CRISPR和RNAi在藥物靶標(biāo)篩選中棋逢對(duì)手？

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)在藥物靶標(biāo)篩選中棋逢對(duì)手？ 最近的一項(xiàng)利用CRISPR開展的研究駁斥了多年來利用RNA干擾（RNA interference, RNAi）針對(duì)一種得到很好研究的癌癥藥物靶標(biāo)的研究結(jié)果1。但是對(duì)作為一種篩選工具的RNAi而言，這是將它釘在棺材里的最后一顆釘子嗎？RNA干擾，圖片來自Richard Robinson from Wikipedia。 大量的RNAi研究已證實(shí)編碼一種蛋白激酶的基因MELK對(duì)癌細(xì)胞是必需的。當(dāng)美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室的研究人員著手證實(shí)癌細(xì)胞對(duì)MELK基因

2、的依賴性時(shí)，他們并未期待會(huì)有什么意料之外的發(fā)現(xiàn)。但是，他們隨后發(fā)現(xiàn)利用基因編輯工具-Cas9剔除MELK基因并未對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生顯著的影響1。這就與之前的RNAi研究結(jié)果完全相反。 當(dāng)這項(xiàng)研究上個(gè)月發(fā)表在eLife期刊上1時(shí)，美國桑福德-伯納姆-普利貝斯醫(yī)學(xué)探索研究所癌癥研究員Alexey Terskikh（未參與這項(xiàng)研究）告訴科學(xué)家雜志，“這是一項(xiàng)精心設(shè)計(jì)的研究?！彼a(bǔ)充道，它提供一個(gè)例子說明“為何人們應(yīng)當(dāng)采用CRISPR作為一種更加嚴(yán)格的方法來解決他們提出的問題?！?這項(xiàng)研究絕對(duì)不會(huì)是駁斥基于RNAi實(shí)驗(yàn)獲得的關(guān)于必需基因和潛在的藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)的第一項(xiàng)研究。相反，它進(jìn)一步證實(shí)了多年來的報(bào)道：R

3、NAi技術(shù)存在重現(xiàn)性差、具有脫靶效應(yīng)以及有時(shí)會(huì)導(dǎo)致完全錯(cuò)誤的結(jié)果。 在提到發(fā)表在eLife期刊上的關(guān)于MELK的這篇論文破壞了人們對(duì)RNAi技術(shù)的信心時(shí)，美國斯坦福大學(xué)的Michael Bassik說，“恰當(dāng)?shù)卣f，RNAi長期以來就存在問題。在某種程度上而言，這項(xiàng)研究確實(shí)破壞了人們的信心。當(dāng)然，如果你閱讀了這篇論文，想知道，我應(yīng)當(dāng)采用RNAi篩選還是CRISPR篩選？那么答案就是全部采用CRISPR篩選。” 但是它意味著利用RNAi鑒定新的藥物靶標(biāo)之路終結(jié)了？不一定。Bassik說，“在發(fā)表這類籠統(tǒng)的觀點(diǎn)時(shí)，你必需非常小心?！彼a(bǔ)充道，RNAi盔甲上的這個(gè)最新的裂縫“并不意味著RNAi篩選在鑒

4、定藥物相互作用時(shí)它是無用的?！眽拿?RNAi技術(shù)利用小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA）觸發(fā)具有互補(bǔ)序列的靶mRNA（即信使RNA）降解，因而抑制細(xì)胞中的特定基因表達(dá)。在2007年左右，這種技術(shù)在鑒定藥物靶標(biāo)上非常流行，此后，全基因組RNAi篩選準(zhǔn)確找出與對(duì)化療藥物敏感性增加相關(guān)的基因2。 但是RNAi的作用機(jī)制是非常不精確的。荷蘭癌癥研究所的Ren Bernards（他的實(shí)驗(yàn)室使用過CRISPR和RNAi）說，到目前為止，“我認(rèn)為每個(gè)人都應(yīng)注意RNAi的脫靶效應(yīng)。它是這種技術(shù)的最大缺點(diǎn)?！睂?dǎo)入的RNA分子不僅較低特異性地與脫靶轉(zhuǎn)錄本序列相互作用3，而且它們也不可預(yù)測地干擾

5、調(diào)節(jié)基因表達(dá)的細(xì)胞機(jī)制。 Bassik說，“這能夠產(chǎn)生非常廣泛的影響”，并且補(bǔ)充道，當(dāng)這些影響具有毒性時(shí)，研究人員可能最終對(duì)一種基因在細(xì)胞中的作用形成錯(cuò)誤的看法，“有大量的例子表明制藥公司優(yōu)先利用RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果來尋找藥物靶標(biāo)，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)這些結(jié)果是錯(cuò)誤的?！?最為聲名狼藉的被錯(cuò)誤識(shí)別的藥物靶標(biāo)之一是蛋白激酶STK33。2009年，研究人員已鑒定出STK33是攜帶著一種已知的癌基因突變的人癌細(xì)胞的活力所必需的。這項(xiàng)原始的研究的結(jié)果并不能夠在其他的實(shí)驗(yàn)室中得到重復(fù)，隨后經(jīng)證實(shí)，它一點(diǎn)也不是必需的5，不過在此之前，它作為一種潛在的藥物靶標(biāo)吸引了制藥行業(yè)的大量關(guān)注。 此后，隨著CRISPR-基因編輯技

