病理學(xué)常用新技術(shù)原理及應(yīng)用-課件

1、第十八章 病理學(xué)常用新技術(shù)原理及應(yīng)用 汕大醫(yī)學(xué)院病理教研室 蘇敏 教授病理學(xué)的發(fā)展離不開病理技術(shù)的進(jìn)步，縱觀病理學(xué)的發(fā)展史，從器官病理學(xué)、細(xì)胞病理學(xué)、超微病理學(xué)、免疫病理學(xué)、分子病理學(xué)、遠(yuǎn)程病理學(xué)及當(dāng)今的計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)信息病理學(xué)。每一個發(fā)展階段都有新技術(shù)的革命。新技術(shù)使我們對疾病認(rèn)識更加深入切實。從大體、細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)、分子基因水平逐步深入，正如病理學(xué)前輩們所說：技術(shù)是病理學(xué)之母。 病理學(xué)技術(shù)包括傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代新技術(shù)。有人體病理學(xué)技術(shù)和實驗病理學(xué)技術(shù)，二者相互滲透，互為促進(jìn)，傳統(tǒng)的福爾馬林固定、石蠟切片、HE染色是病理學(xué)的基本技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床病理學(xué)工作。根據(jù)科研的發(fā)展，臨床病理學(xué)

2、的需要，又不斷產(chǎn)生新的技術(shù)。作為當(dāng)代的醫(yī)學(xué)生，要適應(yīng)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步、了解病理學(xué)研究和臨床實踐中的一些新技術(shù)是必不可少的。現(xiàn)介紹一些新技術(shù)方法，供同學(xué)們在以后的學(xué)習(xí)工作中參考。 第一節(jié) 組織與細(xì)胞化學(xué)檢查 組織與細(xì)胞化學(xué)檢查（Histochemistry and cytochemistry examination）是研究組織與細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的化學(xué)組成及其定位的科學(xué)。主要研究對象是生物大分子（如核酸、蛋白質(zhì)、酶、多糖和脂類等）在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能活動中的分布與變化以及亞細(xì)胞組分和細(xì)胞器在整個生命活動中的作用等。 細(xì)胞化學(xué)方法能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的各種成分進(jìn)行定性、定位、定量研究，包括懸浮胸腹水細(xì)胞

3、、血液細(xì)胞以及體外培養(yǎng)細(xì)胞均能產(chǎn)生同樣良好的效果。目前，用細(xì)胞化學(xué)技術(shù)所能顯示的化學(xué)成分有蛋白質(zhì)（顯示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基）、核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）、糖類（如糖原、粘多糖和糖脂等）、脂類（如中性脂肪、磷脂和固醇等）、酶（包括水解酶如磷酸酶）、特異抗原（其化學(xué)本質(zhì)可能是多肽、蛋白、糖蛋白等）、無機(jī)鹽和微量元素（如鐵、銅、鋅、鉆、鎂等）。 細(xì)胞化學(xué)染色的原理是細(xì)胞中的化學(xué)成分和其相應(yīng)的底物呈一系列的化學(xué)反應(yīng)，形成于顯微鏡下可見到的反應(yīng)產(chǎn)物。常見有：1孚爾根反應(yīng)法（Feulgen reaction）顯示DNA呈現(xiàn)紫紅色。2甲綠-派郎寧法（Methyl Green-Py

4、ronin method）顯示核酸（甲綠染DNA呈現(xiàn)綠色，派郎寧染RNA呈現(xiàn)紅色）3蘇丹冰凍切片染色顯示中性脂肪呈現(xiàn)橘紅色。4普魯士藍(lán)反應(yīng)顯示組織中含鐵血黃素。5過碘酸雪夫反應(yīng)（Periodic acid schiffreaction, PAS）顯示糖原和其它多糖物質(zhì)為紫紅色。 第二節(jié) 免疫組織與細(xì)胞化學(xué)檢查 一、原理與方法 免疫組織與細(xì)胞化學(xué)檢查（Immunohistochemistry and immunocytochemistry examination）是從組織與細(xì)胞化學(xué)方法衍生出來的。是在單克隆抗體技術(shù)產(chǎn)生后，利用免疫學(xué)原理，將抗原抗體反應(yīng)應(yīng)用與組織細(xì)胞化學(xué)而進(jìn)一步通過級連放大，增加

