式中，Mr是相對(duì)分子質(zhì)量D20 w是以20的水為介質(zhì)時(shí)顆粒的擴(kuò)散系數(shù)T是絕對(duì)溫度S20 w是顆粒的沉降常數(shù)為偏比容，等于溶質(zhì)粒子密度的倒數(shù)R是摩爾氣體常數(shù)，等于8.315J(molK)是溶劑密度 用此式計(jì)算物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量俗稱(chēng)SD法。也可用粘度()來(lái)求相對(duì)分子質(zhì)量(俗稱(chēng)S法)：M=4 69812/(l-) 可以看出，無(wú)論是SD法還是S法，都必須在已知物質(zhì)的

9、某些物理常數(shù)的前提下才能計(jì)算，由于物質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，求得的相對(duì)分子質(zhì)量往往是近似值 五、沉降時(shí)間五、沉降時(shí)間 樣品顆粒完全沉降到管底內(nèi)壁的時(shí)間tm，可以下列方程式表示：tm=(1/S)(lnx2-lnx1)/ 2 式中，x2表示旋轉(zhuǎn)中心到離心管底內(nèi)壁的距離x1表示旋轉(zhuǎn)中心到樣品溶液彎月面之間的距離 s為樣品沉降系數(shù)第二節(jié)第二節(jié) 離心機(jī)的構(gòu)造離心機(jī)的構(gòu)造 （離心機(jī)的構(gòu)造圖）（離心機(jī)的構(gòu)造圖） 一、離心室一、離心室（圖）（圖） 二、驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)二、驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 三、冷凍系統(tǒng)三、冷凍系統(tǒng) 四、真空系統(tǒng)四、真空系統(tǒng) 五、操作系統(tǒng)五、操作系統(tǒng)第三節(jié)第三節(jié) 離心轉(zhuǎn)頭和離心管離心轉(zhuǎn)頭和離心管 一、角度轉(zhuǎn)頭一、角度轉(zhuǎn)

10、頭（圖）（圖） 二、甩平轉(zhuǎn)頭二、甩平轉(zhuǎn)頭（圖）（圖） 三、垂直轉(zhuǎn)頭三、垂直轉(zhuǎn)頭（圖）（圖） 四、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭四、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭 五、五、連續(xù)流動(dòng)離心轉(zhuǎn)頭連續(xù)流動(dòng)離心轉(zhuǎn)頭 六、其他轉(zhuǎn)頭六、其他轉(zhuǎn)頭 七、離心轉(zhuǎn)頭的常用標(biāo)記及轉(zhuǎn)頭參數(shù)七、離心轉(zhuǎn)頭的常用標(biāo)記及轉(zhuǎn)頭參數(shù) 1轉(zhuǎn)頭標(biāo)記的意義轉(zhuǎn)頭標(biāo)記的意義 (1)符號(hào)：角度轉(zhuǎn)頭FA，垂直轉(zhuǎn)頭V；甩平轉(zhuǎn)頭SW；連續(xù)轉(zhuǎn)頭CF；區(qū)帶轉(zhuǎn)頭Z。 (2)英文字母后的數(shù)字表示該轉(zhuǎn)頭的最大額定轉(zhuǎn)速。 (3)Ti表示由鈦或鈦合金為材料制成的轉(zhuǎn)頭，不標(biāo)則為鋁或鋁合金做成的轉(zhuǎn)頭。 如：SW65Ti指該轉(zhuǎn)頭為甩平轉(zhuǎn)頭，最大額定轉(zhuǎn)速為65 000 rmin，轉(zhuǎn)頭由鈦金屬制成。 2轉(zhuǎn)頭參數(shù)轉(zhuǎn)頭參

