基因工程基本操作過程(目的基因與運載體結合)

1、目的基因與運載體結合基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ碳夹g為基因的結構和功能的研究提供了有力的手段?；蚬こ桃兀喊ㄍ庠碊NA，載體分子，工具酶和受體細胞等1.提取目的基因2.目的基因與運載體結合（基因表達載體的構建）是基因工程的核心。3.將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因的檢測和表達 切、接、轉(zhuǎn)、增、檢 外源DNA片段同載體分子連接的方法，即D

2、NA分子體外重組技術，主要是依賴于限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用. 基因重組基因重組: 就是利用 限制性內(nèi)切酶及其他一些酶類，切割和修飾載體DNA和目的基因?qū)烧哌B接起來，將目的基因插入于可以自我復制的載體內(nèi)，再轉(zhuǎn)入受體細胞，以這種外源性的目的基因在受體細胞內(nèi)得到擴增或正確表達。 依不同的研究目的而定，認真設計最終構建的重組體分子。需要考慮下列2個方面。 如果研究目的是：(1) 表達有價值的蛋白質(zhì)，要考慮選用適當?shù)膯幼?、增強子等調(diào)節(jié)序列和終止序列，要將目的基因置于啟動子的轉(zhuǎn)錄起始點的下游，并審視“閱讀框”是否正確，這些對表達融合蛋白至關重要。 (2) 對某一基因的上游序列進行調(diào)控機能分

3、析，則需考慮選擇適當?shù)膱蟾婊颍⒖赡芫哂姓{(diào)控機能的目的基因置于報告基因的上游適當位置。若調(diào)控基因可能有增強子作用，還應在報告基因下游適當部位插入一個功能基因，由此反映增強子的作用。為了將目的基因重組于載體分子之中，需要將載體DNA和目的基因分別進行適當處理，使其可以互相連接，形成新的重組分子。載體DNA通常有著許多酶切位點但是并不是所有的酶切位點都可用于重組切割，理想的酶切位點應該符合下列幾個條件: 1）位于載體上特定的酶切位點要盡可能少,最好是單一酶切位點,這樣才能保證目的基因和載體DNA以最高的幾率正確組合. 2） 在酶切位點之前要有一個較強的啟動子，使插入的目的基因可在該啟動子的指導

4、下高效表達。3）選擇的載體必須在連接后對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中的編碼區(qū)讀框不改變。當載體和外源DNA用同樣的限制性內(nèi)切酶切割時，所形成的DNA末端就能夠彼此相匹配，可以被T4連接酶共價地連接起來，形成重組體分子。 但是,當靶片段的末端與載體不匹配時，必須轉(zhuǎn)換其中一個或兩個片段的末端形式以便使之連接。這種末端的轉(zhuǎn)換通常用以下三種方式轉(zhuǎn)換： 3凹端補平：使用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段部分補平3凹端，將不匹配的3凹端轉(zhuǎn)換為粘端；或者完全補平，產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA相連接。 3突端切除：T4噬菌體DNA聚合酶具有強烈的3- 5外切核酸酶活性，可將3突端切除。 平端加上人

5、工合成接頭：合成接頭是自相互補的兩個化學合成的寡核苷酸的等摩爾混合物，而兩個寡聚體可形成帶一個或多個限制性酶切位點的平端雙鏈體。因此在平端DNA加接頭可為其亞克隆操作增加一個或多個限制性酶切位點。載體DNA和目的基因DNA的連接,按DNA片段末端性質(zhì)不同，可有下述不同的連接方法： 粘性末端連接法 平端連接法 同聚物加尾連接法 人工接頭連接法1. 同一限制酶切位點連接: 由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割產(chǎn)生單鏈突出的粘性末端和酶切位點附近的DNA序列不影響連接 .在連接酶的作用下即可形成重組DNA分子. 上述方法的缺點：由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DN

6、A分子，在連接反應中常發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價閉合環(huán)狀結構。 解決方法：用細菌的堿性磷酸酶預先處理線性的載體DNA分子，去除其5末端的磷酸基。 2.不同限制酶切位點連接: 由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA片段、具有相同類型的粘性末端，彼此稱為互補末端也可以采用粘性末端連接。外源DNA和載體DNA經(jīng)過兩個限制性內(nèi)切酶切割后一側(cè)產(chǎn)生的黏性末端，另一側(cè)產(chǎn)生平未端（可先生成黏性末端再補平）。雙酶切片段的定向克隆的優(yōu)點雙酶切片段的定向克隆的優(yōu)點外源DNA只能以一個方向定向插入到重組質(zhì)粒中，以便目的基因的正確轉(zhuǎn)錄和表達。載體與外源DNA結合處的限制酶切位點仍然保留，可

