第三章 水草組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局及基本技術(shù)

1、第三章 水草組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局及基本技術(shù) 組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及基本技術(shù)基本實(shí)驗(yàn)室輔助實(shí)驗(yàn)室一、實(shí)驗(yàn)室組成準(zhǔn)備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫 室生化分析實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺(tái)擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺(tái)無菌臺(tái)擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門準(zhǔn)備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室緩沖室培養(yǎng)室無菌室（一）無菌室（二）二、儀器設(shè)備1、基本儀器設(shè)備 冰箱、電（磁）爐、酸度計(jì)、純水器、天平、移液器、解剖鏡、光照培養(yǎng)箱、搖床、生化培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等。冰箱酸度計(jì)電爐天平純水器培養(yǎng)基分裝器攪拌器2、滅

2、菌設(shè)備 蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。蒸汽壓力滅菌鍋干熱消毒柜無菌瓶頂過濾裝置噴霧消毒器3、無菌操作設(shè)備 超凈工作臺(tái)無菌接種箱4、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備 搖 床培養(yǎng)架HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱 150C250D光照培養(yǎng)箱 5、細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備 光學(xué)顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶2、金屬材質(zhì)用具鑷子解剖刀接種針?biāo)摹⑾礈旒夹g(shù)1、玻璃器皿洗滌新購置玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用已用過的玻璃器皿2、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開即用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%5%

3、鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用3、金屬用品洗滌熱洗衣粉水洗凈沖洗擦干五、滅菌技術(shù)物理方法：物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、過濾除菌等化學(xué)方法：消毒劑、抗菌素滅菌1、滅菌方法2、滅菌（1）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法 壓力在9.810410.8104Pa 溫度在121 滅菌2030min（2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌 干熱消毒滅菌飽和蒸汽壓力與其對(duì)應(yīng)的溫度飽和蒸汽壓力溫度（）飽和蒸汽壓力溫度（）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112

4、.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6（3）塑料器皿滅菌： 多采用高壓蒸汽消毒滅菌（4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用（5）接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈工作臺(tái)紫外燈照射70%75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種紫外燈照射（6）外植體滅菌流水沖洗1020min或更長時(shí)間70%75%酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗4-5次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡

5、30min左右備用常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑使用濃度（%）去除難易消毒時(shí)間（min）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9102飽和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易最易較難易中較難5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好較好好六、無菌操作實(shí)驗(yàn)員消毒實(shí)驗(yàn)室、無菌臺(tái)滅菌實(shí)驗(yàn)器材的滅菌無菌接種消 毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)衛(wèi)生培養(yǎng)室培養(yǎng)1、消毒，更換實(shí)驗(yàn)服、帽子與鞋子，進(jìn)入接種室。2、打開超凈工作臺(tái)和無菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后關(guān)閉。3、開啟過濾室風(fēng)機(jī)，使無菌風(fēng)吹拂工作臺(tái)面和四周的臺(tái)壁。4、用70%75%的酒精擦

6、拭工作臺(tái)和雙手。5、用沾有70%75%酒精的紗布擦拭盛培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進(jìn)工作臺(tái)。6、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精燈火焰附近切割備用的接種材料。8、打開瓶口，用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口使瓶口各部分都燒到。9、取下接種器械，在火焰上消毒。10、把培養(yǎng)材料放入培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口。11、接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺(tái)。注意：操作期間應(yīng)經(jīng)常用70%75%的酒精擦拭工作臺(tái)和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。第二節(jié)培養(yǎng)基的成分與配制技術(shù) 一、環(huán)境條件 與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的外植體的生長要受到溫度、光照、濕度等各種物理?xiàng)l件

7、，不同氣體、培養(yǎng)基的組成、pH值和滲透壓等各種化學(xué)條件，以及外植體部位、大小、細(xì)胞密度等各種生物條件等環(huán)境條件的影響。如何根據(jù)需要來控制培養(yǎng)條件是組織培養(yǎng)中的一個(gè)重要問題。溫度光照濕度氣體滲透壓pH值一般最適溫度在252之間環(huán)境條件最常用的是光照16h，黑暗8h 一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對(duì)濕度應(yīng)達(dá)100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對(duì)濕度在70%80% 氧氣是愈傷組織生長所必需的 調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手 培養(yǎng)基的pH值大多在，二、營養(yǎng)成分 植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝

8、；元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡點(diǎn)等化學(xué)方面的作用；發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成。Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn):阿隆和斯托德 A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史;B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補(bǔ)充該元素來預(yù)防和恢復(fù);C、該元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進(jìn)而產(chǎn)生的間接效果。 國內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有16（17）種： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）

9、 在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時(shí)期、不同條件下含量也不同。根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下有的只含 Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種按照國際植物生理協(xié)會(huì)的建議： 所需濃度 的元素為大量元素 所需濃度 的元素為微量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動(dòng)中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。 K對(duì)碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。1、大量元

10、素Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對(duì)核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對(duì)細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。2、微量元素 在微量元素中，鐵的使用最大： 一些氧化酶的組成成分 葉綠素形成的必要條件 使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀 硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運(yùn)輸有著密切的關(guān)系。 銅是某些氧化酶的成分，能夠促進(jìn)離體根的生長。 錳參與植物的光合、呼吸代謝。 鉬參與氮素的代謝。 氯是光合作用水光解的活化劑。 微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。缺鐵癥

