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1、第一章 緒論1、細(xì)胞工程的概念,廣義的細(xì)胞工程,狹義的細(xì)胞工程,n 細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法,通過(guò)類似于工程學(xué)的步驟,在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上,按照人們的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)以獲得新型生物或一定細(xì)胞產(chǎn)品的一門(mén)綜合性科學(xué)技術(shù)。 n 廣義的細(xì)胞工程包括所有的生物組織、器官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù),狹義的細(xì)胞工程則是指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。2、細(xì)胞工程的研究?jī)?nèi)容(研究生物類型,實(shí)驗(yàn)操作對(duì)象)n 根據(jù)研究生物類型不同,細(xì)胞工程可分為動(dòng)物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程、微生物細(xì)胞工程。n 動(dòng)物細(xì)胞工程包括:細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng));細(xì)胞融合技術(shù);胚胎工程技術(shù) (核移
2、植、胚胎分割等);克隆技術(shù)(單細(xì)胞系克隆、器官克隆、個(gè)體克隆)。n 植物細(xì)胞工程包括:植物組織、器官培養(yǎng)技術(shù);細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù);原生質(zhì)體融合與培養(yǎng)技術(shù);亞細(xì)胞水平的操作技術(shù)等。3、細(xì)胞工程的重要應(yīng)用(植物、動(dòng)物)n 植物細(xì)胞工程的應(yīng)用:脫毒和快速繁殖細(xì)胞工程育種:利用培養(yǎng)變異,篩選優(yōu)良 突變體利用遠(yuǎn)緣雜交幼胚培養(yǎng),獲得雜種植株,克服其雜交不親和性利用細(xì)胞融合技術(shù),克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性倍性育種離體種質(zhì)保存細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)n 動(dòng)物細(xì)胞工程的應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品(單克隆抗體)新品種培育試管動(dòng)物與嬰兒組織工程珍稀動(dòng)物資源的保存與保護(hù)第二章 細(xì)胞工程基礎(chǔ)1、細(xì)胞分化:個(gè)體細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中, 后代細(xì)
3、胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生差異的過(guò)程。2、發(fā)育潛能:指細(xì)胞分化能力的強(qiáng)弱。 3、細(xì)胞全能性:指細(xì)胞具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能。 4、細(xì)胞多能性:指隨著胚胎發(fā)育,有的體細(xì)胞失去全能性,具有分化出多種組織的潛能。5、去分化:又稱脫分化,指某些條件下分化細(xì)胞不穩(wěn)定,又回到未分化狀態(tài)的這一過(guò)程6、愈傷組織:脫分化后的細(xì)胞,經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂,產(chǎn)生無(wú)組織結(jié)構(gòu)、無(wú)明顯極性的、松散的細(xì)胞團(tuán)稱為愈傷組織。愈傷組織的種類胚性愈傷組織 (Embryonenic callus):表面光滑、組織結(jié)構(gòu)緊湊、細(xì)胞小、再生力強(qiáng)。 胚性愈傷組織容易形成胚狀體,所以被稱為胚性愈傷組織。非胚性愈傷組織:表面粗糙、組織結(jié)構(gòu)疏松、細(xì)胞大
4、。 第三章 細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)基本操作(教材第二章)1、什么是滅菌?是么是消毒?(P18)滅菌是指殺滅或者去除物體表面和孔隙內(nèi)的所有微生物,包括抵抗力極強(qiáng)的細(xì)菌芽胞。消毒是指殺死物體上的病原微生物,但細(xì)菌芽胞和非病原微生物可能還存活。2、常用的滅菌和消毒方法有哪些?物理法(一)紫外線直接照射、表面滅菌、可消毒空氣和培養(yǎng)用具(如塑料器皿),消毒的效力和距離有密切關(guān)系,故無(wú)菌室天花板一般不宜太高。一般石菌室內(nèi)空氣、桌椅以及培養(yǎng)用具在紫外線有效消毒距離內(nèi),照射30分鐘,可達(dá)到滅菌效果。紫外線照射使用方便、消毒效果好;缺點(diǎn)是能產(chǎn)生臭氧,污染空氣,且對(duì)未直接照射的部分無(wú)消毒效果。(二)干熱消毒主要用于
5、消毒玻璃器四周,干熱、消毒的器皿干燥,易貯存。但干熱傳導(dǎo)慢,需加溫到160,保持90120分鐘,才能殺死芽孢,達(dá)到消毒目的。消毒后不要立即打開(kāi)箱門(mén),防止冷空氣忽然進(jìn)入影響消毒效果和損壞玻璃器皿。金屬器械和橡膠制品不能用于干熱消毒等。(三)濕熱消毒即高壓蒸氣消毒,是最有效的一種方法。布類、膠塞、金屬器械、玻璃器皿以及某種液體都可以用這種方法。(四)濾過(guò)消毒不能高溫高壓滅菌的液體可以用此法,如動(dòng)物組織的人工合成培養(yǎng)液、小牛血清、胰蛋白酶系。須選一定規(guī)格的濾器,液體濾過(guò)速度,且保證除菌效果的關(guān)鍵。一般以肉眼可見(jiàn)液滴滴下為 。濾過(guò)后及時(shí)分裝。(五)煮沸消毒急需要時(shí)的常規(guī)方法,金屬器械、膠塞在水中煮沸2
