干擾RNA文庫(kù)在功能基因篩選中的應(yīng)用課件

1、RNA干擾文庫(kù)及其應(yīng)用RNAi的概況SiRNA類(lèi)型RNAi文庫(kù)（RNAi library)RNAi文庫(kù)的分類(lèi)RNAi文庫(kù)的構(gòu)建策略RNAi文庫(kù)在功能基因組研究中的應(yīng)用RNAi library技術(shù)需要注意的問(wèn)題RNAi概況RNAi(RNA interference ，RNA干擾)：短雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)靶基因mRNA特異性降解，或阻止mRNA翻譯，產(chǎn)生基因沉默（gene silence)的現(xiàn)象。因此，又稱為knockdown。1995年，康乃爾大學(xué)的Su Guo用反義RNA技術(shù)抑制par-1基因時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)正義RNA（sense RNA）也能抑制C. elegans par-1基因表達(dá)。

2、1998年，Andrew Fire和Craig Mello揭示正義RNA抑制基因表達(dá)是由于混有雙鏈RNA。RNAi現(xiàn)象普遍存在動(dòng)植物體內(nèi)。發(fā)現(xiàn)植物中的21-25nt的RNA分子誘導(dǎo)PTGS（post-transciption gene silence，轉(zhuǎn)錄后基因沉默）。2001年，Emily等在果蠅中確定了降解dsRNA的關(guān)鍵酶，并命名為Dicer，此酶屬于RNaseIII家族，在進(jìn)化上保守。 SiRNA的類(lèi)型寡核苷酸SiRNA：人工合成、體外轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)：易于設(shè)計(jì)、合成昂貴、瞬時(shí)表達(dá)嗎啡啉核苷SiRNA：人工合成RNA類(lèi)似物。特點(diǎn)：結(jié)合力強(qiáng)，不易降解，效率高載體表達(dá)型SiRNA（細(xì)菌質(zhì)粒、病毒載

3、體）：基于表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。特點(diǎn)：穩(wěn)定表達(dá)、可大量擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染效率低，操作繁雜RNAi的機(jī)制細(xì)胞自然存在二種干擾RNAsiRNA（短干擾RNA）：19-25nt，由長(zhǎng)dsRNA裂解而成的小片段，誘導(dǎo)mRNA降解。 microRNA(miRNA) ：22nt，呈短發(fā)夾結(jié)構(gòu)（short hairpin RNA，shRNA），由miRNA前體酶解而成，抑制mRNA翻譯。線蟲(chóng)晚期miRNA的形成早期胚胎發(fā)育過(guò)程中miRNA參與細(xì)胞分化病毒或基因重組siRNA的形成及作用 RNAi 的基本過(guò)程：siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能量；RISC（RNA-induced sil

4、encing complex）形成：與RNAi輔助蛋白argonaute家族分子、RNA依賴性聚合酶結(jié)合形成RISC，消耗ATP能量； RISC 活化：siRNA解螺旋成單鏈，無(wú)活性的復(fù)合體轉(zhuǎn)變成活性形式；阻止翻譯或誘導(dǎo)mRNA降解：在siRNA引導(dǎo)下，RISC識(shí)別并切割互補(bǔ)的靶RNA，無(wú)需或消耗少量ATP。RNAi library人工構(gòu)建的一系列能對(duì)眾多基因表達(dá)進(jìn)行干擾的siRNA或shRNA文庫(kù)。RNAi library分類(lèi)已知基因RNAi library基因家族RNAi library信號(hào)通路RNAi library結(jié)構(gòu)域RNAi library全基因組RNAi library隨機(jī)序列R

5、NAi libraryRNAi library的構(gòu)建策略三種方案 化學(xué)合成 體外轉(zhuǎn)錄 體內(nèi)生物合成（采用RNA轉(zhuǎn)錄載體）（一）化學(xué)合成（二）體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA以人工合成的寡DNA片段為模板以cDNA基因?yàn)槟０澹ㄈw內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成用RNA轉(zhuǎn)錄載體（質(zhì)粒、病毒載體）構(gòu)建RNAi library通常采用Pol III啟動(dòng)子 U6或H1作為啟動(dòng)子Pol III啟動(dòng)子特點(diǎn)：總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開(kāi)始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到45個(gè)連續(xù)的U即終止，非常精確。（五）RNAi library的形式雙啟動(dòng)子互補(bǔ)形式串聯(lián)形式（tandem type）發(fā)夾形式（harpin type）siRNA文庫(kù)（

6、雙啟動(dòng)子互補(bǔ)）（四）構(gòu)建方法1、根據(jù)靶基因序列，人工合成序列特異DNA片段插入到RNA表達(dá)載體2、體外合成隨機(jī)簡(jiǎn)并DNA片段插入到表達(dá)載體中3、REGS（restriction enzyme generated siRNA)方法：cDNA片段文庫(kù)兩端接上限制性酶切位點(diǎn)，插入到表達(dá)載體中（常采用BsmB1、BspM1酶。4、miRNA前體序列替換方法shRNA文庫(kù)（特異DNA序列法）siRNA文庫(kù)（隨機(jī)序列法）REGS法miRNA前體序列替換方法發(fā)夾結(jié)構(gòu)SiRNA的抑制效率比串聯(lián)結(jié)構(gòu)的SiRNA的效率更高但發(fā)夾結(jié)構(gòu)SiRNA存在二個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題一是更難設(shè)計(jì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列二是有20-40%的發(fā)夾結(jié)構(gòu)在

7、細(xì)菌中會(huì)發(fā)生堿基突變MIYAGISHI M and TAIRA K的研究結(jié)果如何確定作用靶序列RNAi的特點(diǎn)：SiRNA的效率取決于mRNA序列隨機(jī)SiRNA只有20-40%有較好的效果對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，最有效的siRNAs是21-23個(gè)堿基大小、3端有兩個(gè)突出堿基的雙鏈RNA；而對(duì)非哺乳動(dòng)物，比較有效的是長(zhǎng)片段dsRNA。多種因素會(huì)影響SiRNA的效率，有必要建立靶序列的運(yùn)算法則設(shè)計(jì)原則：GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。 避免在5和3端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)設(shè)計(jì)siRNA 選用靶基因特異且保守的序列SiRNA的特異性取決于靶序列的特異性，與其他同源基因超過(guò)3nt/21nt差異，就有較高的特異性。少于1nt/21nt差異，有非特異作用設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNARNAi library的應(yīng)用基因功能分析胚胎發(fā)育與干細(xì)胞基因調(diào)控研究細(xì)胞增殖與分化基因調(diào)控研究細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移基因調(diào)控多基因疾病發(fā)病機(jī)制研究表觀遺傳學(xué)分析（RNAi可誘導(dǎo)基因甲基化）信號(hào)通路新分子的篩選與鑒定尋找新的藥物靶標(biāo)、基因治療藥物作用機(jī)制探討應(yīng)用RNAi library技術(shù)需要注意的問(wèn)題了