7、以隨時從重組載體中通過相應的限制性內(nèi)切酶切割后分離獲得目的基因。不會自身環(huán)化，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化后的細菌克隆大多數(shù)攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒。 一些內(nèi)切酶如Hae和Hpa切割產(chǎn)生DNA的片段沒有粘性末端，而是平末端。 具有平末端的酶切載體只能與平末端的目的基因連接。 T4DNA連接酶可催化相同或不相同的限制性內(nèi)切酶切割的平端間的連接。 平端連接比粘性末端連接要困難的多，其連接效率很低，約有粘性末端連接的1%。 適用于限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 適用于粘端補齊或切平形成的平端 提高平頭末端連接效率的方法包括：提高平頭末端連接效率的方法包括： 加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的

8、濃度，增加分子間碰撞機會；加入10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用；加入單價陽離子（NaCl）。 當載體和外源DNA片段兩端的酶切位點之間，不可能 找到恰當?shù)钠ヅ鋾r，解決方法： 人工接頭連接法：通過依次加入、連接合成DNA接 頭，再用限制酶切加以解決。 同聚物加尾連接法：可以利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在 載體酶切位點處和外源DNA片段的3端加上相互補 的同聚尾加以解決。 PCR法：通過PCR(聚合酶鏈反應)技術擴增外源DNA 片段，從而加上合適的限制性內(nèi)切酶的單一識別序 列，再用限制酶切加以解決。同聚物加尾連接：利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末

9、端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸。dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA連接酶的作用下, 連接成為重組的DNA。這種方法可適用于任何來源的DNA片段。但方法較繁，需要核酸外切酶、S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用 。同聚物接尾法實際上是一種人工粘性末端連接法。優(yōu)點：通過DNA加尾，既可以使兩個具平末端的DNA片段進行連接，也可以使具平末端的DNA片段與粘性末端的DNA片段進行連接。 缺點：只對質(zhì)粒載體有效；質(zhì)粒和cDNA上的同聚物長度難以控制相等，影響克隆效率；用其轉(zhuǎn)化宿主菌的效率依不同菌株而有較大差異。人工接頭（DNA寡核苷酸連桿）是人工合成的具有一個或數(shù)個特定 限制

10、性內(nèi)切酶識別和切割序列的雙股平端DNA 短序列。 由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn) 生粘性末端，而進行粘端連接。優(yōu)點：是進行DNA重組的一種既有效又實用的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端連接法的優(yōu)點，而且它可以根據(jù)實驗的不同要求，設計出具有不同限制酶位點的人工接頭。若在體外連接反應中增加人工接頭的濃度，還會大大提高平末端DNA片段間的連接效率。 缺點：如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的人工接頭相同的限制酶切位點，這樣在酶切消化人工接頭產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把克隆的外源基因切成不同的片段，從而為后繼的操作造成麻煩。 自從 1973 年 Jackson 等人在一次分子生

11、物學學會上首次提出基因可以人工重組，并能在細菌中復制。從此以后，基因工程成為一項新興的研究領域得到了迅速的發(fā)展，無論是基礎研究，還是應用研究均取得了喜人的成果。這是生命科學發(fā)展的一次飛躍，生命科學已經(jīng)進入了一個定向、快速改造生物性狀的新時代，受到了國內(nèi)外廣泛的重視。開展基因工程研究幾十年來，建立了多種分別適用于微生物、動植物轉(zhuǎn)基因的載體受體系統(tǒng)，克隆出了一批有用的目的基因，研制出了數(shù)十種昂貴的基因工程藥物，培育出了一批具有特殊性狀的轉(zhuǎn)基因動植物?；蚬こ淘?0世紀取得了很大的進展，至少有兩個有力的證明。一是轉(zhuǎn)基因動植物，一是克隆技術。 轉(zhuǎn)基因動植物由于植入了新的基因，使得動植物具有了原先沒有的全新的性狀，這引起了一場農(nóng)業(yè)革命。如今，轉(zhuǎn)基因技術已經(jīng)開始廣泛應用，如抗蟲西紅柿、生長迅速的鯽魚等。 1997年世界十大科技突破之首是克隆羊的誕生。這只叫“多利”母綿羊是第一只通過無性繁殖產(chǎn)生的哺乳動物，它完全秉承了給予它細胞核的那只母羊的遺傳基因?！翱寺　币粫r間成為人們注目的焦點。盡管有著倫理和社會方面的憂慮，但生物技術的巨大進步使人類對未來的想象有了更廣闊的空間。 當今，國際上一項合作性的基因組測序計劃的完成。隨著功能性基因不斷被開發(fā)出，分離及轉(zhuǎn)基因