6、術(shù)變得越來越精確，在尋找新的藥物靶標(biāo)時(shí)，人們對(duì)這種技術(shù)替換RNAi的潛力具有也越來越濃的興趣5。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室（包括Bassik團(tuán)隊(duì)和Bernards團(tuán)隊(duì)）最近利用這兩種技術(shù)開展的篩選進(jìn)行面對(duì)面的比較。 Bernards說，“當(dāng)我們采用CRISPR試劑時(shí)，脫靶效應(yīng)明顯不那么嚴(yán)重。這種技術(shù)具有更好的選擇性?！彼a(bǔ)充道，根據(jù)他的團(tuán)隊(duì)對(duì)這種方法的可重復(fù)性的比較結(jié)果，“明顯的是，CRISPR篩選具有更少的干擾結(jié)果。我認(rèn)為每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都得出了相同的結(jié)論?！?美國哈佛醫(yī)學(xué)院的Tim Mitchison（之前研究過MELK）說，結(jié)果就是，一些實(shí)驗(yàn)室“真地拋棄了RNAi，而選擇了CRISPR。很多人認(rèn)為CRISPR

7、發(fā)揮得更好?！边€不是最終結(jié)局 盡管明顯對(duì)RNAi篩選缺乏信心，很多研究人員迄今為止并不準(zhǔn)備在藥物靶標(biāo)鑒別上放棄這種技術(shù)。RNAi敲降（RNAi knockdown）和CRISPR敲除的工作機(jī)制不同：前者部分抑制基因表達(dá)，而后者完全抑制基因表達(dá)。當(dāng)考慮藥物開發(fā)時(shí)，這一區(qū)別變得非常重要。 Bernards注意到，“對(duì)任何一種藥物而言，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)100%的抑制是非常罕見的。你可以認(rèn)為如果你需要完全清除所有的靶蛋白來產(chǎn)生一種表型，那么藥物產(chǎn)生這種情形的可能性到底有多大？答案很可能是不太可能的。” 他補(bǔ)充道，就目前而言，RNAi可能在這個(gè)方面具有優(yōu)勢，不過CRISPR可能很快會(huì)趕上，這多虧CRISPR干

8、擾（CRISPR interference, CRISPRi）技術(shù)6。CRISPRi是一種利用CRISPR的特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄受到的部分抑制。 一些研究人員認(rèn)為盡管存在一些挫折，RNAi可能仍然有用的另一種原因在于相比于在應(yīng)用時(shí)有時(shí)使用的有缺陷的方法，過去的錯(cuò)誤更少地反映在這種技術(shù)上。Bernards解釋道，在理想情形下，RNAi敲降結(jié)果應(yīng)當(dāng)會(huì)利用研究人員稱作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的方法加以驗(yàn)證。 他說，“你導(dǎo)入抵抗RNAi的基因版本，比如，靶位點(diǎn)序列發(fā)生突變的基因版本，觀察這是否會(huì)拯救這種表型”，并且補(bǔ)充道，這個(gè)過程在很多針對(duì)潛在藥物靶標(biāo)的RNAi研究中缺乏了，“如果你不這樣做，那么你會(huì)給自己帶來潛在的麻

9、煩?！保ê翢o意外的是，2013年， MELK在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中接受拯救治療7。） 當(dāng)然，CRISPR仍然有它自己的問題。美國斯隆凱特林癌癥紀(jì)念中心RNAi核心機(jī)構(gòu)主任Ralph Garippa注意到，僅最近將核酸切割酶Cas9引導(dǎo)到基因組中的特定位點(diǎn)上的向?qū)NA（gRNA）文庫進(jìn)行改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了較少的脫靶效應(yīng)8。與此同時(shí)，他強(qiáng)調(diào)道，“脫靶效應(yīng)不是歸于零，而不是變得更少”，并且補(bǔ)充道RNAi文庫繼續(xù)得到改善。Garippa告訴科學(xué)家雜志，“對(duì)于任何新出現(xiàn)的技術(shù)，你必須想方設(shè)法克服它的細(xì)微差別和缺點(diǎn)?！?與此同時(shí)，一種顯而易見的解決靶標(biāo)鑒定和驗(yàn)證問題的方法是在進(jìn)行臨床研究之前，利用CRISPR和

10、RNAi而不是利用單個(gè)方法驗(yàn)證靶標(biāo)。Bernards說，“我們針對(duì)人基因組中的每個(gè)基因使用CRISPR和短發(fā)夾RNA試劑。因此，當(dāng)我們利用CRISPR觀察到一種表型時(shí)，我們利用短發(fā)夾RNA進(jìn)行驗(yàn)證，反之亦然。我認(rèn)為這將是比較理想的。”（賽業(yè)生物）相關(guān)新聞閱讀：1.CRISPR/Cas9 mutagenesis invalidates a putative cancer dependency targeted in on-going clinical trials eLife, Published March 24, 2017, doi:10.7554/eLife.241792.Syntheti

11、c lethal screen identification of chemosensitizer loci in cancer cells Nature, 12 April 2007, doi:10.1038/nature056973.Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt8313.Synthetic Lethal Interaction between Oncogenic KRAS Dependency and STK33 Su

12、ppression in Human Cancer Cells Cell, 29 May 2009, doi:10.1016/j.cell.2009.03.0174.STK33 Kinase Is Not Essential in KRAS-Dependent CellsLetter Cancer Research, December 2011, doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-24955.Screening with CRISPR6.Dial It Up, Dial It Down7.Maternal Embryonic Leucine Zipper Kinase (MELK) Reduces Replication Stress in Glioblastoma Cells The Journal of Biological Chemistry, August 16, 2013, doi:10.1074/jbc.M113.8.Optimized sgRNA design to maximize activity a