第4章 DNA復(fù)制、突變和損傷修復(fù)

1、2022/7/13China Parmaceutical University5533第四章 DNA的復(fù)制、突變、 損傷和修復(fù)第一節(jié) DNA的復(fù)制第二節(jié) 基因突變第三節(jié) DNA的修復(fù)系統(tǒng)2022/7/13China Parmaceutical UniversityNature455, 770-774 (9 October 2008) |doi:10.1038/nature07312Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processingEleni P. Mimitou1 & Lorraine S. Symingt

2、on1Department of Microbiology, Columbia University Medical Center, 701 West 168th Street, New York, New York 10032, USADNA ends exposed after introduction of double-strand breaks (DSBs) undergo 53 nucleolytic degradation to generate single-stranded DNA, the substrate for binding by the Rad51 protein

3、 to initiate homologous recombination. This process is poorly understood in eukaryotes, but several factors have been implicated, including the Mre11 complex (Mre11Rad50Xrs2/NBS1), Sae2/CtIP/Ctp1 and Exo1. Here we demonstrate that yeast Exo1 nuclease and Sgs1 helicase function in alternative pathway

4、s for DSB processing. Novel, partially resected intermediates accumulate in a double mutant lacking Exo1 and Sgs1, which are poor substrates for homologous recombination. The early processing step that generates partly resected intermediates is dependent on Sae2. When Sae2 is absent, in addition to

5、Exo1 and Sgs1, unprocessed DSBs accumulate and homology-dependent repair fails. These results suggest a two-step mechanism for DSB processing during homologous recombination. First, the Mre11 complex and Sae2 remove a small oligonucleotide(s) from the DNA ends to form an early intermediate. Second,

6、Exo1 and/or Sgs1 rapidly process this intermediate to generate extensive tracts of single-stranded DNA that serve as substrate for Rad51.2022/7/13China Parmaceutical University第一節(jié) DNA的復(fù)制一、DNA復(fù)制的一般特征二、DNA復(fù)制中的酶學(xué)三、原核生物的DNA復(fù)制四、真核生物的DNA復(fù)制2022/7/13China Parmaceutical University需要清楚的幾個(gè)概念復(fù)制子(replicon) 一個(gè)復(fù)制子

7、是一個(gè)復(fù)制單位,包括復(fù)制所需的控制元件、起始點(diǎn)和終點(diǎn);復(fù)制子可以是線狀也可以是環(huán)狀;細(xì)菌和病毒一個(gè)DNA分子就是一個(gè)復(fù)制子;真核生物含有多個(gè)復(fù)制子,兩個(gè)起始點(diǎn)之間的DNA片段就是一個(gè)復(fù)制子;復(fù)制叉(replication folk)復(fù)制時(shí)形成的Y行結(jié)構(gòu)2022/7/13China Parmaceutical University復(fù)制方向雙向復(fù)制 bidirectional replication 單向復(fù)制 unidirectional replication 不對稱雙向復(fù)制 大多原核和真核生物都雙向等速復(fù)制?？莶輻U菌雙向不對稱復(fù)制ColE1質(zhì)粒單向復(fù)制2022/7/13China Parmac

8、eutical University-replicon-單向復(fù)制雙向復(fù)制Fused replicon2022/7/13China Parmaceutical University一、DNA復(fù)制的特征1. 半保留復(fù)制2. 半不連續(xù)復(fù)制3. DNA復(fù)制需要RNA引物引發(fā)2022/7/13China Parmaceutical University1.半保留復(fù)制 2022/7/13China Parmaceutical University2. 半不連續(xù)復(fù)制先導(dǎo)鏈后隨鏈 岡崎片段1-2kb2022/7/13China Parmaceutical University3. DNA復(fù)制需要RNA引物引發(fā)

9、DNA聚合酶不能起始DNA的合成，必須有RNA引物。引出問題：復(fù)制完成后DNA鏈上會(huì)有RNA短片段; 3末端的縮短2022/7/13China Parmaceutical University二、DNA復(fù)制中的酶學(xué)DNA復(fù)制時(shí)首先由解旋酶 水解ATP,沿5 3方向解開DNA雙鏈.E.coli中基因dnaB 編碼的產(chǎn)物DnaB蛋白是解旋酶1.解旋酶 Helicase2022/7/13China Parmaceutical University2.單鏈DNA結(jié)合蛋白 Single-strand DNA-binding proteins, SSBs SSBs的作用：與解旋的單鏈結(jié)合，防止單鏈被酶水解

10、及重新彌合成雙鏈.SSB在原核中SSB與DNA結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。（1）SSB之間的相互作用；（2）第一個(gè)SSB和DNA的結(jié)合能夠提高DNA與SSB 的親和力2022/7/13China Parmaceutical University3. DNA 聚合酶 DNA polymerase 原核生物和真核生物DNA聚合酶不同。DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是：（1）需要提供模板；（2）不能起始新的DNA鏈,必須要有引物提供3OH；（3）合成DNA的方向都是53;（4）除聚合DNA外還有其它功能。2022/7/13China Parmaceutical University原核生物DNA polymeras

