葡聚糖凝膠層析法分離蛋白質(zhì)、

1、生物化學大實驗生物化學大實驗實驗指導老師實驗指導老師 張萍萍張萍萍 房偉房偉 袁璟袁璟 袁莉袁莉 2013-09生化實驗生化實驗 n實驗一： Sephadex-G50層析法分離藍葡聚糖-2000和重鉻酸鉀n實驗二：植物基因組DNA的提取及分離純化n實驗三：植物基因組DNA的鑒定與分析n實驗四：蛋白質(zhì)的FPLC分離與定量測定 n實驗五：SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量n實驗六：聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的等電點分子生物學實驗分子生物學實驗 n實驗七：質(zhì)粒的小量抽提n實驗八：質(zhì)粒DNA的酶切及電泳鑒定n實驗九：聚合酶鏈式反應技術n實驗十： PCR產(chǎn)物的膠回收純化n實驗十一：大腸桿菌感受態(tài)

2、細胞的制備及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化n實驗十二：DNA的體外重組實驗要求（1）實驗前要預習相關的內(nèi)容實驗前要預習相關的內(nèi)容，弄懂原理，了解實驗的設計思路，找出實驗操作的關鍵步驟，試劑的配制方法及用量，數(shù)據(jù)處理的方法等。（2）實驗過程中，要認真，規(guī)范的操作。學會安排實驗時間和實驗順序?qū)W會安排實驗時間和實驗順序。如實記錄實驗中出現(xiàn)的現(xiàn)象和數(shù)據(jù)。（3）使用儀器時要按照說明書去做。發(fā)現(xiàn)故障應停止使用。節(jié)約試劑。公用試劑用完后，要及時放回原處。（4）實驗報告要及時完成。報告上要注明實驗日期及溫度。在報告的結(jié)果討中，對實驗現(xiàn)象，結(jié)果和數(shù)據(jù)等可進行分析；也可對實驗中遇到的問題及實驗中需要改進的地方進行討論。（5）一

3、般試劑都應用蒸餾水或無離子水試劑都應用蒸餾水或無離子水(即離子交換水即離子交換水)配制配制，有特殊要求的除外。（6）試劑試劑(特別是液體特別是液體)一經(jīng)取出，不得放回原瓶一經(jīng)取出，不得放回原瓶，以免因量器或藥勺不清潔而沾污整瓶試劑。取固體試劑時，必須使用潔凈干燥的藥勺。（7）使用易燃、易爆、有腐蝕性甚至有毒的化學藥品時應注意安全，必要時應戴手套，帶口罩或防毒面罩，并在通風櫥中進行。（8）實驗紀律：不遲到和缺席。實驗室的衛(wèi)生要輪流值日。成績評定成績評定n平時成績：考勤 實驗技能測試和實驗報告等 50 60% n期末理論考試： 50 40%l實驗室：實驗室： 207室室 209室室l領用儀器：領用

4、儀器： 211室室 袁莉袁莉?qū)嶒?葡聚糖凝膠層析法分離蛋白質(zhì)張萍萍張萍萍一. 目的和要求n1. 掌握葡聚糖凝膠柱層析法的分離原理及基本操作技術: 裝柱 平衡 加樣 洗脫收集等步驟.n2. 了解Vt Ve Vo Vi Kd Kav等參數(shù)的含義.二二. .原理原理n凝膠層析（凝膠層析（gel chromatography）又稱為凝）又稱為凝膠過濾（膠過濾（gel filtration）、分子篩過濾）、分子篩過濾（molecular sieve filtration） 等。它是等。它是20世紀世紀60年代發(fā)展起來的一種層析技術。其年代發(fā)展起來的一種層析技術。其基本原理是利用基本原理是利用被分離物質(zhì)分

5、子大小不同及被分離物質(zhì)分子大小不同及固固定相（凝膠）定相（凝膠）具有分子篩的特點具有分子篩的特點，將被分離物將被分離物質(zhì)各成分按分子大小分開，達到分離的方法。質(zhì)各成分按分子大小分開，達到分離的方法。n凝膠是由膠體粒子構(gòu)成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)眼凝膠是由膠體粒子構(gòu)成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)眼里吸滿水后凝膠膨脹呈柔軟而富于彈性的半固里吸滿水后凝膠膨脹呈柔軟而富于彈性的半固體狀態(tài)。人工合成的凝膠網(wǎng)眼較均勻地分布在體狀態(tài)。人工合成的凝膠網(wǎng)眼較均勻地分布在凝膠顆粒上有如篩眼，凝膠顆粒上有如篩眼，小于篩眼的分子將完全小于篩眼的分子將完全滲入凝膠網(wǎng)眼滲入凝膠網(wǎng)眼，并隨著流動相的移動沿凝膠網(wǎng)并隨著流動相的移動沿凝膠網(wǎng)眼