6、030分鐘,趁熱倒去水分即可使用?;瘜W(xué)法(一)消毒劑滅菌來(lái)蘇爾、新潔爾滅(1%)、7075%酒精、安替福氏、貝氯酸鈣、乳酸蒸氣、環(huán)氧乙烷。(二)抗菌素滅菌:(三) 熏蒸滅菌3、什么是平衡鹽溶液(BSS)?平衡鹽溶液(Balanced Salt Solution;BSS)又稱生理鹽水或鹽溶液。具有維持滲透壓,控制酸堿度的平衡作用,同時(shí)也能供給細(xì)胞中生存所需的能量和無(wú)機(jī)鹽離子,用作沖洗組織和細(xì)胞,配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液,也可用于短暫培養(yǎng)。成分:水,無(wú)機(jī)鹽,葡萄糖組成。4、什么是生物安全實(shí)驗(yàn)室?目前,生物安全實(shí)驗(yàn)室的種類有哪些,各有什么特點(diǎn)。5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的天然培養(yǎng)基有哪些?天然培養(yǎng)基1血漿最
7、常用的是雞血漿,它具有一定的營(yíng)養(yǎng),與少量雞胚浸出液混合后,有良好的凝固作用,利于支持細(xì)胞的生長(zhǎng)。缺點(diǎn)易液化,一般常用作各種細(xì)胞生長(zhǎng)的基質(zhì)。2鼠尾膠原對(duì)維持細(xì)胞生長(zhǎng)有良好作用。由于雞血漿存在一定缺點(diǎn),人們?cè)囉昧撕芏嗷幤?,其中鼠尾膠原較好。它能促進(jìn)組織和細(xì)胞的附著,改善生長(zhǎng)表面藥性。來(lái)源:燃尾鍵,豚鼠真皮,牛的真皮和牛眼的水晶體,實(shí)驗(yàn)室常用大鼠尾制膠原。3胚胎浸出液主要成分是大分子核蛋白和小分子氨基酸,有刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。在動(dòng)物、細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用最早,但由它而作了變到使用合成培養(yǎng)液,并漸漸被合成培養(yǎng)液所代替,但在研究中仍有應(yīng)用價(jià)值。常用的有雞胚和牛胚。4血清是動(dòng)物用量最大的天然培養(yǎng)基。血清含有
8、豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),包括大分子的蛋白質(zhì)和核酸。動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖需要血清。實(shí)驗(yàn)證明血清對(duì)細(xì)胞附著和保護(hù)尚有明顯作用,且能中和有毒物質(zhì)的毒性,使細(xì)胞不受傷害。血清種類很多,其中有小牛血清、胎牛血清、馬血清、人胚胎血清等,胎牛血清比較理想,但不易得到。目前各實(shí)驗(yàn)室多采用小牛血清。目前已有出售小牛商品血清。人血清一般都采用AB型血清,但價(jià)格昂貴,很少用。5血清代用品血清的來(lái)源比較困難,而且成分復(fù)雜,人們努力尋找其替代品,其中有聚乙烯、吡咯咆酮(P、V、P)、蛋白胨、水解乳蛋白等,但都不如血清,因而沒(méi)廣泛使用。第四章 植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)(教材第四、七、八章)1、離體無(wú)性繁殖(propagation i
9、n vitro) :利用離體培養(yǎng)技術(shù),將來(lái)自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng),在短期內(nèi)獲得大量遺傳形狀一致的個(gè)體的方法。也稱之為微繁(micropropagation)、快速繁殖(rapid clone progagation)。2、繁殖系數(shù)(breeding coefficient):也叫增殖率,指每塊外植體在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)增殖的倍數(shù).3、簡(jiǎn)述離體無(wú)性繁殖的程序 。(1)無(wú)菌培養(yǎng)物制備,包括:外植體的選擇外植體滅菌接種培養(yǎng)等基本過(guò)程。(2)培養(yǎng)物的增殖腋芽增殖:培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單,能高度保持遺傳穩(wěn)定性,能長(zhǎng)期繼代繁殖不定芽增殖:繁殖系數(shù)高,非洲紫羅蘭用常規(guī)葉插法,每片
10、葉只能產(chǎn)生幾個(gè)或十幾個(gè)芽,但在組培條件下可一次形成幾十至幾百個(gè)芽,一年可以培養(yǎng)成千上萬(wàn)個(gè)小植株。遺傳穩(wěn)定性較好。但繼代次數(shù)有限。培養(yǎng)物繼代一定次數(shù)以后,不定芽形成能力即減弱,需要重新建立起始無(wú)菌培養(yǎng)物。此外,不定芽需要進(jìn)行生根培養(yǎng)才能形成真正的植株。 誘導(dǎo)不定芽一般需要同時(shí)加入外源生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素,二者的配比一般是細(xì)胞分裂素要略高于生長(zhǎng)素,其二者的總體使用濃度應(yīng)盡可能的低,以免產(chǎn)生過(guò)多的愈傷組織。以保證繁殖品種的遺傳穩(wěn)定性。胚狀體增殖: 增長(zhǎng)率高,雙極性免去生根環(huán)節(jié),但胚狀體休眠的誘導(dǎo)和解除還難以把握,其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外(人工種子),這一途徑還沒(méi)有用于快繁技術(shù)。愈傷組織增殖
