拓展視野　神奇的基因芯片 (2)

1、基因芯片技術(shù)及應(yīng)用現(xiàn)狀概述 指應(yīng)用大規(guī)模集成電路的微陣列技術(shù),在固相支持物表面有規(guī)律地合成數(shù)萬個(gè)代表不同基因的寡核苷酸“探針”。 或液相合成探針后由點(diǎn)樣器有規(guī)律地點(diǎn)樣于固相支持物表面,然后將要研究的目的材料中的DNA、RNA或cDNA用同位素或熒光物標(biāo)記后,與固相支持物表面的探針進(jìn)行雜交,通過放射自顯影或熒光共聚焦顯微鏡掃描,對(duì)這些雜交圖譜進(jìn)行檢測(cè),再利用計(jì)算機(jī)對(duì)每一個(gè)探針上的雜交信號(hào)作分析處理,得到目的材料中有關(guān)基因表達(dá)信息?；蛐酒夯蛐酒攸c(diǎn) 操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、多樣品并行處理、檢測(cè)效率高、應(yīng)用范圍廣、序列數(shù)量大、分析速度快、所需樣品數(shù)量少、操作污染少等許多優(yōu)點(diǎn)，在很大程度上彌補(bǔ)了

2、傳統(tǒng)核酸印跡雜交的許多不足。基因芯片的分類：按所用支持物不同 無機(jī)片基芯片：玻璃片、硅片等 有機(jī)合成片基芯片：硝酸纖維素膜、尼龍膜等按用途不同 基因表達(dá)譜芯片、診斷芯片、DNA測(cè)序芯片按芯片上固定的DNA種類不同 cDNA芯片和寡核苷酸芯片按制備方法不同 原位合成芯片和合成后交聯(lián)芯片(合成后點(diǎn)樣芯片)?；蛐酒夹g(shù)流程 探針的設(shè)計(jì)與制備 支持物的預(yù)處理 芯片的制作 點(diǎn)樣后處理 樣品的準(zhǔn)備 雜交與雜交后清洗 檢測(cè)分析1345762根據(jù)探針的來源和性質(zhì)可將其分 寡核苷酸探針、cDNA探針、基因組DNA探針等探針的設(shè)計(jì)可根據(jù)芯片應(yīng)用的目的按照常規(guī)分子生物學(xué)方法中的探針設(shè)計(jì)原則進(jìn)行。設(shè)計(jì)能與靶分子特異

3、結(jié)合的探針是基因芯片檢測(cè)特異性的關(guān)鍵。探針的設(shè)計(jì)與制備最常用的支持物：玻片常用的玻片預(yù)處理方法：采用多聚左旋賴氨酸或氨基硅烷包被的氨基化處理,以及醛基化處理等。支持物的預(yù)處理 芯片的制作目前基因芯片制作方法： 點(diǎn)樣法和原位合成法點(diǎn)樣法： 是通過機(jī)械手將合成的寡核苷酸探針或擴(kuò)增的cDNA逐點(diǎn)有序固定在玻片上,適合于制備中、低密度基因芯片。其特點(diǎn)是成本較低,但特異性受到一定的影響,不能滿足基因多態(tài)性檢測(cè)以及高精度基因表達(dá)譜檢測(cè)的需求。特點(diǎn): 是成本較低,但特異性受到一定的影響,不能滿足基因多態(tài)性檢測(cè)以及高精度基因表達(dá)譜檢測(cè)的需求。原位合成法： 按精確設(shè)計(jì)的分布和順序,運(yùn)用現(xiàn)代高精度儀器和DNA合成

4、技術(shù)在玻片上直接并行定點(diǎn)合成DNA探針,制成的高集成度的DNA微陣列通稱為“高密度基因芯片”。特點(diǎn): 支持物上集成了成千上萬的密集排列的基因探針,能夠在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因,使人們迅速地讀取遺傳密碼?？蓪?shí)現(xiàn)大批量、低成本的集約化生產(chǎn),制作成本將遠(yuǎn)低于點(diǎn)樣法制作的寡核苷酸基因芯片,并且重復(fù)性好。把探針固定在玻璃表面封閉玻片未點(diǎn)樣的區(qū)域：防止雜交時(shí)與樣品DNA非特異性結(jié)合。點(diǎn)樣后處理樣品的準(zhǔn)備 樣品的準(zhǔn)備過程包括從組織、細(xì)胞中分離純化核酸樣品,以及對(duì)待測(cè)樣品中的靶基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中,將耦聯(lián)了熒光染料(Cy3、Cy5等)的核苷酸摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物中,對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)記先預(yù)雜交,再加入含靶

