生物質(zhì)譜技術(shù)與方法fytw

1、質(zhì)譜技術(shù)與方法質(zhì)譜分析法（mass spectrometry，MS）是將化合物形成離子和碎片離子，按質(zhì)荷比（m/z）的不同進(jìn)行分離，來(lái)進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。所得結(jié)果用質(zhì)譜圖（亦稱質(zhì)譜，MassSpectrum）表示。根據(jù)質(zhì)譜圖提供的信息可以進(jìn)行有機(jī)物及無(wú)機(jī)物的定性和定量分析、生物大分子的結(jié)構(gòu)分析、樣品中各種同位素比的測(cè)定及固體表面的結(jié)構(gòu)和組成分析等。生物質(zhì)譜（Bio - mass spectrometry，Bio-MS）是用于生物分子分析的質(zhì)譜技術(shù)。生物質(zhì)譜要求測(cè)定上萬(wàn)甚至是幾十萬(wàn)的相對(duì)分子質(zhì)量 。隨著電噴霧電離（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）技術(shù)的完善和成熟，生物大分子的質(zhì)

2、譜分析才得以實(shí)現(xiàn)。The Nobel Prize in Chemistry 2002for the development of methods for identification andstructure analyses of biological macromoleculesfor their development of softdesorption ionisation methods formass spectrometric analyses ofbiological macromoleculesfor hisdevelopment ofnuclear magneticreso

3、nancespectroscopy fordetermining thethree-dimensionalstructure ofbiologicalmacromolecules insolution約翰芬田中耕一庫(kù)爾特伍斯里奇質(zhì)譜法的基本原理質(zhì)譜分析的基本過(guò)程是使樣品在離子源中發(fā)生電離，生成不同質(zhì)荷比的帶電離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器，在其中再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使其發(fā)生色散、聚焦，獲得質(zhì)譜圖。質(zhì)譜分析中，多種離子化技術(shù)均可使物質(zhì)分子失去外層價(jià)電子形成分子離子（molecular ion，M+），分子離子中的化學(xué)鍵還可以繼續(xù)發(fā)生某些有規(guī)律的斷裂而形成不同質(zhì)量的碎片離子（frag

4、ment ion）：M M+ + 碎片離子 + 中性分子被分析樣品離子電離后經(jīng)加速進(jìn)入磁場(chǎng)時(shí)，其動(dòng)能與加速電壓及電荷z有關(guān)，即：zeU = 1/2mv2其中：z為電荷數(shù)，e為元電荷（e = 16010-19C），U為加速電壓，m為離子的質(zhì)量，v為離子初加速后的運(yùn)動(dòng)速度。具有速度v的帶電粒子進(jìn)入質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終各種離子按質(zhì)荷比（mz）的不同實(shí)現(xiàn)分離。質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀包括進(jìn)樣系統(tǒng)、電離系統(tǒng)、質(zhì)量分析器和檢測(cè)系統(tǒng)。為了獲得離子的良好分析，必須避免離子損失，因此凡有樣品分子及離子存在和通過(guò)的地方，必須處于真空狀態(tài)。在進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，一般過(guò)程是：通過(guò)合適的進(jìn)樣裝置將樣品引入并

5、進(jìn)行氣化。氣化后的樣品引入到離子源進(jìn)行電離。電離后的離子經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)募铀俸筮M(jìn)入質(zhì)量分析器，按不同的mz進(jìn)行分離。然后到達(dá)檢測(cè)器，產(chǎn)生不同的信號(hào)而進(jìn)行分析。質(zhì)量分析器檢測(cè)器樣品導(dǎo)入系統(tǒng)離子源真空泵m/z計(jì)算機(jī)控制與數(shù)據(jù)處理相對(duì)豐度質(zhì)譜儀的構(gòu)成DataSystemMassspectrumoutInletSystemMassAnalyzerIonSourceDetectorSampleinInlet systems:Ion sources:Mass analyzers:Simple vacuum lockHPLCGCElectrospray (ESI)MALDIFAB/LSIMSElectron io

6、nization (EI)QuadrupoleTime-of-flightIon trapMagnetic sectorFTMSMass Spectrometer SchematicVacuum envelope離子源(ion source)質(zhì)譜儀中將分子轉(zhuǎn)化為離子的裝置稱為離子源(ion source)。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對(duì)于不同的分子應(yīng)選擇不同的離解方法。通常將能給樣品較大能量、生成較多碎片離子的電離方法稱為硬電離方法（如電子轟擊離子化，EI），而給樣品較小能量、碎片離子較少或不生成碎片離子的電離方法稱為軟電離方法。生物質(zhì)譜中有代表性的離子源1電噴霧電離(El