5、敏感性。最后用辣根過氧化物酶顯色。從而定位組織細(xì)胞中抗原（蛋白 多肽、酶）等多種基因產(chǎn)物的特異方法。在病理學(xué)外檢工作中可用于對不同來源，HE難以診斷的的腫瘤進(jìn)行確診和鑒別診斷。 其基本原理是應(yīng)用抗原與抗體接觸后可形成“抗原抗體復(fù)合物”的化學(xué)反應(yīng)，以檢測組織或細(xì)胞內(nèi)抗原（或抗體）的技術(shù)。 圖 GFAP陽性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 圖 體外神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)免疫組化GFAP陽性 二、免疫組織化學(xué)技術(shù)的主要步驟與常用標(biāo)記物 （一）主要步驟1提取抗原(免疫原Immuno-gen); 2用免疫原免疫動物(兔)制備抗血清(多克隆抗體) 或免疫動物(鼠)后，用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體；3純化抗體；4抗體標(biāo)記組織切片；5染

6、色反應(yīng)；6觀察結(jié)果。 （二）常用標(biāo)記物 1酶 為最常用的標(biāo)記物。作為標(biāo)記的酶應(yīng)具有以下條件：底物是特異性的，且易于顯示；酶反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，不易擴(kuò)散；容易獲得純酶分子且較穩(wěn)定；酶標(biāo)記抗體后，不影響兩者的活性；被檢組織中不應(yīng)存在內(nèi)源性相同的酶或其底物。常用的標(biāo)記酶有辣根過氧化物酶（HRP）、鹼性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。2熒光素 指在高能量光波的激發(fā)下能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。常用的有異硫氰酸熒光素（FITC）、四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（TRITC）。3生物素 其與卵白素的親和力明顯高于抗原抗體的結(jié)合力。4金屬標(biāo)記物 如鐵蛋白和膠體金。多用于免疫電鏡。 三常用免疫組織化學(xué)染色方法 （一）直接法

7、將熒光素(免疫熒光法)或酶直接標(biāo)記在第一抗體上，以檢查相應(yīng)的抗原。直接法具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點，但敏感性差，耗費(fèi)抗體多。 （二）間接法 先用熒光素或酶標(biāo)記第二抗體，一抗為特異性抗體， 二抗僅有種族特異性。特點: 預(yù)先標(biāo)好二抗，較方便； 比直接法敏感，但仍差。 （三）PAP法與雙PAP法： 既過氧化物酶抗過氧化物酶復(fù)合物法(Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先將過氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗；然后再與結(jié)合，形成一個穩(wěn)定的多角形結(jié)構(gòu)（PAP）。特點： 敏感性較高； 背景染色低（相對）； 雙PAP敏感性更高，但背景相對較重。

8、 （四）ABC法： 既卵白素生物素過氧化物酶復(fù)合物法(Avidin Biotin-peroxidase Complex,ABC) 利用卵白素與生物素特有的高度親和力，先將生物素與酶結(jié)合形成生物素化HRP，再以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成一個復(fù)合物；同時先將二抗生物素化。 如將卵白素?fù)Q成鏈霉親和素，則為： 法：(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex)將鏈霉親和素和生物素先連結(jié)起來，則稱： 法：labelled StreptAvidin-Biotin用鏈霉素抗生物素蛋白連結(jié)辣根過氧化物酶，則為： 法：(StreptAvidin Peroxida