11、 :所有的植物通過(guò)組織培養(yǎng)的方法均可以誘導(dǎo)愈傷組織,再進(jìn)一步分化即可獲得小植株。這一途徑經(jīng)歷了組織培養(yǎng)技術(shù)的所有過(guò)程(愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織增殖芽分化生根完整植株),它屬于真正意義上的組織培養(yǎng)。一切通過(guò)其它增殖方式不能成功的植物,均可以通過(guò)此途徑獲得組培苗。其特點(diǎn)是成功率高,繁殖系數(shù)大,但遺傳穩(wěn)定性較差。對(duì)品種要求遺傳穩(wěn)定性高的作物一般不采用這一途徑快繁原球莖增殖 :細(xì)胞或組織培養(yǎng)經(jīng)原球莖途徑分化成植株。大部分蘭花屬于這一類型,即蘭花的各個(gè)部分的離體組織都能誘導(dǎo)形成原球莖,再經(jīng)培養(yǎng)分化形成植株。原球莖是蘭花種子萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生的呈珠粒狀、縮短的、類似嫩莖的器官。 (3)生根培養(yǎng):一種是在固體培養(yǎng)基上誘
12、導(dǎo)生根。當(dāng)試管苗長(zhǎng)到23厘米高時(shí),將它從基部切下,轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上生根(生根培養(yǎng)基一般要求降低礦物營(yíng)養(yǎng)的濃度,提高生長(zhǎng)素的濃度,具體應(yīng)根據(jù)植物不同而定) 另一種是浸泡的方法,將切下的無(wú)根試管苗泡在含有高濃度生長(zhǎng)素溶液中,生長(zhǎng)素濃度為100毫克/升左右,浸泡時(shí)間從幾小時(shí)到1天,然后取出接種于不加任何激素的MS培養(yǎng)基上或者扦插在人工基質(zhì)上,十天左右即可生根。(4)煉苗和移栽:將瓶蓋打開(kāi),打破無(wú)菌環(huán)境,濕度逐漸下降,光照逐漸加強(qiáng),使之形成新的功能強(qiáng)的根和葉片。一般煉苗時(shí)間為23d。移栽時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題 :a、防止菌類滋生 ;b、保持小苗水分供給平衡(5)再生植株的鑒定4、簡(jiǎn)述當(dāng)前脫除植物病毒的方法及
13、原理。莖尖培養(yǎng)脫毒法;熱處理脫毒法;微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法;珠心組織培養(yǎng)法;愈傷組織脫毒莖尖脫毒:依據(jù):病毒在植物體內(nèi)分布是不均一的,越接近生長(zhǎng)點(diǎn)約(0.1-1mm區(qū)域),病毒濃度越稀,因此有可能采用小的莖尖離體培養(yǎng)而脫除植物病毒。熱處理脫毒法:熱處理不能殺死病毒。只能鈍化病毒的活性,使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止,而失去浸染能力。熱處理是一種物理效應(yīng),可以加速植物細(xì)胞的分裂,使植物細(xì)胞在與病毒繁殖的競(jìng)爭(zhēng)中取勝。微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法:同莖尖脫毒。珠心組織培養(yǎng)法:一般認(rèn)為病毒是通過(guò)維管組織傳播的,珠心組織與維管系統(tǒng)沒(méi)有直接聯(lián)系,因此珠心組織培養(yǎng)可獲得無(wú)病毒植株。愈傷組織脫毒:病毒在植物體內(nèi)
14、不同器官或同一器官不同組織中分布不均勻,由那些無(wú)病毒細(xì)胞產(chǎn)生的愈傷組織就是獲得無(wú)病毒苗的基礎(chǔ)。5、簡(jiǎn)述脫毒效果如何檢測(cè)A 指示植物鑒定(indicator test plants) 所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的?;园Y狀的寄主植物。每種病毒都有自己敏感的植物,指示植物鑒定病毒的方法:a.摩擦接種法:通過(guò)汁液傳播的病毒,b、嫁接法:通過(guò)專門(mén)的介體傳播的病毒,B 血清鑒定(serologic test) 試管沉淀反應(yīng);免疫雙擴(kuò)散;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。C 電鏡檢查法 采用電子顯微鏡,可直接觀察樣品材料有無(wú)病毒存在,還可以進(jìn)一步鑒定病毒顆粒大小、形狀和結(jié)構(gòu),這些特征相當(dāng)穩(wěn)定,因此
15、電鏡檢查法即準(zhǔn)確又有效,但需要有一定的設(shè)備和技術(shù)。D 分子檢測(cè)法 例如RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reation)將待測(cè)的樣品的總RNA與cDNA合成的試劑盒進(jìn)行反應(yīng),合成cDNA,然后利用病毒DNA特有的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng),即可知道在寄主中是否有病毒基因的表達(dá)6、脫毒苗的保存與繁殖。n 脫毒苗的離體保存與繁殖:一般是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,一般每月繼代一次,可以在培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)延緩劑,如B9和矮壯劑可2-3個(gè)月繼代一次,也可放到液氮或4冰箱中保存 。 n 建立脫毒種苗生產(chǎn)繁殖網(wǎng)絡(luò)體系:如果試管苗生產(chǎn)成本過(guò)高或移栽困難,可將試管苗
16、選擇種植在一定的控制區(qū)域,從繁殖技術(shù)和環(huán)境隔離上保證較高水平,使得繁殖的種苗能有效的防止病毒的再侵染。 7、什么是花藥培養(yǎng)?什么是花粉培養(yǎng)?8、花藥培養(yǎng)的基本程序是: 外植體選擇外植體(花蕾)預(yù)處理外植體消毒剝?nèi)』ㄋ幗臃N誘導(dǎo)培養(yǎng)分化培養(yǎng)-移栽 9、花藥培養(yǎng)中如何選擇外植體?n 基因型的選擇 通過(guò)花藥培養(yǎng)成功獲得單倍體植株最多的是茄科植物,其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。同一植物的不同類型、不同品種對(duì)花藥培養(yǎng)的反應(yīng)也是不同的。因此在進(jìn)行花藥和花粉培養(yǎng)時(shí),應(yīng)選擇那些容易培養(yǎng)成功的材料來(lái)做。 n 供試材料的生理狀態(tài) 在多年生植物中,幼年植株比老齡植株的花藥誘導(dǎo)頻率高。草本植物生長(zhǎng)健壯、且處于生