11、e主要有三種：DNA pol I 修復(fù)作用DNA polDNA pol 復(fù)制酶2022/7/13China Parmaceutical UniversityDNA聚合酶的一般功能:（1） 53聚合功能（2） 35外切活性（3） 53外切活性切口平移;鏈的置換；模板轉(zhuǎn)換 (4) 內(nèi)切酶活性在原核生物DNA合成中,RNA引物的去除,修復(fù)由DNA聚合酶完成.2022/7/13China Parmaceutical UniversityDNA聚合酶的53外切活性35外切活性內(nèi)切酶活性2022/7/13China Parmaceutical UniversityDNA pol 功能：不同的亞基有不同的活

12、性,三亞基聚合在一起才能發(fā)揮最大效應(yīng). DNA聚合酶活性； 35核酸外切酶活性； 激活 核酸外切酶活性. 2022/7/13China Parmaceutical UniversityDNA polymerase 合成先導(dǎo)鏈和后隨鏈的起始DNADNA polymerase 先導(dǎo)鏈、后隨鏈的延伸DNA polymerase DNA repairDNA polymerase DNA repairDNA polymerase 線粒體DNA的復(fù)制真核生物的DNA polymerase2022/7/13China Parmaceutical University4. 拓?fù)洚悩?gòu)酶 Topoisomeras

13、es 無論原核生物還是真核生物中復(fù)制叉的移動(dòng)和轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行都需要拓?fù)洚悩?gòu)酶. E.Coli中有四種拓?fù)洚悩?gòu)酶:Topoisomerase I, 和 gyrase(旋轉(zhuǎn)酶),其中I和屬I型 (type I), 和 gyrase屬于II型(type II).gyrase將復(fù)制叉前的正超螺旋變成負(fù)超螺旋,隨后I和將其消除. 真核生物中原理相同.2022/7/13China Parmaceutical UniversityType I Topoisomerase 作用示意圖2022/7/13China Parmaceutical University5. DNA連接酶DNA合成中岡崎片段之間及所有Nic

14、k的封閉由DNA連接酶完成;活化的5PO4與相鄰的3OH作用形成35 磷酸二酯鍵，并釋放出AMP.2022/7/13China Parmaceutical University（一）復(fù)制原點(diǎn)：E.coli OriC長約240bp,包括4個(gè)9聚體，3個(gè)13聚體.三、原核生物的DNA復(fù)制過程2022/7/13China Parmaceutical UniversityE.Coli首先合成復(fù)制起始體, 起始復(fù)合體由六種蛋白組成: DnaA, DnaB, DnaC,組蛋白樣蛋白HU,旋轉(zhuǎn)酶及SSB.（二）復(fù)制的起始2022/7/13China Parmaceutical University1.復(fù)制的

15、引發(fā) priming2022/7/13China Parmaceutical University2. 延伸Elongation先導(dǎo)鏈后滯鏈2022/7/13China Parmaceutical University(三) 復(fù)制的終止 Termination現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)終止區(qū)域（terE,D,A和terC,B），ter序列有一個(gè)23bp的區(qū)域，在體外可導(dǎo)致復(fù)制的終止，但其功能顯示了一定的方向性。終止需要tus(terminus utilization substance)基因的產(chǎn)物Tus(36kD)， Tus能識(shí)別ter保守順序，并阻止復(fù)制叉繼續(xù)前進(jìn)。ter-Tus復(fù)合物可能通過抑制解旋酶

16、來實(shí)行終止2022/7/13China Parmaceutical University2022/7/13China Parmaceutical University四、真核生物DNA復(fù)制1.真核生物復(fù)制的起始序列真核細(xì)胞以多個(gè)復(fù)制叉同時(shí)進(jìn)行復(fù)制，哺乳乳動(dòng)物約510萬個(gè)復(fù)制叉同時(shí)進(jìn)行復(fù)制 復(fù)制的過程的本質(zhì)在原核和真核生物是相同的,不同的是起始的序列,參加的蛋白質(zhì)的不同,另外在具有端粒酶活性的細(xì)胞中存在線性末端的復(fù)制.2022/7/13China Parmaceutical University64bp核心序列含有： 4個(gè)5GAGGC-3 ，大T抗原結(jié)合位點(diǎn),1個(gè)15bp回文序列 ; AT組成的

17、17bp區(qū)域SV40病毒復(fù)制起始點(diǎn)2022/7/13China Parmaceutical University 1）解鏈 大T抗原螺旋酶單鏈結(jié)合蛋白復(fù)制蛋白R(shí)PA2）合成引物并延長引物酶 合成RNA引物DNApol 合成短DNADNApol 前導(dǎo)鏈和后滯鏈鏈的延伸 中有PCNA,能將固定到模板上 2.真核細(xì)胞DNA復(fù)制的過程2022/7/13China Parmaceutical University真核細(xì)胞DNA復(fù)制的起始2022/7/13China Parmaceutical University3.真核細(xì)胞DNA復(fù)制的終止端粒酶催化作用下富含G的端粒的產(chǎn)生.端粒合成的過程:3端DNA為