11、狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢(shì)發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨~緣枯焦，引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時(shí)，新梢頂端枯死。 桃樹缺銅癥狀： 新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)至擴(kuò)大變成深褐色，引起落葉。枝頂端生長不良，其下部的芽開始生長，形成叢生的細(xì)枝。 菊花缺錳癥狀： 葉脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開始。 菜豆梨缺錳癥缺鉬癥狀：葉較小，葉脈間失綠,有壞死斑點(diǎn)，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時(shí)葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。 白菜缺硼癥狀：受精不良，籽粒減少 ，“花而不實(shí)”， “蕾而不花”；根尖、莖尖的生長點(diǎn)停止生長，而形成簇生狀；常引起各種腐

12、爛病。 馬鈴薯缺鋅癥狀： 小葉病，葉片變小，兩節(jié)之間縮短。葉脈間失去綠色或者變白。植物缺素癥缺氮：首先表現(xiàn)在老葉上均一的缺綠現(xiàn)象；缺磷：老葉片發(fā)藍(lán)稍帶紫色，葉緣變?yōu)樽霞t色，葉尖枯死；缺鉀：先表現(xiàn)在老葉斑駁的缺綠癥狀葉緣枯黃，卷曲皺縮，莖的節(jié)間變短；缺鈣：新葉葉片變小、枯死，即干燒心；缺硫：首先表現(xiàn)為新葉葉片缺綠或發(fā)紫；缺錳：新葉脈間失綠；缺鐵：葉片黃，葉脈綠；缺硼：頂呀和附近的嫩葉變黑壞死，生長矮化，叢枝；缺鋅：老葉脈間缺綠，出現(xiàn)白色壞死斑；缺銅：新葉上由葉尖沿葉緣逐漸壞死，嚴(yán)重整葉萎蔫過早脫落；缺鉬：不能形成花器或花早落。 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院3、碳源 碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物

13、質(zhì)和有機(jī)酸，以糖類物質(zhì)最重要。 糖類物質(zhì)特點(diǎn)： 具有遇熱易變 利于吸收和利用 使用濃度一般在2%-5% 提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓 4、維生素類 以各種輔酶的形式存在 參與多種代謝活動(dòng) 對(duì)生長，分化等有很好的促進(jìn)作用 主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素 常用維生素有VB1和VB6 5、肌醇 環(huán)己六醇 細(xì)胞壁的構(gòu)建材料 參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動(dòng) 促進(jìn)活性物質(zhì)發(fā)揮作用蛋白質(zhì)的組成成分 有機(jī)氮源 可直接被細(xì)胞吸收利用培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸6、氨基酸促進(jìn)某些愈傷組織和器官的生長 化學(xué)成分不明、復(fù)雜 天然營養(yǎng)混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物7、天然復(fù)合物8、瓊脂 是使用最普遍的凝

14、固劑用量一般在6-10g/L之間顏色以淺、透明度高的好，潔凈為上品 除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用卡拉膠、瓊脂糖、結(jié)冷膠等。9、活性炭 吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì) 抑制外植體褐變 防止玻璃苗的產(chǎn)生 促進(jìn)培養(yǎng)物生長和分化 促進(jìn)生根10、抗生素 防止外植體內(nèi)生菌造成的污染活性炭促進(jìn)細(xì)胞伸長和分裂 促進(jìn)生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、頂端優(yōu)勢(shì)、單性結(jié)實(shí) 誘導(dǎo)愈傷組織形成 溶于95%酒精或的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生長素： IAA(吲哆乙酸) NAA (奈乙酸 ) 2,4-D(二氯苯氧乙酸) IBA(吲哆丁酸)11、生長素類 促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化 誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的

15、形成 延緩組織的衰老并增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成 用于離體成花的調(diào)控 溶于的鹽酸或稀薄的NaOH中 常用的細(xì)胞分裂素： KT (激動(dòng)素) BA(6-卞基腺嘌呤) 2-ip(異戊烯氨基嘌呤)玉米素12、細(xì)胞分裂素類 A、赤霉素類 組織培養(yǎng)中不常使用 加速細(xì)胞的伸長生長 促進(jìn)細(xì)胞的分裂 主要是GA3 B、脫落酸(ABA) 抑制細(xì)胞分裂和伸長 促進(jìn)脫落和衰老 促進(jìn)休眠和提高抗逆能力13、赤霉素類和脫落酸培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基其作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基 營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的種類第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌技術(shù)及培養(yǎng)條件1、

16、MS培養(yǎng)基 無機(jī)鹽濃度高 高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽 含有一定數(shù)量的銨鹽 營養(yǎng)豐富 不需要添加更多的有機(jī)附加物二、幾種常見培養(yǎng)基的特點(diǎn)2、White培養(yǎng)基 1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)。 1963年作了改良，提高M(jìn)gSO4的濃度和增加硼元素 無機(jī)鹽濃度較低 使用廣泛 在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果。大量元素含量微量元素含量鐵鹽含量有機(jī)物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0煙酸0.3瓊脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0鹽酸硫胺素0.1NaH

17、2PO4 4H2O16.5MoO30.0001鹽酸吡哆辛0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：White培養(yǎng)基3、B5培養(yǎng)基 1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì) 含有較低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素組成成分 數(shù)量(mg/l）組成成分 數(shù)量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇100 H3BO4 3.0 煙酸 1.0 MnSO44H2O 10 鹽酸吡哆醇 1