7、ectrospray Ionization，ESI)2離子噴霧電離（Ion spray Ionization，ISI ）3大氣壓化學(xué)電離(Atmospheric PressureChemical Ionization，APCI)4基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix AssistedLaser Desorption Ionization，MALDI)5快原子轟擊電離(Fast Atom BonbardmentIonization，F(xiàn)AB)離子源是質(zhì)譜儀的心臟，可以將離子源看作是離子化反應(yīng)器，樣品在其中發(fā)生一系列的特征裂解反應(yīng)，反應(yīng)在很短時(shí)間（10-11s）內(nèi)發(fā)生，所以可以快速地獲得質(zhì)譜圖。質(zhì)量分

8、析器質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心，它將離子源產(chǎn)生的離子按其質(zhì)量和電荷比（質(zhì)荷比m/z，m離子的質(zhì)量數(shù)，z離子攜帶的電荷數(shù)）的不同在空間的位置時(shí)間的先后或軌道的穩(wěn)定與否進(jìn)行分離,以便得到按質(zhì)荷比（m/z）大小順序排列而成的質(zhì)譜圖。質(zhì)量分析器(mass analyzer)的種類1.磁質(zhì)量分析器(單聚焦質(zhì)量分析器,雙聚焦質(zhì)量分析器)2.四極質(zhì)量分析器(四極桿濾質(zhì)器)3.飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)4.離子阱(Ion Trap)質(zhì)量分析器5.離子回旋共振質(zhì)量分析器其中,234是目前生物質(zhì)譜分析中常用的質(zhì)量分析器檢測(cè)器1.直接電檢測(cè)器2.電子倍增器3.閃爍檢測(cè)器4.微通道板計(jì)算機(jī)控制與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.監(jiān)控各

9、單元的工作狀態(tài),實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜儀的全自動(dòng)操作.2.數(shù)據(jù)的采集和簡(jiǎn)化.3.質(zhì)量數(shù)的轉(zhuǎn)換.4.扣除本底或相鄰組分的干擾.5.譜峰強(qiáng)度歸一化.6.標(biāo)出高分辨質(zhì)譜的元素組成.7.用總離子流對(duì)質(zhì)譜峰強(qiáng)度進(jìn)行修正.8.譜圖的累加平均.9.輸出質(zhì)量色譜圖.10.單離子檢測(cè)和多離子檢測(cè).11.譜圖檢索.質(zhì)譜圖質(zhì)譜分析中，按各離子m/z的順序及相對(duì)強(qiáng)度大小記錄分析結(jié)果的圖譜即為質(zhì)譜圖。由于圖譜中離子的質(zhì)量及相對(duì)強(qiáng)度是各物質(zhì)所特有的，即反映了物質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此通過(guò)質(zhì)譜解析可以進(jìn)行物質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)分析。常見(jiàn)的質(zhì)譜圖是經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理后得到的棒圖（bar graph）。常見(jiàn)的質(zhì)譜圖是經(jīng)計(jì)算機(jī)處理的棒圖.圖中,縱坐標(biāo)表

10、示離子的相對(duì)豐度(以質(zhì)譜中最強(qiáng)峰的高度為100%,并將此峰稱位基峰,其余峰按與基峰的比例加以表示,又稱為相對(duì)強(qiáng)度);橫坐標(biāo)表示離子的質(zhì)荷比.根據(jù)峰位(棒位)可進(jìn)行定性鑒別;根據(jù)相對(duì)豐度可進(jìn)行定量測(cè)定.15282931(基峰)32(分子離子峰)33100806040201020304050m/z相對(duì)峰強(qiáng)棒圖(bar graph)CH3OH%Intensity1239.41679.82120.22560.6Mass (m/z)03001.00799.01020301001480.601567.46908070605040804.682044.211738.351570.451439.651894.

11、26 2047.21927.77843.872470.782210.101923.271724.381000.701209.841391.671574.122661.87 2807.672066.13牛血清蛋白（BSP）酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Voyager Spec #1BP = 1480.6, 812710030%Int.10090807060504034943495349634973498349935003501350235033497.64223496.65413498.62563495.65453499.6528203500.65953501.6502Resolution 20,000m/z

12、胰島素的高分辨質(zhì)譜圖質(zhì)譜儀的主要性能指標(biāo)衡量質(zhì)譜儀整體性能的主要指標(biāo)有：質(zhì)量范圍分辨率質(zhì)量準(zhǔn)確度靈敏度掃描速度等質(zhì)量分析器質(zhì)量上限(m/z)質(zhì)量準(zhǔn)確度（u）分辨率（R）掃描速度（u/s）適用范圍四極桿質(zhì)譜40000.1500300040006000小分子、多電荷離子大分子離子阱質(zhì)譜100000.110001000040006000小分子、多電荷離子大分子飛行時(shí)間質(zhì)譜5000000.001(高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜)5001000（低），200020000（高）1000000小分子、大分子不同類型質(zhì)量分析器的性能指標(biāo)質(zhì)量范圍(mass range)是指質(zhì)譜儀能夠測(cè)量的離子質(zhì)量范圍，通常用最小和最大離子