18、引物，端粒酶自帶RNA模板，進(jìn)行結(jié)合、聚合、延伸、移位。2022/7/13China Parmaceutical UniversityGGG(TTAGGG)nCCC(AATCCC)n人DNA端粒結(jié)構(gòu)重復(fù)單位重復(fù)次數(shù)2022/7/13China Parmaceutical UniversityGGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAU53端粒酶作用機(jī)理2022/7/13China Parmaceutical University五、噬菌體、病毒、質(zhì)粒及線粒體核酸的復(fù)制(了

19、解)雙鏈DNA單股正鏈DNA雙鏈RNA單股負(fù)鏈RNA單股正鏈RNA病毒 核酸分子的正鏈與負(fù)鏈： 與mRNA相同的核酸鏈，稱為正鏈； 與mRNA互補(bǔ)的核酸鏈，稱為負(fù)鏈。2022/7/13China Parmaceutical University 這類病毒基因組DNA復(fù)制的類型：（1）通過DNA復(fù)制過程完成基因組復(fù)制。大多數(shù)DNA病毒基因組屬這種類型。（2）先轉(zhuǎn)錄生成RNA中間體，然后再通過逆轉(zhuǎn)錄過程完成基因組的復(fù)制。如乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）。2022/7/13China Parmaceutical UniversityX174, M13，質(zhì)粒 滾環(huán)復(fù)制 (1）共

20、價(jià)延伸；（2）模板鏈和新合成的鏈 分開;（3）不需RNA引物，在正 鏈3OH上延（4）只有一個(gè)復(fù)制叉;2022/7/13China Parmaceutical University第一節(jié) DNA的復(fù)制第二節(jié) 基因突變第三節(jié) DNA的修復(fù)系統(tǒng)2022/7/13China Parmaceutical University第二節(jié) 基因突變 p133突變的概念突變的類型突變原因自發(fā)突變誘發(fā)突變基因的人工誘變 體外定向突變 p1412022/7/13China Parmaceutical University第一節(jié) DNA的復(fù)制第二節(jié) 基因突變第三節(jié) DNA的修復(fù)系統(tǒng)2022/7/13China Par

21、maceutical University第三節(jié) DNA的修復(fù)系統(tǒng)一、復(fù)制修復(fù) 主要校正DNA復(fù)制過程產(chǎn)生的堿基錯(cuò)誤連接,包括尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)和錯(cuò)配修復(fù)二、損傷修復(fù)三、復(fù)制后修復(fù)四、限制與修飾2022/7/13China Parmaceutical University一、復(fù)制修復(fù)1.尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)（uracil N-glycosylase)DNA中尿嘧啶的產(chǎn)生:dUTP 摻入和C自發(fā)脫氨氧化成U 修復(fù):尿嘧啶N-糖基酶，切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無Pu和Py位點(diǎn)（apurinic or apyrimidinic，AP），再由AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)切出一個(gè)缺口,聚合酶I填補(bǔ)缺口，連接酶封閉ni

22、ck。2022/7/13China Parmaceutical University2. 錯(cuò)配修復(fù)DNA錯(cuò)配修復(fù)基因是生物進(jìn)化過程的保守基因,可維持基因組的穩(wěn)定性DNA復(fù)制產(chǎn)生10-5錯(cuò)配率，其中99%被復(fù)制酶校正，剩下的10-7由錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)，最后實(shí)際突變率只有10-10 。問題：如何識(shí)別哪條是含有錯(cuò)誤的新鏈，哪條是需要保留的母鏈？2022/7/13China Parmaceutical UniversityMut蛋白識(shí)別錯(cuò)配堿基并在新鏈GATC5端打開切口,外切酶沿3 5方向切除含錯(cuò)配DNA約1kb,DNA聚合酶III全酶填補(bǔ)空缺，連接酶封閉切口，dam甲基化酶使新鏈甲基化。母鏈上每2

23、50bp有一個(gè)GATC，dam甲基化酶識(shí)別其并在A上甲基化，子鏈甲基化程度晚些 ，因此有了區(qū)別。錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制修復(fù)系統(tǒng)由mutS,mut L,mut H編碼的蛋白,外切酶,DNA聚合酶全酶和連接酶共同組成2022/7/13China Parmaceutical University3. 無嘌呤修復(fù)2022/7/13China Parmaceutical University二、損傷修復(fù)胸腺嘧啶二聚體的產(chǎn)生2022/7/13China Parmaceutical University1.光復(fù)活（photoreactivation） 光復(fù)活酶在暗處與T二聚體結(jié)合，藍(lán)光下激活，打開二聚體。2.甲基轉(zhuǎn)移酶鳥嘌呤被甲基化成為O6-G, O6-G甲基轉(zhuǎn)移酶去除甲基3.切除修復(fù)（excision repair）將變形的損傷DNA片段從雙鏈分子除去,用正常的鏈做模板重新合成一段DNA取代損傷片段損傷修復(fù)系統(tǒng)2022/7/13China Parmaceutical University核酸內(nèi)切酶UreABC識(shí)別損傷