PCR技術(shù)及其應(yīng)用

1、5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 錄錄Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。萬(wàn)倍以上。目目 錄錄Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle =

2、2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Ampliconn模板模板DNAn 特異性引物特異性引物n耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCRPCR體系基本組成成分體系基本組成成分PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCR儀儀PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀電泳儀電泳技術(shù)電泳技術(shù)（）鑒定（）鑒定D

3、NA分子量分子量(3)(3)膠回收純化膠回收純化DNAlow- melt agarose實(shí)驗(yàn)結(jié)果PCR結(jié)果。1、對(duì)照(無(wú)模板)；26、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）巢式巢式PCR PCR 原位原位PCRPCR不對(duì)稱不對(duì)稱PCR PCR 共享引物共享引物PCR PCR 重組重組PCRPCR彩色彩色PCRPCR 增效增效PCRPCR（booster PCRbooster PCR） 當(dāng)當(dāng)擴(kuò)增少于擴(kuò)增少于10001000拷貝的模板拷貝的模板DNADNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問(wèn)題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴(kuò)增，問(wèn)題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴(kuò)增，消耗了引物和酶，而特異擴(kuò)增片段產(chǎn)量降低。對(duì)消耗了引

4、物和酶，而特異擴(kuò)增片段產(chǎn)量降低。對(duì)于這種情況，可設(shè)置二步于這種情況，可設(shè)置二步PCRPCR，先用較低濃度的引，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)物進(jìn)行初級(jí)PCRPCR，此時(shí)由于引物少，形成引物二聚，此時(shí)由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)15152020個(gè)循環(huán)后補(bǔ)個(gè)循環(huán)后補(bǔ)充產(chǎn)物量，以初級(jí)充產(chǎn)物量，以初級(jí)PCRPCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，靶序產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。 原位原位PCR技術(shù)技術(shù)原位PCR Hasse等于等于1990年建立。年建立。

5、 是指在組織細(xì)胞里進(jìn)行是指在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。 原位原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，分子水又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，分子水平和細(xì)胞水平研究并重。平和細(xì)胞水平研究并重。 原位原位PCR的實(shí)驗(yàn)過(guò)程：的實(shí)驗(yàn)過(guò)程： 實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等。其基本方法為多聚甲醛固脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等。其基本方法為多聚甲醛固定組織或細(xì)胞，蛋

6、白酶消化處理組織；在組織細(xì)定組織或細(xì)胞，蛋白酶消化處理組織；在組織細(xì)胞胞玻片玻片上滴加上滴加PCR反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，覆蓋并加液反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，覆蓋并加液體石蠟后，在體石蠟后，在原位原位PCR儀儀上進(jìn)行上進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增，循環(huán)擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)束后用標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，最擴(kuò)增結(jié)束后用標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，最后顯微鏡觀察結(jié)果。后顯微鏡觀察結(jié)果。 16塊載玻片及24個(gè)0.2ml管的樣品block 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA雜化雙鏈雜化雙鏈PCR擴(kuò)增常規(guī)常規(guī)PCR方法的局限性分析：方法的局限性分析： 無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量,只能

7、對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)只能對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分析行分析 必須在擴(kuò)增后用電泳方法分析必須在擴(kuò)增后用電泳方法分析,費(fèi)時(shí)費(fèi)力而費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且且EB有毒有毒 無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR PhasesTraditional PCR detectiony=x 2n非特異性的嵌入熒光染料 （Non-specific DNA binding dyes）SYBR Green ISYBR GoldEthidium Bromide Extension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55Repeat

8、DNA binding dyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理目目 錄錄Ct value and Real-Time Quantitative PCR TheoryPCR擴(kuò)增過(guò)擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物程中，擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)超過(guò)基熒光信號(hào)超過(guò)基線值（進(jìn)入指數(shù)線值（進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期）時(shí)的循增長(zhǎng)期）時(shí)的循環(huán)數(shù)。環(huán)數(shù)。 模板起始濃度越高，Ct值越小 Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系Ct值與模板起始濃度的關(guān)系值與模板起始濃度的關(guān)系 如果模板濃度增加1倍，Ct值就提前1個(gè)循環(huán)到達(dá) 如果模板濃度減少1倍，Ct值就滯后1個(gè)循環(huán)到達(dá)C o p y N u

9、 m b e r v s. Ct - Sta n d a r d C u r v ey = -3 .31 9 2x + 3 9 .77 2R2 = 0 .9 9 6 7051 01 52 02 53 03 54 001234567891 01 1Lo g o f co p y nu m b er (1 0n)Ct絕對(duì)定量可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)?！癛eal-Time PCR” is “sequence detectio

10、n” in a closed-tube cap PCR vesselthermal block samplelens0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.900510152025303540PCR cycle numberBaseline regionThresholdCTNo Template control SampleNormalised reporter fluorescence (Rn)Geometric PhasePCR Efficiency1CT: Threshold cycleThe calculated fractional cycle

11、number at which the fluorescence passes the fixed thresholdPCR技術(shù)應(yīng)用 研究 基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變 () 遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜 診斷遺傳疾病腫瘤感染性疾病，傳染性流行病判斷個(gè)體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定, 犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析PCR技術(shù)的主要用途技術(shù)的主要用途 1、目的基因的克隆目的基因的克隆： PCR技術(shù)為在重組技術(shù)為在重組DNA過(guò)程中獲得目的基過(guò)程中獲得目的基因片段提供了簡(jiǎn)便快速的方法。因片段提供了簡(jiǎn)便快速的方法。 2、基因的體外突變基因的體外突變：可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因

12、片段可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。3、DNA序列測(cè)定：序列測(cè)定：PCR技術(shù)的引入使技術(shù)的引入使DNA測(cè)序工作大大簡(jiǎn)化，測(cè)序工作大大簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度。也提高了測(cè)序的速度。4、基因突變分析：基因突變分析：利用利用PCR與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性?；蛲蛔儥z測(cè)的敏感性。 5、DNA和和RNA的微量分析：的微量分析：PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板的含量技術(shù)高度敏感，對(duì)模板的含量要求很低，是要求很低，是DNA和和NA微量分析的最好方微量分析的最好方法。法。診斷診斷 腫瘤 感染性疾病，傳

13、染性流行病 判斷個(gè)體疾病易感性 器官移植組織配型 法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定, 犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析+Mst酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5 3 正?；蛘；? 3 突變基因突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突變攜帶著突變攜帶著患者患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，