17、殖生長(zhǎng)高峰期的花藥誘導(dǎo)頻率高,徒長(zhǎng)或營(yíng)養(yǎng)不足的植株花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)頻率低。 n 花粉的發(fā)育時(shí)期 :最適期:?jiǎn)魏嘶ǚ?雙核花粉 涉及到具體的植物,花藥培養(yǎng)的取材時(shí)期并不絕對(duì)相同,如番茄以減數(shù)分裂期的幼嫩花藥為好,而云苔屬植物的某些材料則以花粉成熟時(shí)的花藥為好。10.花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)的區(qū)別?11、影響花藥培養(yǎng)的因素有哪些?基因型發(fā)育時(shí)期植株的生理狀態(tài)預(yù)處理培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件花藥的接種密度(密度效應(yīng))培養(yǎng)的方法與方式:固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)(Ficoll)、雙層培養(yǎng)、分步培養(yǎng)、條件培養(yǎng)12單倍體植株的染色體加倍方法(P155)方法:用的多的為化學(xué)誘變法,常用的誘變劑有秋水仙素、富民農(nóng)、對(duì)二氯苯、8-羥基喹
18、啉等,其中加倍效果最好的為秋水仙素。秋水仙素:地中海一帶生長(zhǎng)的一種百合科植物秋水仙,秋水仙素是由秋水仙的種子和球莖提取出來(lái)的物質(zhì),分子式為C22H25NO8。秋水仙素的特性:能溶于水、酒精、三氯甲烷,可以阻止細(xì)胞有絲分裂時(shí)紡錘絲的形成。a小苗浸泡法:將再生小植株從試管中取出,在無(wú)菌條件下用秋水仙素直接浸泡,然后再至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。煙草:濃度0.2%0.4%,時(shí)間2448hr,加倍率35%大麥:濃度0.01%0.05%,時(shí)間15d,加倍率40%60%b生長(zhǎng)錐處理:將適宜濃度的秋水仙素,調(diào)和在栽體羊毛脂中,然后將羊毛脂涂抹在單倍體植物的頂端分生組織和次生分生組織上,誘導(dǎo)分生組織細(xì)胞染色體加倍;也
19、可將秋水仙素配成水溶液,用蘸滿溶液的棉球置于頂芽和腋芽上誘導(dǎo)生分組織細(xì)胞染色體加倍。兩種方法均需加蓋塑料布以防止蒸發(fā)。煙草:濃度0.2%0.4%(羊毛脂),時(shí)間2448hr,加倍率25%茄子:濃度0.2%0.4%(水溶液),時(shí)間4042hr,每隔4hr滴加一滴水,加倍率為87.5%c培養(yǎng)基加倍:將單倍體植株的任何一部分做為外植體,使其在附加一定濃度的秋水仙素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成株,在植株再生過(guò)程中加倍。第五章 人工種子(教材第三章)什么是人工種子狹義的概念是指植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體(包括體細(xì)胞胚和性細(xì)胞胚),包裹在含有養(yǎng)分和具有保護(hù)功能的物質(zhì)中,并在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗的顆粒體。 廣義 而言
20、,人工種子是在胚狀體或一塊組織(頂芽、腋芽)、一個(gè)器官(小鱗莖等)之外加上必要的營(yíng)養(yǎng)成分(人工胚乳)后,用具有一定通透性而無(wú)毒的材料將其包裹起來(lái),形成的與天然種子相似的顆粒體 人工種子的結(jié)構(gòu)人工種子分類根據(jù)Redenbaugh對(duì)人工種子的分類方法,可將人工種子分為三大類: n 裸露的或休眠的繁殖體 如微鱗莖,微塊莖等。它們?cè)诓患影坏那闆r下也具有較高的成株率。 n 人工種皮包被的繁殖體 一些體細(xì)胞胚、原球莖等不能過(guò)度干燥,但只需要用人工種皮包被即可維持良好的發(fā)芽狀態(tài),如胡蘿卜體細(xì)胞胚。 n 水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體 大多數(shù)體細(xì)胞胚、不定芽、莖尖等均需要先包埋在半液態(tài)凝膠中,再經(jīng)人工種皮
21、包裹才能避免失水,從而維持良好的發(fā)芽能力。 第六章 細(xì)胞培養(yǎng)(教材第五章)1、分離植物細(xì)胞的方法有哪些?a) 由完整的植物器官分離單細(xì)胞:葉片是分離單細(xì)胞的最好材料。有機(jī)械法和酶解法。只有薄壁組織排列松散,細(xì)胞間結(jié)觸點(diǎn)很少時(shí)用機(jī)械法分離葉肉細(xì)胞才能取得成功b) 由培養(yǎng)組織分離單細(xì)胞:誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織; 愈傷組織反復(fù)繼代,使組織不斷增殖,提高愈傷組織的松散性;將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),建立懸浮培養(yǎng)物2、植物單細(xì)胞培養(yǎng)的方法有哪些?c) 細(xì)胞平板培養(yǎng)d) 看護(hù)培養(yǎng)e) 微室培養(yǎng)f) 其它單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)A飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術(shù)B雙層濾紙植板培養(yǎng)方法3、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中,如何計(jì)量細(xì)胞的生長(zhǎng)量?A、細(xì)胞記數(shù)