6、孔道移動，從一個顆粒的網(wǎng)眼流出，又進入眼孔道移動，從一個顆粒的網(wǎng)眼流出，又進入另一顆粒的網(wǎng)眼，如此連續(xù)下去，直到流過整另一顆粒的網(wǎng)眼，如此連續(xù)下去，直到流過整個凝膠柱為止，因而個凝膠柱為止，因而流程長、阻力大、流速慢流程長、阻力大、流速慢；大于篩眼的分子則完全被篩眼排阻大于篩眼的分子則完全被篩眼排阻而不能進入而不能進入凝膠網(wǎng)眼，只能隨流動相沿凝膠顆粒的間隙流凝膠網(wǎng)眼，只能隨流動相沿凝膠顆粒的間隙流動，其動，其流程短、阻力小、流速快，流程短、阻力小、流速快，比小分子先比小分子先流出層析柱；小分子最后流出。分子大小介于流出層析柱；小分子最后流出。分子大小介于兩者之間的分子，不完全滲入凝膠網(wǎng)眼兩者之

7、間的分子，不完全滲入凝膠網(wǎng)眼，則居則居中流出。這樣被分離物質(zhì)即被按分子的大小分中流出。這樣被分離物質(zhì)即被按分子的大小分開。開。分子篩效應的理論分子篩效應的理論nA A小分子由于擴散作用進入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留，大分子被排阻在凝膠顆小分子由于擴散作用進入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留，大分子被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過；粒外面，在顆粒之間迅速通過；nB B(1)(1)蛋白質(zhì)混合物上柱蛋白質(zhì)混合物上柱 (2)(2)洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)，大分洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)，大分子則被排阻在顆粒之外（子則被排阻在顆粒之外（3 3）小分子被滯留，大分子向下移動，大小分子開始）小分子被

8、滯留，大分子向下移動，大小分子開始分開分開 (4)(4)大小分子完全分開大小分子完全分開 (5)(5)大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進中。尚在行進中。 n本實驗本實驗 利用凝膠柱：利用凝膠柱：SephadexG-50柱層柱層析，以水為洗脫液，分離大分子的藍葡析，以水為洗脫液，分離大分子的藍葡聚糖聚糖-2000 （分子量（分子量200萬）和小分子萬）和小分子的重鉻酸鉀（分子量的重鉻酸鉀（分子量293）; 根據(jù)組分根據(jù)組分的顏色深淺繪制洗脫曲線的顏色深淺繪制洗脫曲線; 并利用洗脫并利用洗脫參數(shù)計算組分的分配系數(shù)。參數(shù)計算組分的分配系數(shù)。交聯(lián)葡聚糖

9、凝膠（商品名為交聯(lián)葡聚糖凝膠（商品名為 Sephadex)n這是由這是由葡萄糖的多聚物葡萄糖的多聚物與與1氯氯 2、3環(huán)環(huán)氧丙烷氧丙烷交連而成。環(huán)氧丙烷引入丙三醇交連而成。環(huán)氧丙烷引入丙三醇基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯(lián)起來，基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯(lián)起來，凝膠網(wǎng)眼的大小由多聚葡萄糖的分子和凝膠網(wǎng)眼的大小由多聚葡萄糖的分子和環(huán)氧丙烷的比例（交聯(lián)度）來控制。環(huán)氧丙烷的比例（交聯(lián)度）來控制。交聯(lián)葡聚糖凝膠（商品名為交聯(lián)葡聚糖凝膠（商品名為 Sephadex)n常以常以G10至至G200號碼標記號碼標記 G G： 反應凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度等反應凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度等 G G后面的數(shù)字是其吸水

10、量（毫升水后面的數(shù)字是其吸水量（毫升水/ /克干膠）克干膠）乘以乘以1010所得的值。所得的值。 如如G G2525即表示吸水量為即表示吸水量為2.5ml/1g2.5ml/1g干膠。干膠。 市售有市售有G G1010、G G2525、G G5050、G G7575、G G100100、G G150150、G G200200等型號。等型號。 G G7575以上的膠因吸水量大，膨脹后形態(tài)柔軟易變，統(tǒng)稱為以上的膠因吸水量大，膨脹后形態(tài)柔軟易變，統(tǒng)稱為軟膠軟膠。G G7575以下的稱為以下的稱為硬膠。硬膠。n一般說一般說Sephadex G - l015通常用于分離肽及通常用于分離肽及“脫鹽脫鹽”。