18、.0 ZnSO47H2O 2.0 激動(dòng)素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 鹽酸硫銨素 10 Na2-EDTA37.3 B5培養(yǎng)基的組成和配方4、N6培養(yǎng)基 1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì) KNO3和（NH4）SO4含量高，不含鉬組成成分 數(shù)量(mg/l) 組成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 煙酸 0.5 KI 0.8 鹽酸吡哆醇

19、 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 鹽酸硫銨 1.0 ZnSO47H2O 1.5N6培養(yǎng)基組成及配方配制培養(yǎng)基應(yīng)做好幾點(diǎn)工作：1、實(shí)驗(yàn)用具的準(zhǔn)備。包括配制過程中所需電爐、酸度計(jì)、高壓滅菌鍋等設(shè)備及其他玻璃器皿的清洗和準(zhǔn)備。2、試劑、藥品的準(zhǔn)備3、根據(jù)培養(yǎng)基的配方、母液擴(kuò)大倍數(shù)及需要配制的培養(yǎng)基體積計(jì)算所需各種母液及其他附加物的量。三、培養(yǎng)基的配制具體操作如下：1、取規(guī)定數(shù)量的糖源和凝固劑置于燒杯或搪瓷鍋內(nèi)，加蒸餾水加熱使之溶解，并不斷攪拌；2、根據(jù)計(jì)算所需量依次加入大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液及其他特殊的附加物，攪拌均勻；3、加水定容

20、至規(guī)定體積，攪拌均勻；4、調(diào)整培養(yǎng)基的pH值；5、分裝（倒）；6、封口（擰蓋）。 培養(yǎng)基分裝封口后立刻進(jìn)行滅菌，至少在24h內(nèi)完成滅菌程序。 一般采用的是高壓蒸汽滅菌。四、培養(yǎng)基的滅菌 滅菌鍋有很多種，實(shí)驗(yàn)室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時(shí)要注意一下幾點(diǎn)：1、鍋中應(yīng)放足量的水，以免造成空燒或干燒；2、裝鍋時(shí)不要過度傾斜，可保持內(nèi)部有一定的空 間，利于蒸汽流動(dòng)；3、增壓前高壓鍋內(nèi)的空氣必須排凈，否則易影響 滅菌效果；4、滅菌過程中，應(yīng)盡量保持壓力恒定，嚴(yán)格遵守滅菌時(shí)間；5、排氣降壓時(shí)應(yīng)緩慢進(jìn)行；6、只有待高壓鍋內(nèi)壓力表指針恢復(fù)到零后，才能開啟壓力鍋；7、高壓鍋工作時(shí)，應(yīng)有專人看守。高壓滅菌的原

21、理 在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。 注意事項(xiàng) 完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到時(shí),開始計(jì)時(shí)，維持壓力0.15MPa 20分鐘。 在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易

22、凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出226kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。 在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。 如果壓力未降到0時(shí)，打開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院 滅菌后的培養(yǎng)基經(jīng)冷卻

23、和凝固后即可使用檢驗(yàn)滅菌效果。 檢驗(yàn)方法： 將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室中3天，若沒有污染現(xiàn)象，說明滅菌可靠，可以使用。 保存在低溫條件下。常溫下保存時(shí)要進(jìn)行防塵和避光處理。 保存時(shí)間不可過長。五、培養(yǎng)基的保存第四節(jié) 外植體的選擇和滅菌 一、 外植體的選擇 二、 外植體的滅菌方法 三、 污染原因和預(yù)防措施 一、外植體的選擇 植物組織培養(yǎng)的主要過程大致包括：外植體的選擇、培養(yǎng)基的制備、器具的消毒、無菌操作和環(huán)境條件的調(diào)控。 1、選擇優(yōu)良的種質(zhì) 無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，或者是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)，或特殊的基因型。對(duì)材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性

24、，提高成功機(jī)率，增加其實(shí)用價(jià)值。 2、選擇健壯的植株 組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，選取發(fā)育正常的器官或組織。因?yàn)檫@些器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，比較容易培養(yǎng)成功。3、選擇最適的時(shí)期 組織培養(yǎng)選擇材料時(shí)，要注意植物的生長季節(jié)和植物的生長發(fā)育階段。如快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長的最適時(shí)期取材，這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高。4、選取適宜的大小 建立無菌材料時(shí)，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。二、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的使用

25、和效果2、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的使用和效果滅菌劑使用濃度（%）清除的難易消毒時(shí)間效 果次氯酸鈣910易530很好次氯酸鈉2易530很好漂 白 粉飽和濃度易530很好氯 化 汞0.11較難210最好酒 精7075易0.22好過氧化氫1012最易515好溴 水12易210很好硝 酸 銀1較難530好抗 菌 素450mg/L中3060較好2、外植體的滅菌方法 外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進(jìn)行預(yù)處理。植物材料一般采取的預(yù)處理方法是：先對(duì)植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經(jīng)過預(yù)處理的植物材料，其表面仍有很多細(xì)菌和真菌，因此還需進(jìn)一步滅菌。

26、常規(guī)的表面滅菌處理方法把材料放進(jìn)70%的酒精中約30s。用0.1%的升汞（HgCl2）浸泡5 10min 。 或用10%的次氯酸鈉溶液浸泡10 15min。無菌蒸餾水沖洗35次。滅菌時(shí)進(jìn)行攪動(dòng)，使植物材料與滅菌劑有良好 的接觸。在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%的Tween20（吐溫） 或Tween80濕潤劑，則滅菌效果更好。 三、污染原因和預(yù)防措施1、污染的原因污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。污染的原因：從病原菌方面來分析主要有細(xì)菌及真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外植體帶菌、培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。細(xì)菌污染的特點(diǎn)：是在材