5、基因的雜交液雜交,然后洗脫、干燥,以待檢測(cè)。預(yù)雜交目的：可將玻片上的自由氨基或醛基等活性基團(tuán)封閉或失活,以防標(biāo)記的樣品靶DNA與玻片上探針外的其他位點(diǎn)發(fā)生非特異性結(jié)合而消耗靶DNA并產(chǎn)生強(qiáng)的背景。洗掉未結(jié)合的探針,以防它們與結(jié)合到玻片上的探針競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合樣品中的靶DNA。雜交與雜交后清洗 影響芯片雜交的因素 雜交溫度： 探針： 序列組成： 探針的濃度： 靶基因序列的濃度： 雜交液的組分等： 芯片雜交及清洗后,帶有熒光標(biāo)記的靶DNA與互補(bǔ)的DNA探針形成雜交體,在激光激發(fā)下產(chǎn)生熒光信號(hào)。通過掃描儀對(duì)熒光信檢測(cè)、分析,根據(jù)芯片上DNA探針的原始序列將樣品中靶DNA的信息反映出來。檢測(cè)分析基因芯片技

6、術(shù)的應(yīng)用 DNA序列測(cè)定、基因表達(dá)分析、基因組研究、基因診斷、藥物研究與開發(fā),以及工農(nóng)業(yè)、食品與環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在醫(yī)學(xué)診療方面的應(yīng)用用于病毒感染的診斷：對(duì)于遺傳變異較為頻繁的病毒的檢測(cè)，傳統(tǒng)方法工作程序復(fù)雜，不利快速診斷?；蛐酒n可快速、準(zhǔn)確地鑒別多種病原體，可用于高通量、大規(guī)模的病毒檢測(cè)。 陶生策等(2003)構(gòu)建了一套以基因芯片為基礎(chǔ)的SARS冠狀病毒基因分析檢測(cè)系統(tǒng)：首先從患者痰、血樣本中快速分離出SARS冠狀病毒的RNA,樣品經(jīng)過處理和標(biāo)記后,與固定在基因芯片上的DNA探針進(jìn)行雜交,通過對(duì)雜交結(jié)果的檢測(cè)和分析,最終可以確認(rèn)患者是否感染SARS冠狀病毒。實(shí)現(xiàn)了對(duì)非典(SAR

7、S)冠狀病毒感染患者的早期診斷。分離RNARNA-DNA雜交檢測(cè)分析在食品領(lǐng)域的作用 基因芯片技術(shù)可以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品：通過設(shè)計(jì)不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有很高的應(yīng)用價(jià)值，具有高通量、微型化、自動(dòng)化和信息化的特點(diǎn)，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的不足。 Mariotti等介紹了一種用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、基于DNA雜交原理的生物芯片SPR（Surface plasm on resonance）：?jiǎn)捂淒NA（ssDNA）探針被固定在SPR裝置芯片上，探針與目的成分序列的雜交可被監(jiān)控。含有轉(zhuǎn)基因目的序列的樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后，利用SPR生物芯片檢測(cè)，可定量出樣品中含2%的轉(zhuǎn)基因大豆粉

8、。DNA測(cè)序又稱DNA序列分析。就是將已經(jīng)熒光標(biāo)記的待測(cè)DNA樣品與基因芯片上的成千上萬的已知序列的探針雜交，若二者完全配對(duì)，則雜交信號(hào)較強(qiáng)；若有單個(gè)或多個(gè)堿基不配對(duì)，則信號(hào)較弱。目前基因芯片主要用于已知序列的重測(cè)序。Riki K和Julia B-S利用基因芯片技術(shù)測(cè)定了蕓苔植物基因中mRNA的序列,為揭示其轉(zhuǎn)錄規(guī)則作出了貢獻(xiàn)。藥物研究與開發(fā) 在中藥方面，對(duì)中藥（材）進(jìn)行鑒別: 將某種中藥品種的特定基因或DNA序列后作為探針固定于玻片上制成基因芯片。當(dāng)一個(gè)來自植物或動(dòng)物的中藥樣本中含有可以與之互補(bǔ)的特定基因片段時(shí),基因芯片即可以將其測(cè)試出來。環(huán)境檢測(cè)方面 個(gè)體的基因組成可以影響人體暴露到環(huán)境后

9、患病的危險(xiǎn)性,基因芯片可以反映出環(huán)境脅迫下來自不同個(gè)體的基因表達(dá)譜發(fā)生的變化,確定新的致突變、致畸、致癌物和藥物的毒性,改進(jìn)現(xiàn)有的檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?了解毒物的反應(yīng)機(jī)理。 基因表達(dá)信號(hào)能夠測(cè)定不同類型的組織特異基因,而且新的化合物能夠通過那些特征信號(hào)被篩選出來,通過基因芯片可以迅速地評(píng)價(jià)不同個(gè)體對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)新基因及基因多態(tài)性的檢測(cè) 基因芯片具有被檢目標(biāo)DNA密度高、樣品用量少、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)等，因此可用于大量篩選新基因，大大提高發(fā)現(xiàn)新基因的速度，利用該技術(shù)可高效、快速地發(fā)現(xiàn)新的基因。 SekiMetal利用各種發(fā)育時(shí)期，經(jīng)不同處理(干旱、冷害及未經(jīng)脅迫處理)的擬南芥構(gòu)建cDNA文庫(kù)，從中得到了1300個(gè)全長(zhǎng)的cDNA，并