淋巴細胞分離實驗知識講解

1、淋巴細胞分離實驗原原 理理n外周血各種血細胞的密度不盡相同，外周血各種血細胞的密度不盡相同，利用淋巴細胞分層液利用淋巴細胞分層液（Ficoll）作作密度梯度離心密度梯度離心，使一定比重的細胞，使一定比重的細胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。種血細胞加以分離。 原原 理理外周血外周血紅細胞紅細胞粒細胞粒細胞單個核細胞單個核細胞血小板血小板淋巴細胞淋巴細胞單核細胞單核細胞1.0931.0301.0351.0751.090Ficoll：1.0770.001 (PBMC)1.0921500rpm, 20 , 30minPBMC紅細胞紅細胞粒細胞粒細胞Fic

2、oll稀釋外周血Ficoll稀釋的血漿、稀釋的血漿、血小板血小板實驗步驟實驗步驟n1.采血，稀釋采血，稀釋 （外周血：稀釋液外周血：稀釋液=1：2）n2.在離心管中加入在離心管中加入Ficoll，沿傾斜的，沿傾斜的管壁緩緩加入稀釋的外周血管壁緩緩加入稀釋的外周血 （Ficoll：稀釋血：稀釋血=1：2）實驗步驟實驗步驟n3.20，1500r/min，離心離心30minn4.沿管壁周緣沿管壁周緣輕輕吸取輕輕吸取PBMC層移入層移入另一試管中另一試管中實驗步驟實驗步驟n5.加足量稀釋液加足量稀釋液充分洗滌充分洗滌，1800 r/min離心離心10min ，棄上清，棄上清n6.重復(fù)洗滌一次，重復(fù)洗滌

3、一次，1400r/min離心離心10min，棄上清棄上清n7.適量的培養(yǎng)基重懸細胞適量的培養(yǎng)基重懸細胞 ，計數(shù)，計數(shù)試劑和儀器試劑和儀器n淋巴細胞分層液（淋巴細胞分層液（Ficoll，低溫避光保，低溫避光保存），存），Hanks液，液，RPMI1640，PBS，小，小牛血清，華氏管，牛血清，華氏管，50ml離心管，離心管，2ml（5ml）吸管，水平離心機）吸管，水平離心機注意事項注意事項n1.每毫升外周血液大約可獲每毫升外周血液大約可獲1 110106 6單個核細胞單個核細胞 n2.Ficoll應(yīng)適量，外周血應(yīng)充分稀釋應(yīng)適量，外周血應(yīng)充分稀釋 n2.溫度直接影響到溫度直接影響到Ficoll的比

4、重和分離效果的比重和分離效果 n3.在在Ficoll上加入稀釋外周血時，應(yīng)緩慢加，上加入稀釋外周血時，應(yīng)緩慢加，以免沖散界面以免沖散界面 n4. 吸取單個核細胞層時，應(yīng)避免吸出過多的上吸取單個核細胞層時，應(yīng)避免吸出過多的上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染細胞計數(shù)細胞計數(shù)n試劑和儀器試劑和儀器n實驗步驟實驗步驟n注意事項注意事項試劑和儀器試劑和儀器n血球計數(shù)板，蓋玻片，血球計數(shù)板，蓋玻片，Hanks液，液，RPMI1640，2ml（5ml）吸管，華氏）吸管，華氏管，移液尖，微量移液器，顯微鏡管，移液尖，微量移液器，顯微鏡 實驗步驟實驗步驟n1、準備計數(shù)板、準備計數(shù)板：n2

5、、制備細胞懸液、制備細胞懸液：收集細胞，制成單個細胞：收集細胞，制成單個細胞懸液懸液n3、加樣、加樣：用吸管輕輕吹打細胞懸液，取少許：用吸管輕輕吹打細胞懸液，取少許細胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細細胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細胞懸液，胞懸液，n4、計數(shù)、計數(shù)：在顯微鏡下，用：在顯微鏡下，用10物鏡觀察計數(shù)物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù) 實驗步驟n5、計算計算：將結(jié)果代入下式，得出細胞密度 細胞數(shù)細胞數(shù)/毫升原液毫升原液 =（4大格細胞數(shù)之和大格細胞數(shù)之和/4）104注意事項n1.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液 n2.加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡氣泡n3.細胞壓中線時，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右細胞壓中線時，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右 n4.本法要求細胞密度不低于本法要求細胞密度不低于104細胞細胞/mln5.鏡下計數(shù)時，細胞數(shù)過少或過多，說明稀鏡下計數(shù)時，細胞數(shù)過少或過多，說明稀釋不當，需重新制備細胞懸液、計數(shù)釋不當，需重新制備細胞懸液、計數(shù)實驗要求實驗要求n華氏管中加入血樣后，用記號筆作好標記n實驗完畢后，請清洗試管、吸管和計數(shù)板試驗報告要求n試驗內(nèi)容