27、料附近的培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁和云霧狀痕跡。一般在接種后12天即可發(fā)現(xiàn)。原因：材料帶菌； 培養(yǎng)基滅菌不徹底； 操作人員未遵守操作規(guī)程。因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用70%酒精擦洗，鑷子、剪刀、接種針在使用前必須在火焰上燒紅。真菌污染的特點(diǎn)：培養(yǎng)瓶內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)白、黑或綠等不同顏色菌絲塊。在接種后310天才能發(fā)現(xiàn)。原因：周圍環(huán)境不清潔； 超凈工作臺(tái)的過濾裝置失效； 培養(yǎng)瓶等器皿的口徑過大。為了減少損失，提高工作效率，必須在每個(gè)操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生。 2、污染的預(yù)防措施發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時(shí)處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)境污染。對(duì)一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更為嚴(yán)格的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。

28、要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進(jìn)行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用?，F(xiàn)就根據(jù)污染途徑，闡述污染的幾個(gè)預(yù)防措施:1）防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無菌條件下對(duì) 枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。枝條 水洗凈 插入無糖的營養(yǎng)液或自來水 抽枝 以這種新抽的嫩枝條作為外植體 接種。這樣便可大大減少材料的污染。在無菌條件下對(duì)采自田間的枝條進(jìn)行暗培養(yǎng)，待 抽出徒長的黃化枝條時(shí)采枝，經(jīng)滅菌后接種也可明 顯減少污染。 （2）選擇合適的時(shí)間去田間采取外植體避免陰雨天去田間采取外植體。在晴天采取外植體時(shí)，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經(jīng)過日曬后可殺死部分細(xì)菌或真菌。 但目前對(duì)材料

29、內(nèi)部污染還沒有令人滿意的滅菌方法。在菌類長入組織內(nèi)部時(shí)，不但要除去上年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織，以收到一定的防污染效果。2）外植體的滅菌（1）多次滅菌法： 首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在）； 其次，將切好的外植體放入1.3%的次氯酸鹽溶液中，滅菌30min； 第三，在無菌蒸餾水中沖洗3-5次； 第四，將材料封閉在無菌的培養(yǎng)皿中過夜，保持一定溫度； 第五，次日將葉片用2.6%次氯酸鈉滅菌30min，然后用蒸餾水洗3-5次。（2）多種藥液交替浸泡法 對(duì)容易污染而難滅菌的材料：首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，表面不可附著污垢、灰塵，

30、用剪刀修剪掉外植體上無用的部分，剝?nèi)パ可削[片；第2，將材料放入70%酒精中滅菌數(shù)秒鐘；第3，在1：500Roccal B（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸5min；第4，放入5%10%次氯酸鈉溶液中并滴入“吐溫80”數(shù)滴，滅菌1530min，或浸入0.1%0.2%升汞溶液中并加入“吐溫80”數(shù)滴，滅菌510min；第5，用無菌水沖洗5次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無菌的鹽酸中浸片刻，再用無菌水沖洗數(shù)次。 3）玻璃器皿的滅菌濕熱滅菌法即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌時(shí)間可延長達(dá)25min30min。干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)行滅菌。煮沸滅菌即將玻璃器皿放入

31、水中煮沸進(jìn)行滅菌。4）金屬器械的滅菌 火焰滅菌法：即把金屬器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟應(yīng)當(dāng)在無菌操作過程中反復(fù)進(jìn)行。干熱滅菌法：即將擦洗干凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。 濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質(zhì)品，放入高壓鍋中，121C的溫度，滅菌20 min30min。5）布質(zhì)制品的滅菌 6）無菌操作室的滅菌 無菌操作室的地面、墻壁和工作臺(tái)的滅菌可用2%的新潔爾滅或70%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20-30min。使用前用70%的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏

32、蒸。7）操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無菌操作的程序進(jìn)行在接種前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好再在新潔爾滅溶液中浸泡10min，后用70%的酒精擦手，并用70%的酒精擦拭母種瓶表面進(jìn)行消毒，以防把微生物帶進(jìn)超凈工作臺(tái)。工作人員在接種時(shí)，最好不要感冒咳嗽和說話。操作人員操作動(dòng)作要熟練、動(dòng)作快、規(guī)范，這樣可以縮短操作時(shí)間，減少污染。如脫毒培養(yǎng)抽取莖尖很小，操作時(shí)間長了就會(huì)使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌。 小 結(jié)第一節(jié) 外植體的選擇 ：優(yōu)良種質(zhì)、健壯植株 、最適的時(shí)期、適宜的大小。 第二節(jié) 外植體的滅菌方法：9種常用滅菌藥劑的使用及其效果 、外植體的滅菌方法。第三節(jié) 污染原因和預(yù)防措施：

33、污染的原因、污染的預(yù)防措施（防止材料帶菌、外植體的滅菌、器皿與金屬器械的滅菌、布質(zhì)制品的滅菌、無菌操作室的滅菌、操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無菌操作的程序進(jìn)行）。 第五節(jié) 外植體的接種和培養(yǎng) 一、 外植體的接種 二、 培養(yǎng)條件 一、外植體的接種 外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料在無菌環(huán)境中切割或分離出器官、組織、細(xì)胞并轉(zhuǎn)入到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。 操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應(yīng)特別注意防止工作人員本身引起的污染。整個(gè)接種過程均須無菌操作：1操作人員需穿著經(jīng)消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。進(jìn)入接種室前，雙手必須進(jìn)行消