22、B、細(xì)胞大小的測(cè)定技術(shù)(用顯微測(cè)微計(jì))C、細(xì)胞體積:D、細(xì)胞的干重和鮮重。E、有絲分裂指數(shù)4、一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的特征。 n 懸浮培養(yǎng)物分散性良好,細(xì)胞團(tuán)較小,一般在3050個(gè)細(xì)胞以下,在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。 n 均一性好,細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒,培養(yǎng)基清澈透亮,細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。 n 細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般23天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。 5、影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素。 n 起始愈傷組織的質(zhì)量:松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色,呈細(xì)小顆粒狀,疏松易碎。 n 接種細(xì)
23、胞密度:接種初期的細(xì)胞密度過(guò)低往往使延遲期加長(zhǎng),懸浮細(xì)胞的起始密度一般在0.52.5×105個(gè)細(xì)胞/毫升,低于這一密度則會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)延遲。 n 培養(yǎng)條件:方式、溫度、繼代周期 6懸浮培養(yǎng)細(xì)胞同步化方法。n 物理方法1)分選法通過(guò)細(xì)胞體積大小分級(jí),直接將處于相同周期的細(xì)胞進(jìn)行分選,然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中。2)冷處理法。低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度n 化學(xué)方法1)饑餓法懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中,若斷絕供應(yīng)一種細(xì)胞分裂所必需的營(yíng)養(yǎng)成分或激素,使細(xì)胞停滯在G1或G2期,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的饑餓之后,當(dāng)在培養(yǎng)基中重新加入這種限制因子時(shí),靜止細(xì)胞就會(huì)同步進(jìn)入分裂。2)抑制劑法
24、通過(guò)一些DNA 合成抑制劑處理細(xì)胞,使細(xì)胞停留在DNA 合成前期,當(dāng)解除抑制后,即可獲得處于同一細(xì)胞周期的細(xì)胞。常用的抑制劑有5-氟脫氧尿苷,5-氨基尿嘧啶、羥基尿等。3)有絲分裂阻抑用秋水仙素處理指數(shù)生長(zhǎng)的懸浮培養(yǎng)物,濃度一般控制在0.2%,處理時(shí)間以4-6小時(shí)為宜7、懸浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)中其群體生長(zhǎng)規(guī)律細(xì)胞生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn):滯后期(延遲期):細(xì)胞很少分裂,其長(zhǎng)短與接種量, 大小和繼代時(shí)原種細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期有關(guān)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期:細(xì)胞分裂活躍,細(xì)胞數(shù)目增加,增長(zhǎng)速率保持不變直線生長(zhǎng)期:細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育最明顯的時(shí)期緩慢期:生長(zhǎng)逐漸緩慢,培養(yǎng)液消耗將盡,有毒代謝物質(zhì)增多,氧氣減少靜止期:生長(zhǎng)幾乎處于停止
25、狀態(tài),細(xì)胞數(shù)目增加極少,甚至開(kāi)始死亡。8、植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)n 細(xì)胞系的建立和選擇 懸浮細(xì)胞系 單細(xì)胞養(yǎng)與篩選 種細(xì)胞增殖n 優(yōu)良細(xì)胞系的增殖培養(yǎng) 所選擇的優(yōu)良細(xì)胞系,進(jìn)行大規(guī)模繁殖,得到足夠的細(xì)胞是建立細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)體系的中間環(huán)節(jié)。 n 大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立 一步法逐級(jí)放大:對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)與目的產(chǎn)物合成同步的類型,一般采用此方法建立大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)。 兩步法:用于目的產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育到一定時(shí)期進(jìn)行,細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基的類型。先在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合成產(chǎn)物的階段后,再將其轉(zhuǎn)入到產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 如果采用固相培養(yǎng)方式生產(chǎn)次生產(chǎn)物
