CRISPRCas概述解讀實(shí)用學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1CRISPRCas概述概述(i sh)解讀實(shí)用解讀實(shí)用第一頁(yè)，共41頁(yè)。背景背景(bijng) 1、CRISPR-Cas概概述述u1987年，日本大阪年，日本大阪(d bn)大學(xué)（大學(xué)（Osaka University）在對(duì)一種細(xì)菌編碼）在對(duì)一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶（的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡(jiǎn)單的片段，這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列。重復(fù)序列組成的，而且在

2、片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列。u2013以后，研究者們?cè)诎ㄒ院螅芯空邆冊(cè)诎╯cience和和nature biotechnology等著等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類(lèi)、小鼠系統(tǒng)，并且已成功在人類(lèi)、小鼠、斑馬魚(yú)等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。、斑馬魚(yú)等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。第1頁(yè)/共41頁(yè)第二頁(yè)，共41頁(yè)。CRISPR-Cas主要由兩部分主要由兩部分(b fen)組組成：成：識(shí)別識(shí)別(shbi)(shbi)切割切割(qig)(qig)背景背景第2頁(yè)/共41頁(yè)第三頁(yè)，共41頁(yè)。 CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古

3、生菌的天然免疫系統(tǒng)，通是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)入侵的病毒和核酸過(guò)對(duì)入侵的病毒和核酸(h sun)進(jìn)行特異性的識(shí)別，利用進(jìn)行特異性的識(shí)別，利用Cas蛋白蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫。進(jìn)行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫。背景背景(bijng)第3頁(yè)/共41頁(yè)第四頁(yè)，共41頁(yè)。背景背景(bijng)第4頁(yè)/共41頁(yè)第五頁(yè)，共41頁(yè)。綜述綜述(zngsh)第5頁(yè)/共41頁(yè)第六頁(yè)，共41頁(yè)。綜述綜述(zngsh)第6頁(yè)/共41頁(yè)第七頁(yè)，共41頁(yè)。綜述綜述(zngsh)第7頁(yè)/共41頁(yè)第八頁(yè)，共41頁(yè)。綜述綜述(zngsh)第8頁(yè)/共41頁(yè)第九頁(yè)，共41頁(yè)。綜述綜述(zngsh)圖

4、解圖解第9頁(yè)/共41頁(yè)第十頁(yè)，共41頁(yè)。第10頁(yè)/共41頁(yè)第十一頁(yè)，共41頁(yè)。一個(gè)(y )最簡(jiǎn)化的CRISPRi系統(tǒng)包含一個(gè)(y )蛋白和一個(gè)(y )RNA，它能有效沉默轉(zhuǎn)錄起始和延伸Result 1第11頁(yè)/共41頁(yè)第十二頁(yè)，共41頁(yè)。第12頁(yè)/共41頁(yè)第十三頁(yè)，共41頁(yè)。第13頁(yè)/共41頁(yè)第十四頁(yè)，共41頁(yè)。第14頁(yè)/共41頁(yè)第十五頁(yè)，共41頁(yè)。第15頁(yè)/共41頁(yè)第十六頁(yè)，共41頁(yè)。Result 2第16頁(yè)/共41頁(yè)第十七頁(yè)，共41頁(yè)。Result 3第17頁(yè)/共41頁(yè)第十八頁(yè)，共41頁(yè)。第18頁(yè)/共41頁(yè)第十九頁(yè)，共41頁(yè)。第19頁(yè)/共41頁(yè)第二十頁(yè)，共41頁(yè)。Result 4第20頁(yè)/

5、共41頁(yè)第二十一頁(yè)，共41頁(yè)。Result 5第21頁(yè)/共41頁(yè)第二十二頁(yè)，共41頁(yè)。Result 6第22頁(yè)/共41頁(yè)第二十三頁(yè)，共41頁(yè)。第23頁(yè)/共41頁(yè)第二十四頁(yè)，共41頁(yè)。第24頁(yè)/共41頁(yè)第二十五頁(yè)，共41頁(yè)。Result 7第25頁(yè)/共41頁(yè)第二十六頁(yè)，共41頁(yè)。第26頁(yè)/共41頁(yè)第二十七頁(yè)，共41頁(yè)。第27頁(yè)/共41頁(yè)第二十八頁(yè)，共41頁(yè)。將dCas9蛋白密碼子最優(yōu)化，融合到三個(gè)拷貝的核定位序列（NLS），并利用小鼠干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄載體表達(dá)。sgRNA用RNA聚合酶U6啟動(dòng)子表達(dá)。通過(guò)病毒(bngd)侵染創(chuàng)建了一個(gè)在SV40啟動(dòng)子下表達(dá)EGFP的HEK293報(bào)告細(xì)胞系。Result

6、 8第28頁(yè)/共41頁(yè)第二十九頁(yè)，共41頁(yè)。第29頁(yè)/共41頁(yè)第三十頁(yè)，共41頁(yè)。CRISPRi不依賴于復(fù)雜的宿主因子，只需要dCas9蛋白和引導(dǎo)RNAs，并且靈活性和可塑性高。我們的結(jié)果證實(shí)在微生物中該系統(tǒng)能有效沉默基因。這種沉默是十分特異性的；我們的觀察沒(méi)有發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)。另外，敲除效率能通過(guò)(tnggu)改變定位位點(diǎn)和sgRNA與目的基因之間堿基配對(duì)程度加以改變。該系統(tǒng)通過(guò)(tnggu)直接阻礙轉(zhuǎn)錄發(fā)揮功能，可以很容易的通過(guò)(tnggu)設(shè)計(jì)sgRNAs來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，這些dCas9：sgRNA復(fù)合物也能在任何啟動(dòng)子中通過(guò)(tnggu)定位關(guān)鍵反式激活結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，空間上阻礙它們同源的順式激活因子。第30頁(yè)/共41頁(yè)第三十一頁(yè)，共41頁(yè)。能將多個(gè)元件連接到同一個(gè)表達(dá)載體。討論(toln)第31頁(yè)/共41頁(yè)第三十二頁(yè)，共41頁(yè)。討論(toln)第32頁(yè)/共41頁(yè)第三十三頁(yè)，共41頁(yè)。第33頁(yè)/共41頁(yè)第三十四頁(yè)，共41頁(yè)。第34頁(yè)/共41頁(yè)第三十五頁(yè)，共41頁(yè)。第35頁(yè)/共41頁(yè)第三十六頁(yè)，共4