34、毒，用肥皂和水洗滌能達(dá)到良好的效果, 進(jìn)行操作前再用70%的酒精擦洗雙手。2操作期間經(jīng)常用70%的酒精擦拭雙手和臺(tái)面。特別注意防止“雙重傳遞”的污染，例如器械被手污染后又污染培養(yǎng)基等。3在打開培養(yǎng)瓶、三角瓶或試管時(shí)，最大的污染危險(xiǎn)是管口邊沿沾染的微生物落入管內(nèi)，解決這個(gè)問題，可在打開前用火焰燒瓶口。如果培養(yǎng)液接觸了瓶口，則瓶口要燒到足夠的熱度，以殺死存在的細(xì)菌。為避免灰塵污染瓶口，可用紙包扎瓶口和塞子，以遮蓋瓶子頸部和試管口，相對(duì)地減少污染機(jī)會(huì)。4工具用后及時(shí)消毒，避免交叉污染。5工作人員的呼吸也是污染的主要途徑。通常在平靜呼吸時(shí)細(xì)菌是很少的，但是談話或咳嗽時(shí)細(xì)菌便增多，因此操作過程應(yīng)禁止不必

35、要的談話并戴上口罩。6由于空氣中有灰塵，因此在操作時(shí)，仍要注意避免灰塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當(dāng)打開瓶子或試管時(shí)，應(yīng)拿成斜角，以免灰塵落入瓶中。刀、剪、鑷等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用時(shí)在火焰上消毒，待冷卻后使用。每次使用前均需進(jìn)行用具消毒。 二、外植體的培養(yǎng)條件 接種后的外植體應(yīng)送到培養(yǎng)室去培養(yǎng)。組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)之一就是在人工控制的環(huán)境條件下，使培養(yǎng)物生長發(fā)育，研究植物的生命活動(dòng)。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件要根據(jù)植物對(duì)環(huán)境條件的不同需求進(jìn)行調(diào)控。其中最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣和培養(yǎng)基的pH值等。1、光照 對(duì)離體培養(yǎng)物的生長發(fā)育，光照條件有重要的作用。通常對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)，在黑暗條件下有

36、利，在有光條件下培養(yǎng)的愈傷組織質(zhì)地和顏色也有不同。但分化器官需要光照，并隨著芽苗的生長需要加強(qiáng)光照。加強(qiáng)光照，可以使小苗生長健壯，促進(jìn)“異養(yǎng)”向“自養(yǎng)”轉(zhuǎn)化，提高移植的成活率。普通培養(yǎng)室要求每日光照12h-16h，光照強(qiáng)度1000lx-5000lx。如果培養(yǎng)材料要求在黑暗中生長，可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周圍，或置于暗室中培養(yǎng)。 2溫度 離體培養(yǎng)中對(duì)溫度的調(diào)控要比光照顯得更為突出。不同的植物有不同的最適生長溫度，大多數(shù)植物最適溫度在23C-32C之間。培養(yǎng)室一般所用的溫度是25C2C。低于15C或高于35C，對(duì)生長都是不利的。 3濕度 組織培養(yǎng)中的濕度影響主要有兩個(gè)方面，一是培養(yǎng)容

37、器內(nèi)的濕度，它的濕度條件?？杀ＷC100%。二是培養(yǎng)室的濕度，它的濕度變化隨季節(jié)和天氣而有很大變動(dòng)。濕度過高過低都是不利的，過低會(huì)造成培養(yǎng)基失水而干枯，或滲透壓升高，影響培養(yǎng)物的生長和分化；濕度過高會(huì)造成雜菌滋長，導(dǎo)致大量污染。因此，要求室內(nèi)保持70%-80%的相對(duì)濕度。4氧氣 植物組織培養(yǎng)中，外植體的呼吸需要氧氣。在液體培養(yǎng)中，振蕩培養(yǎng)是解決通氣的良好辦法。葡萄嫩莖接種48h馬鈴薯莖尖接種40d三、外植體的褐變及其預(yù)防措施 褐變：是指外植體在培養(yǎng)過程中自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放出褐色物質(zhì)，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。（一）褐變的概念 褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚

38、類化合物多少和多酚氧化酶活性有直接關(guān)系。酚類很不穩(wěn)定，溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水，醌類又會(huì)在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進(jìn)一步引起其他酶系統(tǒng)失活，從而導(dǎo)致組織代謝紊亂，生長停滯不前，最終衰老死亡。 （二）褐變的原因 植物材料不同，褐變的程度有所不同。（三）影響褐變的因素棗蝴蝶蘭蘋果環(huán)境、培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)接周期不同，褐變的程度不同。1、植物材料（1）基因型 不同種植物，同種植物不同類型、不同品種在組織培養(yǎng)中褐變發(fā)生的頻率、嚴(yán)重程度都存在很大差別。木本植物（木質(zhì)素）、單寧含量或色素含量高的植物容易發(fā)生褐變。這是因?yàn)榉宇惖奶擒栈衔?/p>