26、,一般均需采用兩步法建立體系。 9、在植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)中如何提高植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量?(P102)答:明確植物細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的關(guān)系 選擇適宜的起始材料選擇合適的培養(yǎng)基成分加入次生代謝產(chǎn)物合成的前體物質(zhì)激發(fā)子的應(yīng)用培養(yǎng)技術(shù)的選擇:固定化培養(yǎng)是植物細(xì)胞規(guī)模化生產(chǎn)較為理想的系統(tǒng)第七章 細(xì)胞融合(教材第六、十三章)1、細(xì)胞融合又稱體細(xì)胞雜交, 是指將不同來(lái)源的原生質(zhì)體相融合并使之分化再生,形成新物種或新品種的技術(shù)。 2、誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法 有三大類:生物法(病毒法)仙臺(tái)病毒、新城雞瘟病毒、流感病毒及皰疹病毒。 原理:病毒或其組分在細(xì)胞間起粘連作用使細(xì)胞聚集成團(tuán),致使不同細(xì)胞的膜蛋白及膜脂質(zhì)分
27、子重新排布而結(jié)合成一個(gè)整體,從而完成細(xì)胞融合過(guò)程?;瘜W(xué)法n PEG誘導(dǎo)融合法:這種方法是一項(xiàng)培養(yǎng)大批體細(xì)胞雜種植株的卓有成效的技術(shù),也是應(yīng)用最早的化學(xué)融合方法。PEG具有強(qiáng)烈吸水性及凝集和沉淀蛋白質(zhì)作用,對(duì)植物及微生物原生質(zhì)體和動(dòng)物細(xì)胞的融合均有促進(jìn)作用。當(dāng)不同種屬的細(xì)胞混合液中存在PEG時(shí),即產(chǎn)生細(xì)胞凝集作用,在稀釋和除去PEG過(guò)程中即產(chǎn)生融合現(xiàn)象。n 高Ca2+和高pH值誘導(dǎo)n 高鈣、高pH值及PEG結(jié)合誘導(dǎo)法n 離子誘導(dǎo)融合法n 瓊脂糖融合法物理法n 電融合誘導(dǎo)法:交流電場(chǎng)使原生質(zhì)體表面電荷偶極化,沿著電極排列,形成串珠;施加直流電場(chǎng)后,形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔,開(kāi)始遺傳物
28、質(zhì)的交流。n 磁-電融合法n 超聲-電融合法n 電-機(jī)械融合法3、體細(xì)胞雜種的篩選方法遺傳互補(bǔ)篩選法:利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因,糾正另一親本的缺陷,令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。 抗性互補(bǔ)篩選法:利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對(duì)抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞利用物理特性篩選法:根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細(xì)胞利用生長(zhǎng)特性篩選法:利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞第八章 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)(教材第十二、十四克隆技術(shù)、十五章干細(xì)胞) 1、相關(guān)概念原代培養(yǎng):亦稱初代培養(yǎng),指將機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行實(shí)效培養(yǎng)的過(guò)程。原代細(xì)
29、胞:指實(shí)效培養(yǎng)的細(xì)胞大約增殖10代左右,稱為原代細(xì)胞傳代培養(yǎng):亦稱繼代培養(yǎng),從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱繼代培養(yǎng)。 細(xì)胞系:指由初代培養(yǎng)產(chǎn)生的能進(jìn)行無(wú)限次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞群組織工程:是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理,將人體某部分組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)繁殖、擴(kuò)增,然后移植到人體內(nèi)所需要的部位,從而達(dá)到器官修復(fù)的或再造的治療目的的一種技術(shù)干細(xì)胞:是一類具有自我復(fù)制和分化潛能的細(xì)胞。即是一群尚未完全分化的細(xì)胞,同時(shí)具有分裂增殖成與本身完全相同的細(xì)胞,或分化成為多種特定功能的體細(xì)胞兩種特性??寺。罕疽馐侵高z傳上完全相同的分子、細(xì)胞或來(lái)自同一祖先的生物個(gè)體的無(wú)性繁殖群體?,F(xiàn)指一
30、種實(shí)現(xiàn)無(wú)性繁殖方式產(chǎn)生克隆群體的操作過(guò)程或手段。 2、動(dòng)物細(xì)胞之間主要連接形式 1)緊密連接 2)間隙連接 3)橋粒連接 4)隔壁連接 5)中間連接3、在體外按照培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不同,主要可分為以下幾類: 1)成纖維細(xì)胞型細(xì)胞 2)上皮型細(xì)胞 3)游走型細(xì)胞 4)多行型細(xì)胞4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法 1)懸滴培養(yǎng)法 2)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 3) 灌注小室培養(yǎng)法 4)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 5)培養(yǎng)板培養(yǎng)法5、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 1)懸浮培養(yǎng)技術(shù) 2)微載體培養(yǎng)技術(shù) 3)多孔載體培養(yǎng) 4)微囊化培養(yǎng)技術(shù) 5)中空纖維法 6、簡(jiǎn)述組織工程的三要素。細(xì)胞、支架、信號(hào)A、細(xì)胞必須能不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂,且必須能被調(diào)控