13、的離子質(zhì)量表示。質(zhì)譜分析中，是以核素12C質(zhì)量（12C=12.000u）的1/12為一個(gè)質(zhì)量單位（u）。1u = （12.00000 gmol-1 / 6.022141023 mol-1）/12= 1.6605410-24 g在生物大分子的質(zhì)譜分析中，還常用道爾頓（dalton，Da）作為度量單位。 1Da = 1.660310-24 g。 Da與u兩者相差萬(wàn)分之三左右，在生物質(zhì)譜分析中，可以視為1Da = 1u。質(zhì)量準(zhǔn)確度（mass accuracy）質(zhì)量準(zhǔn)確度又稱質(zhì)量精度，即離子質(zhì)量實(shí)測(cè)值M 與理論值M0 的相對(duì)誤差：質(zhì)量精度 = MM0/ m106 (ppm)（m為離子質(zhì)量數(shù)的整數(shù)）儀器

14、的質(zhì)量精度一般應(yīng)小于10 ppm。分辨率(resolution，R)分辨率是指儀器能分離相鄰兩質(zhì)譜峰的能力。若將強(qiáng)度近似相等、質(zhì)量分別為M和M+M 的兩個(gè)相鄰峰恰好分開(kāi)，則質(zhì)譜儀的分辨率定義為：Rm1 / (m2 - m1) m1 / M其中m1、m2：為質(zhì)量數(shù)，且m1m2：，故在兩峰質(zhì)量相差越小時(shí)，要求儀器分辨率越大。重點(diǎn)介紹兩種生物質(zhì)譜分析方法基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser DesorptionIonization / Time of Flight Mass Spectra，MALDI-TOF MS）電噴霧電離(Electrospray Io

15、nization，ESI)質(zhì)譜電噴霧離子化（ESI）原理內(nèi)襯彈性石英管的不銹鋼毛細(xì)管（內(nèi)徑0.10.15mm）被加以25kV的正電壓，與相距約12cm接地的反電極形成強(qiáng)靜電場(chǎng)。被分析的樣品溶液從毛細(xì)管流出時(shí)，在電場(chǎng)作用下形成高度荷電的霧狀小液滴；在向質(zhì)量分析器移動(dòng)的過(guò)程中，液滴因溶劑的揮發(fā)逐漸縮小，其表面上的電荷不斷增大。當(dāng)電荷之間的排斥異力足以克服表面張力時(shí)（瑞利極限），液滴發(fā)生裂分；經(jīng)過(guò)這樣反復(fù)的溶劑揮發(fā)-液滴裂分過(guò)程，最后產(chǎn)生單個(gè)的氣態(tài)離子。由于沒(méi)有外界能量直接作用于分子，因此對(duì)分子結(jié)構(gòu)破壞較少，是一種典型的“軟電離”方式。ESIMALDI1、離子化形式：產(chǎn)生多電荷離子，常與與HPLC聯(lián)

16、用，才適用于混合物中蛋白質(zhì)成分的鑒定1、離子化形式：通常產(chǎn)生單電荷離子，因此，適用于混合物中蛋白質(zhì)成分的-182、靈敏度：10 M-15 -182、靈敏度：10 M3、分辨率：5,0003、分辨率：5,0004、聯(lián)用形式：可與HPLC、CE在線聯(lián)用4、聯(lián)用形式：只能與HPLC、CE離線聯(lián)用5、與質(zhì)量分析器的兼容性：可與各種質(zhì)量分析器（QQQ, QTOF，Ion Trap，F(xiàn)TMS）兼容5、與質(zhì)量分析器的兼容性：主要與TOF配合使用6、源內(nèi)裂解能力：具有低能量（1keV）的誘導(dǎo)碰撞解離能力7、適用性：精確分子質(zhì)量測(cè)定、MS /MS 分析（使用Trap質(zhì)量分析器可做nMS 分析）7、適用性：精確分