39、是木質(zhì)素、單寧和色素的合成前體，酚類化合物含量高，木質(zhì)素、單寧或色素形成就多，而酚類化合物含量高將導(dǎo)致褐變的發(fā)生，因此，木本植物一般比草本植物容易發(fā)生褐變。蘋 果苜 蓿 （2）材料年齡 幼齡材料一般都有比成齡材料褐變輕的趨勢(shì)。幼齡材料褐變較輕與其酚類化合物含量少有關(guān)。Chever 分析歐洲栗的酚類含量變化的結(jié)果表明，幼齡材料酚類化合物含量少，而成齡材料比較多。平吉成從山定子剛長成的實(shí)生苗上切取莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，接種后褐變很輕，隨著苗齡增長，褐變逐漸加重，取自成齡樹上的莖尖褐變就更嚴(yán)重。梨一年生枝、二年生枝接種3d（3）取材部位 Yu和Meredith在葡萄上發(fā)現(xiàn)從側(cè)生蔓切取莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，比從延長蔓

40、切取的莖尖更容易成活，進(jìn)一步分析酚類含量發(fā)現(xiàn)前者比后者少。而蘋果則頂芽作外植體褐變程度輕，比側(cè)芽容易成活。石竹和菊花也是頂端莖尖比側(cè)芽莖尖更容易成活。 （4）取材時(shí)期 多酚氧化酶活性和酚類含量基本是對(duì)應(yīng)的，春季較弱，隨著生長季節(jié)的到來，酶活性逐漸增強(qiáng)，因而有人認(rèn)為取材時(shí)期比取材部位更加重要。Chever報(bào)道，歐洲栗在3月15日-30日醌類物質(zhì)形成少，而在5月-6月醌類物質(zhì)明顯提高。 金冠蘋果莖尖小于時(shí)褐變嚴(yán)重,當(dāng)莖尖長度在5mm-15mm時(shí)褐變較輕,成活率可達(dá)85%。在多個(gè)蘋果品種上試驗(yàn)結(jié)果表明，用5mm-10mm長的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)效果最好，莖尖如果太小很容易發(fā)生褐變。另外，取外植體時(shí)還要考慮其

41、粗度，細(xì)的可切短些，粗的可切得長些。 （5）外植體大小 主要是光照與溫度。溫度過高或光照過強(qiáng)，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速外植體的褐變。2、培養(yǎng)條件 （1）培養(yǎng)基狀態(tài) 由于培養(yǎng)基中瓊脂的用量和pH值的高低不同，培養(yǎng)基可配成固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。許多試驗(yàn)證明，液體培養(yǎng)基可以有效克服外植體褐變，液體培養(yǎng)基再加上濾紙橋，效果就更好。在液體培養(yǎng)基中，外植體溢出的有毒物質(zhì)可以很快擴(kuò)散，因而對(duì)外植體造成的傷害較輕。3、培養(yǎng)基（2）無機(jī)鹽 在初代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度過高，酚類物質(zhì)將會(huì)大量外溢，導(dǎo)致外植體褐變。原因是無機(jī)鹽中的有些離子，如Mn2+、Cu2+是參與酚類合成與氧化酶類

42、的組成成分或輔因子，因此鹽濃度過高會(huì)增加這些酶的活性，酶又進(jìn)一步促進(jìn)酚類合成與氧化。 （3）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 初代培養(yǎng)處在黑暗條件下，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的存在是影響褐變的主要原因，此時(shí)去除生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可減輕褐變。細(xì)胞分裂素6-BA或KT不僅能促進(jìn)酚類化合物的合成，而且還能刺激多酚氧化酶的活性，這一現(xiàn)象在甘蔗的組織培養(yǎng)中明顯。而生長素類如2，4-D和IAA可延緩酚類化合物的合成，減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生。 （4）抗氧化劑 培養(yǎng)基中加入抗氧化劑可改變外植體周圍氧化還原電勢(shì)，從而抑制酚類氧化，減輕褐變。 （5）吸附劑 活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作為吸附劑可以去除酚類氧化造成的毒害效應(yīng)，這在東北紅豆杉、豬籠草

43、、鶴望蘭、杜鵑花、蘋果、桃和倒掛金鐘等植物上都有過報(bào)道。在倒掛金鐘莖尖培養(yǎng)中只加入0.01%PVP便對(duì)褐變有抑制作用。 （6）pH值 培養(yǎng)基的pH值較低時(shí)，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，從而抑制褐變。而pH值升高則明顯加重褐變。4、材料轉(zhuǎn)瓶周期 對(duì)于易褐變的材料，接種后轉(zhuǎn)瓶時(shí)間長，傷口周圍積累醌類物質(zhì)增多，褐變加重，以致全部死亡。而縮短轉(zhuǎn)瓶周期可減輕褐變。在山月桂樹的莖尖培養(yǎng)中，接種后12h24h，便轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，這之后的一周內(nèi)，每天轉(zhuǎn)一次瓶，褐變得到完全控制。在無刺黑莓上也有類似經(jīng)驗(yàn) 。（四）褐變的預(yù)防措施1選擇適宜的外植體 外植體應(yīng)選擇分生能力較強(qiáng)的材料。如采用實(shí)生苗莖尖、枝條頂芽