31、分化成特定的組織細(xì)胞。干細(xì)胞:胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞;組織來(lái)源細(xì)胞:自體或異體。B、組織生長(zhǎng)支架需求:(1)、生物親和性(2)、生物可降解性(3)、三維內(nèi)部連通孔隙(4)、具備支架強(qiáng)度。常用的有蛋白質(zhì)支架、多糖支架、磷酸鈣基生物材料、硫酸鈣基生物材料。C、生長(zhǎng)因子表皮生長(zhǎng)因子:是對(duì)上皮細(xì)胞增殖有很 強(qiáng)促進(jìn)作用的53個(gè)氨基酸殘基的多肽。神經(jīng)生長(zhǎng)因子:為神經(jīng)細(xì)胞特異性分泌的營(yíng)養(yǎng)蛋白。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子:為728個(gè)氨基酸殘基單鏈組成。骨形態(tài)發(fā)生蛋白:能誘導(dǎo)或刺激新骨的生成。7、組織工程的技術(shù)路線。(1)體外得到工程化組織、移植目前主要的方式(2)細(xì)胞與支架前體混合注射體內(nèi),原位形成凝膠支架,提供新組織形
32、成的空間8動(dòng)物器官培養(yǎng)的特征 。(1)被培養(yǎng)的器官在體外存活較長(zhǎng)時(shí)間,并保存相對(duì)正常的功能,器官內(nèi)的細(xì)胞有正常的代謝甚至增殖。而器官保存無(wú)細(xì)胞增殖 (2)被培養(yǎng)物為一完整器官或具有完整功能的某一器官的一部分,如肝 (3)器官培養(yǎng)不能從一個(gè)變成多個(gè),而細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中有細(xì)胞量的增加 9.干細(xì)胞的特征。 n 形態(tài)和生化特征 形態(tài):圓形或橢圓形 、體積小 、核質(zhì)比例大 生化特征:具有較高的端粒酶活性 n 增殖 (1)緩慢性 干細(xì)胞的增殖速度一般比較慢。一旦機(jī)體需要,干細(xì)胞就可以進(jìn)入分化過(guò)程。此時(shí),其增殖速度開(kāi)始逐漸加快。 (2)自穩(wěn)性 指干細(xì)胞會(huì)自我更新維持自身數(shù)目的恒定。10干細(xì)胞的種類 (1)分化
33、潛能:不同的干細(xì)胞具有不同的分化潛能。 單能干細(xì)胞 多能干細(xì)胞 全能干細(xì)胞(2)干細(xì)胞種類:從來(lái)源講,干細(xì)胞包括: 成體干細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)11.如何獲得胚胎干細(xì)胞? 來(lái)源:早期胚胎內(nèi)生細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞(桑椹胚) (1)從早期胚胎的獲得 (2)從原始生殖細(xì)胞中獲得 (3)體外受精胚胎囊胚期內(nèi)層細(xì)胞 (4)體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移12.如何正確認(rèn)識(shí)動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)?陳麗靜: 一、名詞解釋1、細(xì)胞工程(cell engineering):應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法,通過(guò)類似于工程學(xué)的步驟,在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上,按照人們的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)以獲得新型生物或一定細(xì)胞產(chǎn)品的一門(mén)
34、綜合性科學(xué)技術(shù)。2、細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture):是指生物細(xì)胞和組織在離體條件下的生長(zhǎng)和增殖。3、細(xì)胞融合(cell fusion): 又稱體細(xì)胞雜交(cell hybridization), 是指將不同來(lái)源的原生質(zhì)體相融合并使之分化再生,形成新物種或新品種的技術(shù)。4、細(xì)胞核移植(nuclear transplantation):利用顯微操作技術(shù)將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分離,然后再將不同來(lái)源的核與質(zhì)重組,形成雜種細(xì)胞。5、染色體工程(chromosome engineering ):把單個(gè)的染色體或染色體組轉(zhuǎn)入或移出受體細(xì)胞,從而形成新的染色體組合和遺傳構(gòu)成。6、胚胎工程(embryonic
35、engineering):以生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞為對(duì)象進(jìn)行的操作,主要包括體外受精、胚胎切割、胚胎移植等。7、干細(xì)胞(stem cell):動(dòng)物體內(nèi)具有分化潛能,并能自我更新的細(xì)胞,分為胚胎干細(xì)胞和組織干細(xì)胞。8、植物細(xì)胞工程:以植物組織細(xì)胞為基本單位,在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作,使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變,從而改良品種或創(chuàng)造新物種,或加速繁殖植物個(gè)體,或獲得有用物質(zhì)的過(guò)程。9、脫分化:離體培養(yǎng)條件下,一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無(wú)分化狀態(tài)或分生組織細(xì)胞狀態(tài)或胚性細(xì)胞的狀態(tài)的過(guò)程。10、再分化:脫分化后的分生細(xì)胞(愈傷組織)在特定的條件(離體培養(yǎng))下,重新恢復(fù)細(xì)胞分