9、se conjugataed method) 若用堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素則稱法。 若分別用堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，則稱法特點: 敏感性高，（比高倍）； 背景淡，鏈霉親和素更好； 方法較簡便，時間較短； 應(yīng)用范圍廣，也可用于原位雜交和免疫電鏡。 四免疫組織化學(xué)染色過程中需注意的有關(guān)事項 正確設(shè)置免疫組織化學(xué)的對照 對照原則：首先對照第一抗體；替代對照要注意相同的原則；陽性結(jié)果陰性對照，陰性結(jié)果陽性對照；染色清晰，定位準(zhǔn)確。 陰性對照：（）空白對照：用置換第一抗體；（）血清替代對照：用同種動物的正常血清代替第一抗體；（）抑制對照：用未標(biāo)記的抗體先和相應(yīng)的抗原結(jié)合；（）吸收對照：

10、用純化的抗原對抗體先行吸收；陽性對照：用已知或已被實驗證明為陽性的組織；自身對照：利用組織切片內(nèi)的各種不同的組織成分作對照。 2假陽性反應(yīng)： 非特異性反應(yīng)：邊緣現(xiàn)象、皺折和刀痕、出血和壞死等； 內(nèi)源性過氧化物酶：紅細(xì)胞、炎細(xì)胞、退變壞死細(xì)胞和某些腺上皮分泌物，以及某些富含過氧化物酶的組織，如腦、肝等； 抗體的交叉反應(yīng)：抗體本身含有與人體組織發(fā)生交叉反應(yīng)的成分； 試劑濃度過高或失效。 3假陰性反應(yīng)： 組織固定不當(dāng)或固定時間過長； 抗體效價過低或久置失效； 組織中抗原被粘稠基質(zhì)或分泌物阻隔； DAB或H2O2的濃度不當(dāng)。 五、免疫組織化學(xué)在腫瘤診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用 （一）在腫瘤診斷中應(yīng)用免疫組織

11、化學(xué)染色的原因：在常規(guī)病理活檢中,通常有的疑難病例不能明確診斷。形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的腫瘤可為不同的組織來源（如未分化癌和惡性淋巴瘤）因而難于識別，給治療帶來困難。 一些轉(zhuǎn)移性腫瘤常常缺乏特有的組織學(xué)特征，因而無法確定其原發(fā)病灶（如甲狀腺癌和前列腺癌）。 通過一些反映細(xì)胞增殖和與腫瘤惡性程度有關(guān)的標(biāo)記物協(xié)助識別腫瘤的良惡性。 （二）各種不同組織及其腫瘤常見的標(biāo)記物： 1上皮組織及其腫瘤標(biāo)記物：（）存在于所有上皮細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記物： 橋粒蛋白（desmoplakin） 細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin,）：一種中間絲蛋白 （）存在于大部分上皮細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記物： 角蛋白多肽（如）； 組織多肽抗原（tissue

12、 polypeptide antigen,）； 上皮細(xì)胞膜抗原（epithelial membrane antigen,）。（）選擇性存在于某些上皮細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記物： 角蛋白多肽（），癌胚抗原（）； 甲胎蛋白（），乳鐵蛋白（lecroferrin）； 前列腺特異性抗原（）及激素類等。 2間葉組織（軟組織）及其腫瘤標(biāo)記物： （）間葉源性腫瘤：波形蛋白（Vimentin）；（）纖維組織源性腫瘤：纖維瘤、肉瘤，惡纖組。 抗胰蛋白酶（1，）； 抗胰糜蛋白酶（，）； 溶菌酶（Lysozyme）。 3肌細(xì)胞及肌上皮腫瘤及其標(biāo)記物：肌瘤、肌肉瘤、肌上皮瘤。 結(jié)蛋白（Desmin），最常用，肌細(xì)胞分化最早的標(biāo)記

13、； 肌動蛋白（Actin），屬肌絲蛋白，種亞型分別存在于不同的肌細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞 肌球蛋白（Myosin），屬肌絲蛋白，分型（慢）和型（快）收縮纖維，存在于心肌、橫紋肌及平滑肌中，肌動蛋白和肌球蛋白均出現(xiàn)在肌細(xì)胞發(fā)育分化中期。 肌紅蛋白（Myoglobin），是心肌和橫紋肌結(jié)合氧的肌紅蛋白，存在于分化成熟的橫紋肌中。 內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤及其標(biāo)記物：血管內(nèi)皮肉瘤 第因子相關(guān)抗原（Factor -related Antigen,） 荊豆凝集素（Ulex Europaeus1 Lectin,）； 、等。 骨、軟骨和脂肪組織腫瘤及其標(biāo)記物： ，Vimentin陽性； Lysozyme少數(shù)陽性。 滑膜及間皮腫