11、Sephadex G75200用以分離各類蛋白質(zhì)。用以分離各類蛋白質(zhì)。n 外水體積外水體積(Vo: outer volume) (Vo: outer volume) ： 指基質(zhì)顆粒之間體積的總和指基質(zhì)顆粒之間體積的總和. .n 內(nèi)水體積內(nèi)水體積(vi:inner volume) (vi:inner volume) ： 指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和. .n 基質(zhì)體積基質(zhì)體積(Vg) (Vg) ： 指基質(zhì)自身所具有的體積。指基質(zhì)自身所具有的體積。 V V。、。、Vi Vi 和和 VgVg都是隨著床體積和基質(zhì)性質(zhì)都是隨著床體積和基質(zhì)性質(zhì)變化而變化的變化而變化的。n洗脫體積（洗脫體

12、積（VeVe）：指自加樣到組分出現(xiàn)最大濃度）：指自加樣到組分出現(xiàn)最大濃度（峰）時所流出的洗脫液體積。（峰）時所流出的洗脫液體積。n床體積床體積VtVt（total volume) total volume) ： 指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積(Vt)(Vt)。 VtVt是基質(zhì)的外水體積是基質(zhì)的外水體積(Vo)(Vo)和內(nèi)水體積和內(nèi)水體積(Vi) (Vi) 以及自身體積以及自身體積(Vg)(Vg)的總和。的總和。 Vt = Vo + Vi + VgVt = Vo + Vi + Vg = Vo + Vi = Vo + Vi Vt的測定的測定:n Vt為柱床

13、體積，可用下式計算：為柱床體積，可用下式計算： Vt=(D/2)2 h 式中，式中，為常數(shù)為常數(shù)3.14，D為柱直徑，為柱直徑，h為凝為凝膠床的高度。膠床的高度。n在實驗中在實驗中, 如何測定如何測定Vt?n Ve 與 Vo Vi 之間的關系為:nVe = Vo + Kd Vi 其中: Kd-樣品組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù). 也可視為 不同分子量組分在凝膠顆粒內(nèi)部和外部的分配系數(shù). 它只與被分離組分的分子量大小及凝膠顆?？讖酱笮『湍z顆粒間空隙有關;與柱的長短和粗細無關. Kd 可通過實驗測定. 分配系數(shù)分配系數(shù) Kd =Kd =（Ve Ve VoVo）/ Vi/ Vi nKd Kd

14、可以有下列幾種情況：可以有下列幾種情況：n(1)(1)當當Kd=OKd=O時，則時，則Ve=VoVe=Vo，即對于根本不能進入凝膠內(nèi)部的大分子，即對于根本不能進入凝膠內(nèi)部的大分子物質(zhì)物質(zhì)( (全排阻全排阻) )，洗脫容積等于空隙容積，洗脫容積等于空隙容積( (組分組分I)I)。n(2)(2)當當Kd=1Kd=1時，時，Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi，即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時，洗，即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時，洗脫容積應為空隙容積與內(nèi)容積之和脫容積應為空隙容積與內(nèi)容積之和( (組分組分)。n(3)(3)當當0101時時,Ve=Vo+KdVi,Ve=Vo+KdVi,即表示組分不同大小可部分進

15、入凝即表示組分不同大小可部分進入凝膠顆粒內(nèi)部膠顆粒內(nèi)部( (組分組分II) II) n1有效分配系數(shù)有效分配系數(shù)KavKavn已知已知 Kd=（Ve-Vo）/Vi，將，將Vt-Vo代替代替Vi， 則則Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo） 即即 Ve=Vo+Kav（Vt-Vo）nKav與與Kd對交聯(lián)度小的凝膠差別較小，而對交聯(lián)對交聯(lián)度小的凝膠差別較小，而對交聯(lián)度大的凝膠差別大。度大的凝膠差別大。n在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用時，當在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用時，當流動相流過流動相流過Vt體積后，所有的組分都應該被洗出體積后，所有的組分都應該被洗出來，這一點為凝膠層析法的特點來，

16、這一點為凝膠層析法的特點 nVt = Vo + Vi+ Vg = Vo + Vi nKd =（Ve Vo）/ Vi n Ve = Vo + Kd VinKav = （ Ve Vo）/ （Vt Vo） n Ve = Vo + Kav（Vt-Vo）n層析柱（層析柱（120cm）；梯度混合儀；恒流）；梯度混合儀；恒流泵；部分收集器；連接管等泵；部分收集器；連接管等 n葡聚糖葡聚糖G-50（ SephadexG-50 ）n樣品：藍葡聚糖樣品：藍葡聚糖-2000、重鉻酸鉀混合液、重鉻酸鉀混合液（各（各1mg/ml）n洗脫液：純水洗脫液：純水三器材和試劑三器材和試劑 1. 1.裝柱裝柱 n裝柱是裝柱是最關