36、化能力,并經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根,或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體,進(jìn)一步發(fā)育成完整生物體。11、細(xì)胞全能性:一個(gè)細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個(gè)體的固有能力。12、外植體:植物組織培養(yǎng)中用來(lái)進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)的離體材料,可以是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。13、愈傷組織:脫分化后的細(xì)胞,經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂,產(chǎn)生無(wú)組織結(jié)構(gòu)、無(wú)明顯極性的、松散的細(xì)胞團(tuán)。14、細(xì)胞分化:是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu),引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過(guò)程。15、離體無(wú)性繁殖(propagation in vitro) :利用離體培養(yǎng)技術(shù),將來(lái)自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng),在短期內(nèi)獲得大量遺傳形
37、狀一致的個(gè)體的方法。16、單株無(wú)性系或單芽無(wú)性系:離體無(wú)性繁殖得到的植株群體來(lái)自一個(gè)單株或單芽,他們的遺傳組成相同,稱為單株無(wú)性系或單芽無(wú)性系 17、植物脫毒(virus elimination):利用植物組織培養(yǎng)技術(shù),脫除植物細(xì)胞中浸染的病毒,生產(chǎn)健康的繁殖材料。18、體細(xì)胞胚或胚狀體:離體培養(yǎng)下沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程,但經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程所形成的胚的類似物(不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞)。19、初代培養(yǎng):直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物20、繼代培養(yǎng):將初代培養(yǎng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上,使愈傷組織分化出叢生芽、不定芽繼續(xù)增殖、胚狀體發(fā)育成完整植株 21、指示植物:
38、 22、花藥培養(yǎng)(anther culture):把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上,使其發(fā)育和分化成為植株的過(guò)程.23、花粉培養(yǎng)(pollen culture):也叫小孢子培養(yǎng)(microspore culture),是從花藥中分離出花粉粒,使之成為分散的或游離的狀態(tài),通過(guò)培養(yǎng)使花粉粒脫分化,進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過(guò)程.24、胚胎培養(yǎng):使胚或具胚器官在離體無(wú)菌條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。25、胚培養(yǎng):在無(wú)菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來(lái),置于培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)的方法 27、污染:在組培過(guò)程中培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)滋生菌斑,使培養(yǎng)材料不能正常生長(zhǎng)發(fā)育,從而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。28、褐變:接種后,其表面開(kāi)始變褐,有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基變成褐色的現(xiàn)象。29、玻璃化:培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明水漬狀現(xiàn)象。30、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(cell suspension culture):將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。31、細(xì)胞同步化:同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。32、細(xì)胞平板培養(yǎng):將制備好的單細(xì)胞懸浮液,按照一定的細(xì)胞密度,接種在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),33、看護(hù)培養(yǎng):用一塊愈傷組織或植物離體組織看護(hù)單細(xì)胞使其生長(zhǎng)增殖的一種單細(xì)胞培養(yǎng)方法34、微室培養(yǎng):人工制
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