14、瘤及其標(biāo)記物：雙向分化，無特異性標(biāo)記物。Keratin,EMA;Vimentin,FN,AAT,ACT,Lysozyme等均有可能陽性。 周圍神經(jīng)腫瘤及其標(biāo)記物： S-100：神經(jīng)纖維腫瘤，神經(jīng)鞘腫瘤。 髓性緘性蛋白（Myelin basic protein,MBA）； 髓鞘相關(guān)蛋白（MAG）； 層粘連蛋白（Laminin）。 8淋巴造血組織腫瘤及其標(biāo)記物： ()LCA（Leucocyte Common Antigen，白細(xì)胞共同抗原）；()、標(biāo)記淋巴細(xì)胞；()、標(biāo)記淋巴細(xì)胞；()、標(biāo)記組織細(xì)胞；()、（Ki-antigen）標(biāo)記細(xì)胞；()標(biāo)記單核細(xì)胞、粒細(xì)胞。 9神經(jīng)及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及其標(biāo)記

15、物： （）膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein, ）：膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞； （）髓鞘堿性蛋白（）：少枝細(xì)胞；（）神經(jīng)細(xì)胞烯醇化酶（ Neurun specific enolosa,）：神經(jīng)細(xì)胞；（）神經(jīng)微絲（Neurofilaments,）神經(jīng)細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、副節(jié)細(xì)胞、瘤； （）嗜鉻素（Chromogranin ）：神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。（）其它：、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、hGH、Insulin 、Serotonin等。 免疫組織化學(xué)最突出的優(yōu)點是能在微觀世界原位地確定組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，由于其方法簡便且可重復(fù)性強(qiáng)，

16、目前已得到廣泛的應(yīng)用，并正繼續(xù)向著更微細(xì)、更精確的原位分子雜交和免疫電鏡方向發(fā)展，向著分子病理學(xué)的領(lǐng)域推進(jìn)。 第三節(jié) 電子顯微鏡檢查 電子顯微鏡（electron microsocope）簡稱電鏡，是以電子束為照明源，通過電子流對生物樣品的透射以及電磁透鏡的多級放大后的熒光屏上成像的大型精密儀器。按工作原理和用途的不同可分為透射式電鏡（transmission electron microscope, TEM）和掃描式電鏡（scanning electron microscope, SEM）二種基本類型。 圖 食管癌細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 一透射式電鏡 主要用于觀察細(xì)胞內(nèi)部的微細(xì)結(jié)構(gòu)，由于電子

17、的穿透力較弱，故用于透射電鏡觀察的標(biāo)本必須切成50100nm的超薄切片。換句話說，一個細(xì)胞要被切成100200個薄片才適于在透射電鏡下觀察。樣品在被超薄切片之前，一般要經(jīng)過固定、脫水和包埋等處理，在切片之后還要經(jīng)過染色等處理才能進(jìn)行觀察。 超薄切片術(shù)（techniques of ultrathin section）是最基本的電鏡樣品制備技術(shù)，其基本過程同石蠟切片大體相似，包括取材、固定、漂洗、脫水、滲透與聚合、切片和染色等多個環(huán)節(jié)，但操作過程比石蠟切片更為細(xì)致與復(fù)雜。為了獲得理想的超薄切片，操作者必須認(rèn)真對待每一步驟，任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能導(dǎo)致制樣的失敗。 合格的超薄切片樣品應(yīng)該達(dá)到以下基本要求