44、、幼胚等材料培養(yǎng)褐變程度比較輕。2采用適宜的培養(yǎng)基和光溫條件 培養(yǎng)基的無機(jī)鹽成分、蔗糖濃度、激素水平、溫度適宜及在黑暗條件下培養(yǎng)，或在取外植體之前對(duì)母株進(jìn)行遮光處理20d40d，可以顯著減輕材料的褐變。 3在培養(yǎng)基中加活性炭、抗氧化劑和其他抑制劑 在培養(yǎng)基中加入0.1%0.5%的活性炭對(duì)吸附酚類氧化物的效果很明顯。在許多熱帶樹木的組織培養(yǎng)中均曾觀察到活性炭防止外植體褐變的明顯效果。如在培養(yǎng)基中加抗壞血酸、血清白蛋白、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等抗氧化劑和其他抑制劑，或用它們進(jìn)行材料的預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)，可有效地預(yù)防醌類物質(zhì)的形成。4縮短轉(zhuǎn)瓶周期 這是組培中控制褐變常用且有效的方法。四、玻璃化現(xiàn)象 是指

45、組培苗出現(xiàn)葉、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小腫脹，失綠，葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表皮缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織；體內(nèi)含水量高，但干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低的現(xiàn)象。 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院（一）玻璃化苗的危害性 由于其組織畸形，吸收養(yǎng)料與光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很難繼續(xù)用作繼代培養(yǎng)和擴(kuò)大繁殖的材料；加上生根困難，很難移栽成活。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院（二）玻璃化的原因 玻璃化的起因是細(xì)胞生長過程中的環(huán)境變化。試管苗為了適應(yīng)變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。 產(chǎn)生玻璃化苗的因素主要有激素濃度、瓊脂用量、溫度、離子水平

46、、光照時(shí)間、通風(fēng)條件等。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院1、激素濃度 激素濃度增加尤其是細(xì)胞分裂素濃度提高（或細(xì)胞分裂素與生長素比例高），易導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院2、瓊脂濃度 培養(yǎng)基中瓊脂濃度低時(shí)玻璃化苗比例增加，水浸狀嚴(yán)重，苗向上長。隨著瓊脂濃度的增加，玻璃化苗比例減少，但由于硬化的培養(yǎng)基影響了養(yǎng)分的吸收，試管苗生長減慢，分蘗亦減少。因此，瓊脂的濃度一定要適當(dāng)。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院3、溫度 適宜的溫度可以使試管苗生長良好，當(dāng)溫度低時(shí)，容易形成玻璃化苗，溫度越低玻璃化苗的比例越高。溫度高時(shí)玻璃化苗減少，且發(fā)生的時(shí)間較晚。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院4、光照

47、時(shí)間 不同的植物對(duì)光照的要求不同，滿足植物的光照時(shí)間，試管苗才能生長正常。大多數(shù)植物在12h14h光照下都能生長良好，光照時(shí)數(shù)大于16h時(shí)，玻璃化苗的比例明顯增加。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院5、通風(fēng)條件 試管苗生長期間，要求有足夠的氣體交換，氣體交換的好壞取決于生長量、瓶內(nèi)空間、培養(yǎng)時(shí)間和瓶蓋種類。在一定容量的培養(yǎng)瓶內(nèi)，愈傷組織和試管苗生長越快，越容易形成玻璃化苗。如果培養(yǎng)瓶容量小，氣體交換不良，易發(fā)生玻璃化。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院6、離子水平 植物生長需要一定的礦物質(zhì)營養(yǎng)，但是，如果營養(yǎng)離子之間失去平衡，試管苗生長就會(huì)受到影響。植物種類不同，對(duì)礦物質(zhì)的量、離子形態(tài)、離子間的比例要

48、求不同。如果培養(yǎng)基中離子種類及其比例不適宜該種植物，玻璃化苗的比例就會(huì)增加。 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院（三）預(yù)防玻璃化的措施1適當(dāng)控制培養(yǎng)基中無機(jī)營養(yǎng)成分 大多數(shù)植物在MS培養(yǎng)基上生長良好，玻璃化苗的比例較低，主要是由于MS培養(yǎng)基的硝態(tài)氮、鈣、鋅、錳的含量較高的緣故。適當(dāng)增加培養(yǎng)基中鈣、鋅、錳、鉀、鐵、銅、鎂的含量，降低氮和氯元素比例，特別是降低銨態(tài)氮濃度，提高硝態(tài)氮濃度，可減少玻璃化苗的比例。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院2適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度 適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖的含量，可降低培養(yǎng)基中的滲透勢(shì)，減少外植體從培養(yǎng)基中可獲得的水分；而適當(dāng)提高培養(yǎng)基中瓊脂的含量，可降低培養(yǎng)基的

49、襯質(zhì)勢(shì)，造成細(xì)胞吸水阻遏，也可降低玻璃化。如將瓊脂濃度提高到1.1%時(shí)，洋薊的玻璃化苗完全消失。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院襯質(zhì)勢(shì)因襯質(zhì)成分表面吸附力(細(xì)胞膠體物質(zhì)親水性和毛細(xì)管對(duì)自由水束縛)而產(chǎn)生的水勢(shì)。由于某種原因而降低的水化學(xué)勢(shì)而言。吸附在土壤粒子和細(xì)胞壁微纖維上的水，可分為（1）基于土壤粒子表面強(qiáng)有力的吸附力，主要是23層的水分子；（2）表現(xiàn)為來自彎月形液面的表面張力的毛細(xì)管水；（3）表面電荷與水的氫結(jié)合所吸附的水。在這些情況下，作用力可使水的勢(shì)能降低。 滲透勢(shì) 溶液中由溶質(zhì)存在所產(chǎn)生的水勢(shì)。因?yàn)槿苜|(zhì)對(duì)水分子的吸附作用，使水的活性下降，所以和純水相比，含有溶質(zhì)的水做功的能力降低了，故