11、數(shù) Rmax：從轉(zhuǎn)軸中心至離心管最外緣或離心管底的距離； Rmin：從轉(zhuǎn)軸中心至離心管最內(nèi)緣或離心管頂?shù)木嚯x； RPMmax：轉(zhuǎn)頭的最高安全轉(zhuǎn)速； FRCmax：轉(zhuǎn)頭以RPMmax運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，在Rmax處的相對(duì)離心力； FRCmin：轉(zhuǎn)頭以RPMmax運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，在Rmin處的相對(duì)離心力； K：衡量轉(zhuǎn)頭相對(duì)效率的量，K值愈小，效率愈高，所需離心時(shí)間就愈短八、離心管八、離心管 不同材料的離心管耐酸堿、抗腐蝕、抗溫變性能不同，能承受的壓力也不一樣，在使用前必須依據(jù)樣品溶劑的化學(xué)性質(zhì)和離心轉(zhuǎn)速選擇合適的離心管。常用的塑料離心管有聚乙烯管(PE)、纖維素管(CAB)、聚碳酸酯管(PC)和丙二醇酯管(PP)等。

12、 第四節(jié)第四節(jié) 各型離心機(jī)的性能各型離心機(jī)的性能 及適用范圍及適用范圍 一、低速離心機(jī)一、低速離心機(jī) 二、高速離心機(jī)二、高速離心機(jī) 三、超速離心機(jī)三、超速離心機(jī) 第五節(jié)第五節(jié) 離心方法離心方法 一、差速沉淀離心一、差速沉淀離心（圖）（圖） 差速沉淀離心(differential centrifugation)系指分步改變離心速度，用不同強(qiáng)度的離心力使具有不同質(zhì)量的物質(zhì)分批沉淀分離的方法，它適用于沉降速度差別在一到幾個(gè)數(shù)量級(jí)的混合樣品的分離，對(duì)于差別較小的物質(zhì)，差速離心難以得到滿意的分離效果。 二、速度區(qū)帶離心二、速度區(qū)帶離心（圖）（圖） 速度區(qū)帶離心(rate zonal centrifuga

13、tion)是將樣品置于一個(gè)平緩的介質(zhì)梯度中沉降，該梯度的最大密度低于樣品混合物的最小密度，樣品顆粒按照其不同的沉降速率沉降，從而互相分離。離心一定時(shí)間后不同大小的顆粒將沉降在不同的層次，產(chǎn)生所謂區(qū)帶。由于這種方法是根據(jù)顆粒的沉降速率來(lái)完成分離，且離心過(guò)程中形成區(qū)帶，所以稱(chēng)作速度區(qū)帶離心。這種方法適用于分離密度相似而大小有別的樣品。 (一一)介質(zhì)密度梯度的特征和制備介質(zhì)密度梯度的特征和制備 密度梯度的制備： 1、手工制備 先以不同濃度(密度)的梯度液(加蔗糖)，按由濃到稀的次序依次鋪入離心，形成不連續(xù)階梯密度。將此液柱的離心管垂直靜置在試管架上，在室溫2025時(shí)，只要23 h即會(huì)因重力作用及擴(kuò)散

14、作用而形成連續(xù)近線性的密度梯度。 2、儀器法制備 直接用密度梯度形成收集儀制備梯度。 3、冷凍法制備 用濃度等于高、低平均值的蔗糖或其他梯度液，等量放人各離心管中，然后垂直放置在-20-40低溫冰箱內(nèi)凍結(jié)后取出，在室溫下靜置熔化，如此反復(fù)二次即成近直線型梯度分布。 (二二)速度區(qū)帶離心介質(zhì)的選擇速度區(qū)帶離心介質(zhì)的選擇 1蔗糖 2甘油 三、等密度離心三、等密度離心（圖）（圖） 等密度離心(isopycniccentrifugation)又叫做平衡離心(equilibrium centrifugation)。樣品被置于一個(gè)較陡峭的密度梯度中沉降，該梯度的最大密度高于樣品混合物的最大密度，梯度的最小