17、鍵最關鍵的一步。的一步。n重力沉降法裝柱重力沉降法裝柱n陸續(xù)不斷陸續(xù)不斷地添加糊狀物，使其形成的膠粒床面上有地添加糊狀物，使其形成的膠粒床面上有膠粒連續(xù)均勻地沉降，直至裝柱物完全沉降至適當膠粒連續(xù)均勻地沉降，直至裝柱物完全沉降至適當?shù)闹搀w積為止。的柱床體積為止。 n柱的表面始終要保持著一層溶劑柱的表面始終要保持著一層溶劑( (一般一般l l3cm3cm柱高柱高) )柱的柱的任何一部分絕對不能任何一部分絕對不能“流干流干”。 四四. . 操作方法操作方法n層析柱的形狀，一般直徑層析柱的形狀，一般直徑 與高度的比為與高度的比為l l：1515為宜。為宜。n柱形必須根據(jù)層析介質(zhì)和柱形必須根據(jù)層析介

18、質(zhì)和 分離目的而定分離目的而定。待分離物待分離物 質(zhì)的性質(zhì)相近，柱越質(zhì)的性質(zhì)相近，柱越細長細長， 則分離效果越好，但流速則分離效果越好，但流速 較慢。在樣品組分并不復較慢。在樣品組分并不復 雜的情況下，采用雜的情況下，采用“矮胖矮胖柱柱”. .要求要求: :垂直垂直 柱面平柱面平 無氣泡無氣泡 無節(jié)痕無節(jié)痕 松散松散 均勻均勻 n灌注凝膠時要求將均勻的凝膠一直加到所需柱灌注凝膠時要求將均勻的凝膠一直加到所需柱床高度，床高度，不能時斷時續(xù)不能時斷時續(xù)，否則將出現(xiàn)分層或，否則將出現(xiàn)分層或“紋路紋路”等毛病。若在灌好膠后才發(fā)現(xiàn)等毛病。若在灌好膠后才發(fā)現(xiàn)“紋紋路路”、分層等現(xiàn)象時，要重新裝柱，以免影響

19、、分層等現(xiàn)象時，要重新裝柱，以免影響層析效果層析效果。n層析柱正式使用前，必須平衡至所需的層析柱正式使用前，必須平衡至所需的pHpH和離子強和離子強度，一般使用前用相當于柱床體積度，一般使用前用相當于柱床體積2-32-3倍的洗脫液倍的洗脫液流過凝膠柱，以流過凝膠柱，以壓實凝膠，穩(wěn)定柱床壓實凝膠，穩(wěn)定柱床，稱為平衡。，稱為平衡。 n檢查柱是否均勻，可用藍色葡聚糖檢查柱是否均勻，可用藍色葡聚糖20002000，在恒壓下，在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，說明柱是均勻的，可以使走柱，如色帶均勻下降，說明柱是均勻的，可以使用，否則應重新裝柱用，否則應重新裝柱. .n在平衡期間可調(diào)流速在平衡期間可調(diào)流速.

20、. 2.2.平衡平衡3.3.加樣加樣 要求要求: :樣品體積和濃度不變樣品體積和濃度不變(1.0ml)(1.0ml)有有3 3種方法可將樣品加到已制備好的柱頂：種方法可將樣品加到已制備好的柱頂：n1.1.簡單的方法是放除柱床表面以上的溶液，簡單的方法是放除柱床表面以上的溶液，但切忌液面低于凝膠表面但切忌液面低于凝膠表面。然。然后將樣品加在凝膠表面，打開柱下口開關，后將樣品加在凝膠表面，打開柱下口開關， 使樣品慢慢滲入凝膠內(nèi)。加使樣品慢慢滲入凝膠內(nèi)。加樣時樣時注意勿將凝膠柱面沖起形成凹面注意勿將凝膠柱面沖起形成凹面，也不能沿管壁流下，也不能沿管壁流下， 當慢慢滲入當慢慢滲入凝膠的樣品液液面與凝膠

21、柱面相平時，關閉下口，完成上樣。然后在凝膠凝膠的樣品液液面與凝膠柱面相平時，關閉下口，完成上樣。然后在凝膠柱面上加一層（柱面上加一層（1 12cm2cm柱高）洗脫液，接上洗脫瓶準備洗脫柱高）洗脫液，接上洗脫瓶準備洗脫。n2.2.不需要讓柱流干至床表面，而是加入不需要讓柱流干至床表面，而是加入1 1濃度濃度的蔗糖來增加樣品的密度；的蔗糖來增加樣品的密度；n3.3.方法是用一個毛細管和一個注射器或蠕動泵方法是用一個毛細管和一個注射器或蠕動泵把樣品直接傳送到柱表面把樣品直接傳送到柱表面( (如一些商品柱附有專如一些商品柱附有專門加樣裝置門加樣裝置) )。n保持柱上端膠面平整、柱內(nèi)無氣泡和膠床不干保持柱上端膠面平整、柱內(nèi)無氣泡和膠床不干裂十分重要。為此，除加樣時注意不破壞膠面平裂十分重要。為此，除加樣時注意不破壞膠面平整外