50、滲透勢(shì)為負(fù)值。細(xì)胞吸水情況取決于細(xì)胞水勢(shì)，典型的水勢(shì)是由三個(gè)勢(shì)組成的：w=+p+g w為細(xì)胞水勢(shì)，為滲透勢(shì)p為壓力勢(shì)，g為重力勢(shì)。滲透勢(shì)亦稱溶質(zhì)勢(shì)滲透勢(shì)是由于溶質(zhì)顆粒的存在，降低了水的自由能，因而其水勢(shì)低于純水的水勢(shì),這種水勢(shì)差即為滲透勢(shì)。因?yàn)榧兯畡?shì)被定為零，所以滲透勢(shì)為負(fù)值。某溶液滲透勢(shì)的絕對(duì)值與該溶液滲透壓的絕對(duì)值相等。在標(biāo)準(zhǔn)壓力下，溶液的滲透勢(shì)等于溶液的水勢(shì)，因?yàn)槿芤旱膲毫?shì)為0MPa。溶液的的滲透勢(shì)決定于溶液中溶質(zhì)顆?？倲?shù)。 3適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度 細(xì)胞分裂素和赤霉素可以促進(jìn)芽的分化，但是為了防止玻璃化現(xiàn)象，應(yīng)適當(dāng)減少其用量，或增加生長素的比例。在繼代培養(yǎng)時(shí)，要逐步減少細(xì)

51、胞分裂素的含量。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院4增加自然光照，控制光照時(shí)間 在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，玻璃苗放在自然光下幾天后莖、葉變紅，玻璃化逐漸消失。這是因?yàn)樽匀还庵械淖贤饩€能促進(jìn)試管苗成熟，加快木質(zhì)化。光照時(shí)間不宜太長，大多數(shù)植物以10h 14h為宜；光照強(qiáng)度在1500lx1800lx之間，就此可以滿足植物生長的要求。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院5控制好溫度 培養(yǎng)溫度要適合植物的正常生長發(fā)育。如果培養(yǎng)室的溫度過低，應(yīng)采取增溫措施。熱擊處理，可防止玻璃化的發(fā)生。如用40熱擊處理瑞香愈傷組織培養(yǎng)物可完全消除其再生苗的玻璃化，同時(shí)還能提高愈傷組織芽的分化頻率。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院6改善培養(yǎng)器皿

52、的氣體交換狀況如使用棉塞、濾紙片或通氣好的封口膜封口。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院7在培養(yǎng)基中添加其它物質(zhì) 在培養(yǎng)基中加入間苯三酚或根皮苷或其它添加物，可有效地減輕或防治試管苗玻璃化，如添加馬鈴薯法可降低油菜的玻璃化苗的產(chǎn)生頻率，而用多效唑或10mg/L的矮壯素可減少重瓣絲石竹試管苗玻璃化的發(fā)生；而添加1.5 g/L的聚乙稀醇成為防治蘋果砧木玻璃化的措施。在培養(yǎng)基中加入0.3%的活性炭還可降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對(duì)防止產(chǎn)生玻璃化有良好作用。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院第六節(jié) 試管苗的馴化與移栽一、試管苗的特點(diǎn)1.試管苗的生態(tài)環(huán)境 組織培養(yǎng)中培育出來的苗通常稱試管苗或組培苗。由于試管苗長期生長

53、在試管或三角瓶等培養(yǎng)器皿中，與外界環(huán)境隔離，形成了一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)。 與外界環(huán)境條件相比具有以下4大差異，即高溫、高濕、弱光和無菌。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院（1）高溫且恒溫 在植物試管苗整個(gè)生長過程中，通常均采用恒溫培養(yǎng)，即使某一階段稍有變動(dòng)，溫差也是極小的；并且在培養(yǎng)過程中，通常溫度控制在252，有的植物需將溫度控制得更高；而外界環(huán)境條件，溫度處于不斷變化之中，溫度的調(diào)節(jié)完全是由自然界太陽輻射的日輻射量決定的，溫差很大，而且一般不會(huì)達(dá)到252。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院（2）高濕 植物組織培養(yǎng)中試管或培養(yǎng)瓶內(nèi)的水分移動(dòng)有2條途徑，一是試管苗吸收的水分，從葉面氣孔蒸騰；二是培養(yǎng)基向外蒸發(fā)，而后水汽凝結(jié)又進(jìn)入培養(yǎng)基。這種循環(huán)就是培養(yǎng)瓶內(nèi)的水分循環(huán)，其循環(huán)的結(jié)果造成培養(yǎng)瓶內(nèi)空氣的相對(duì)濕度接近于100，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于培養(yǎng)瓶外的空氣濕度，所以試管苗的蒸騰量極小。可見培養(yǎng)瓶內(nèi)的水分狀態(tài)直接影響著試管苗的生長和各種生理活性。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院（3）弱光 組織培養(yǎng)中的光強(qiáng)與太陽光相比一般很弱，故幼苗一般生長也較弱，經(jīng)受不了太陽光的直接照射。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院（4）無菌 不僅培養(yǎng)基無菌，而且試管苗也無菌。在移栽過程中試管苗要經(jīng)歷由無菌向有菌的轉(zhuǎn)換。這一點(diǎn)若不注意，