15、密度低于樣品混合物的最小密度，當(dāng)樣品顆粒沿梯度運(yùn)動(dòng)到與顆粒的浮力密度相同的密度層時(shí)，就停止運(yùn)動(dòng)，這樣經(jīng)過(guò)一段較長(zhǎng)時(shí)間的離心，樣品中所有不同密度的顆粒就都將在各自的等密度區(qū)域中停止運(yùn)動(dòng)，從而分布在不同的密度梯度區(qū)域，即顆粒根據(jù)各自的浮力密度進(jìn)行分級(jí)分離。由于這種離心是將樣品顆粒沉降到介質(zhì)中與其浮力密度相等的密度梯度區(qū)，故名之等密度離心或平衡離心。這種方法適用于分離大小相近而密度不同的樣品。 這種分離有五個(gè)特點(diǎn)： (1)離心過(guò)程很長(zhǎng)。 (2)不需粘性介質(zhì)。 (3)顆粒的最終分布與其大小和質(zhì)量無(wú)關(guān)。無(wú)論其初始遷移速率如何，在給定的梯度中顆粒位置只受其浮力密度的影響。 (4)到達(dá)平衡位置的顆粒，一方面

16、來(lái)源于比其浮力密度低的低密度區(qū)，一方面來(lái)源于高密度區(qū)。也就是說(shuō)漂浮與沉降同時(shí)發(fā)生。所以在等密度離心中樣品可以和整個(gè)梯度相混合。 (5)樣品的裝載容積比速度區(qū)帶離心大，并且不會(huì)形成局部反向梯度。 (一一)介質(zhì)密度梯度的特征和制備介質(zhì)密度梯度的特征和制備 由以上等密度離心的基本過(guò)程可知，采用介質(zhì)密度梯度的主要目的是形成一系列具有不同密度的區(qū)域，以使具有不同浮力密度的顆粒處于其等密度區(qū)而彼此分離。介質(zhì)的密度沿旋轉(zhuǎn)半徑增加，接近管底處的密度高于樣品的最大密度，液面部分的密度低于樣品的最小密度，等密度離心的介質(zhì)密度梯度一般通過(guò)離心的方法來(lái)制備，如高濃度鹽溶液，在離心力作用下鹽離子依次向管底沉降，形成從液

17、面到管底逐漸增加的密度梯度，同時(shí)溶質(zhì)的擴(kuò)散又會(huì)阻礙這種梯度的形成，經(jīng)過(guò)足夠時(shí)間離心后，兩個(gè)過(guò)程可達(dá)到平衡，形成鹽溶液密度梯度，并在某一固定轉(zhuǎn)速下保持穩(wěn)定。 (二二)等密度離心介質(zhì)的選擇等密度離心介質(zhì)的選擇 1高濃度鹽溶液 CsCl密度梯度主要用于DNA的分級(jí)分離；也可利用沉淀作用對(duì)少量RNA進(jìn)行純化。三氯乙酸銫密度梯度能夠?qū)?、雙鏈RNA進(jìn)行分離；可使核糖核酸酶失活并且能將DNA和蛋白質(zhì)與RNA分開(kāi)，也可以從DNA和RNA中分離出DNARNA雜交體。三氯乙酸銣密度梯度用于分離變性DNA和天然DNA。 NaI密度梯度也廣泛應(yīng)用于各種天然和變性DNA的分離。KI密度梯度也可用于分離DNARNA雜交體。NaBr或KBr密度梯度較多地用于血漿脂蛋白的分離。 2Metrizamide密度梯度 四、分析性離心四、分析性離心 離心除了用于制備外，還可用于樣品的定性定量分析。在離心機(jī)上裝備光學(xué)系統(tǒng)，采用特殊的透光離心池，在離心過(guò)程中可以直接觀察樣品顆粒的沉降情況，以對(duì)樣品進(jìn)行定性定量分析。 五、離心操作要領(lǐng)五、離心操作要領(lǐng) 1精密地平衡離心管和它們的內(nèi)容物是十分重要的。 2平衡后的一對(duì)離心管及其內(nèi)容物(有時(shí)還可能包括離心管套筒)應(yīng)對(duì)稱(chēng)放置，不能錯(cuò)位，不能裝載單數(shù)的管子，以免因離心所產(chǎn)生的離心力不對(duì)稱(chēng)而損壞離心軸。 3當(dāng)平衡的離心管