17、子質(zhì)量測(cè)定、PMF分析8、操作的難易程度：需經(jīng)培訓(xùn)8、操作的難易程度：容易ESI與MALDI的比較質(zhì)量分析器(mass analyzer)在生物質(zhì)譜中，與ESI離子化源配合使用的質(zhì)量分析器主要有：、四極濾質(zhì)器、離子阱分析器和離子回旋共振分析器等。隨著技術(shù)的發(fā)展，也可以采用這些分析器的變型。四極濾質(zhì)器（Quadrupole Mass Filter）四極濾質(zhì)器也稱四極質(zhì)量分析器，它由四根截面呈雙曲面的平行金屬桿電極組成，離子束穿過(guò)對(duì)準(zhǔn)四根桿之間空間的準(zhǔn)直小孔。相對(duì)的一對(duì)電極是等電位的，兩對(duì)電極之間的電位是相反的。離子源的電位比四極濾質(zhì)器的電位略高幾個(gè)伏特，以提供離子沿傳播中心軸飛行所需的動(dòng)能。離子

18、阱 (ion trap)質(zhì)量分析器離子阱質(zhì)量分析器亦稱四極離子阱（quadropoleion trp）或Paul阱，簡(jiǎn)稱離子阱，是一種通過(guò)電場(chǎng)或磁場(chǎng)將氣相離子控制并貯存一段時(shí)間的裝置。這種分析器是由雙曲線表面的中心環(huán)形電極（ ring electrode） 和 上 下 各 一 個(gè) 端 蓋 電 極（endcap electrode）組成，中間形成一個(gè)空腔（阱），因此而成為離子阱。端蓋電極接地，環(huán)形電極施以射頻電壓。離子阱內(nèi)充有一定量的氦氣（約10-3（Torr），這有利于離子朝中心聚集，而離子聚集得越緊湊，離子能量和位置分散越小，有利于提高分辨率和靈敏度。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid c

19、hromatography / massspectrometry，LC-MS）LC-MS把液相色譜技術(shù)強(qiáng)有力的分離能力與質(zhì)譜技術(shù)有效的定性分析能力相結(jié)合，特別適合于復(fù)雜體系的分離分析，目前已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最重要的技術(shù)平臺(tái)之一。LC-MS的開(kāi)發(fā)在技術(shù)上十分困難，直到電噴霧電離（ESI）接口和大氣壓化學(xué)電離（APCI）接口出現(xiàn)，在20世紀(jì)90年代才有了成熟的商品化的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。HPLC*含有緩沖劑的水相/有機(jī)溶劑*非揮發(fā)性分析樣品Interface*脫溶劑*使分析樣品發(fā)生離子化MS*高真空度*按m/z分析產(chǎn)生的離子LC-MS的基本構(gòu)成接口的作用就是將HPLC與MS兩者實(shí)現(xiàn)在線的對(duì)接

20、。它的主要作用是脫去來(lái)自HPLC的大量溶劑，使分析樣品由液相轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嗖l(fā)生離子化。接口性能的好壞在很大程度上決定著色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器性能的優(yōu)劣。好的HPLC條件可能是“壞的”MS條件，二者難以匹配要實(shí)現(xiàn)HPLC與MS的有效的聯(lián)用，必須解決以下困難問(wèn)題：色譜儀與質(zhì)譜儀的壓力匹配問(wèn)題色譜儀與質(zhì)譜儀的流量匹配問(wèn)題氣化問(wèn)題譜圖類型色譜-質(zhì)譜提供的信息MS的譜圖有:1.質(zhì)譜圖2.色譜圖3.全掃描色譜-質(zhì)譜三維譜譜 圖 類 型色譜-質(zhì)譜提供的信息MS的譜圖有:1.質(zhì)譜圖質(zhì)譜圖是一次掃描時(shí)間內(nèi)得到的峰強(qiáng)質(zhì)荷比圖。掃描方式又有連續(xù)掃描和跳變掃描之分。2.色譜圖3.全掃描色譜-質(zhì)譜三維譜色 譜 圖通常有三種類

21、型:1.總離子流色譜圖(TIC)2.質(zhì)量色譜圖(MC)3.選擇離子監(jiān)測(cè)圖(SIM)一個(gè)例子:反相高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法測(cè)定人血漿、尿樣中D,L-異亮氨酸和D,L-別異亮氨酸異構(gòu)體H 2NCOOHCHC H 2CHH 3CC H 3H 2NCOOHCHCHH 2CC H 3C H 3LeucineIsoleucine圖. 17對(duì)氨基酸和甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物的RP-HPLC熒光檢測(cè)色譜圖Fig. Chromatograms of OPTA-AcCys-derivatives of 17 pairs of standard amino acidsand Gly . A:L-Ile, B:L-allo-Ile, C:D-Ile, D:D-allo-IleConditions: mobile phase A, 50 mmol/L NH4AC; mobile phase B: methanol; 0-10 min,mobile phase B 10%; 10-30 min, mobile phase B 10-40% (linear gradient);30-70 min,mobile phase B 40%;