18、：（1）切片的厚度應(yīng)在50nm左右，不能超過100nm，以獲得較高的分辨率和較高的反差；（2）切片應(yīng)能耐受電子束的強(qiáng)烈照射而不發(fā)生破裂、變形；（3）細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保持良好，沒有明顯的物質(zhì)凝聚和丟失。 電子顯微鏡技術(shù)使病理學(xué)對疾病的認(rèn)識，從組織細(xì)胞的光鏡水平深入到細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)水平，它可觀察細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、細(xì)胞骨架或大分子水平的變化，在疾病的病理診斷中，電鏡主要用于腎臟的細(xì)針穿刺活檢標(biāo)本，來進(jìn)行腎小球腎炎的分型。在腫瘤診斷中，電鏡在確定腫瘤細(xì)胞的組織發(fā)生、類型和分化程度上起著重要作用?？筛鶕?jù)各種腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點來協(xié)助區(qū)別分化差的癌和肉瘤、各種梭形細(xì)胞惡性腫瘤、各種惡性小圓細(xì)胞腫瘤、各種神經(jīng)

19、內(nèi)分泌腫瘤及惡性黑色素瘤等。其方法包括負(fù)染色技術(shù)、冷凍蝕刻技術(shù)、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、電鏡X射線顯微分析技術(shù)、電鏡放射自顯影技術(shù)等在疾病的研究中已得到廣泛的應(yīng)用。 二掃描電鏡 掃描電子顯微鏡就是用聚得很細(xì)的電子束流照射要檢測的樣品表面。由于電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生各種信息然后通過不同的檢測器接收相應(yīng)的信息，經(jīng)過處理后顯示出樣品的各種特征。 掃描電鏡具有以下特點：能夠直接觀察樣品的表面的結(jié)構(gòu)；樣品制備過程簡單，不用切成超薄切片；可以從各種角度對樣品進(jìn)行觀察；景深大，圖像富有立體感；圖像的放大范圍廣，分辨率也比較高；電子束對樣品的損傷與污染程度較??；在觀察形貌的同時，還可利用從樣品發(fā)出的其他信號作微

20、區(qū)成分分析。 采用冷凍樹脂割斷法將細(xì)胞打開，可以觀察到細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。用鑄型技術(shù)研究空腔臟器，尤其是血管系統(tǒng)復(fù)雜的立體分布。還可用鹽酸化學(xué)消化法觀察細(xì)胞的基底面及深層細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)。 第四節(jié) 共聚焦激光掃描顯微鏡 共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy）可以從組織細(xì)胞水平直接進(jìn)入亞細(xì)胞水平觀察，且可利用計算機(jī)及圖像處理系統(tǒng)對組織，細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行斷層掃描，三維立體空間結(jié)構(gòu)再現(xiàn)，將形態(tài)學(xué)研究從平面圖像水平提高到三維立體水平，圖像清晰鮮艷；還可在觀察培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的同時，直接顯示培養(yǎng)活體細(xì)胞內(nèi)的代謝變化，可以說病理學(xué)及其它形態(tài)學(xué)研究將出現(xiàn)一個

21、全新的時代。 第五節(jié) 生物芯片技術(shù) 生物芯片技術(shù)（biochip technology）是將大量具有生物識別功能的分子或生物樣品有序地點陣排列在支持物上并與標(biāo)記的檢體分子同時反應(yīng)或雜交，通過放射自顯影、熒光掃描、化學(xué)發(fā)光或酶標(biāo)顯示可獲得大量有用的生物信息的新技術(shù)。生物芯片技術(shù)包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、以及元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片?？蓪NA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、組織以及其它生物成分進(jìn)行高效快捷的測試和分析。 一、基因芯片 基因芯片(gene chip) 是指采用原位合成或顯微打印方法，將大量DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維

22、DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品快速、并行、高效地檢測?？勺詣?、快速地檢測出成千上萬個基因的表達(dá)情況，為基因診斷、藥物篩選以及新基因發(fā)現(xiàn)提供了有力的手段。 圖 基因芯片 二、蛋白芯片 蛋白芯片技術(shù)的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的芯片，然后，用標(biāo)記了特定熒光素的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃可描技術(shù)，測定芯片上各點的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到檢測多種蛋白質(zhì)及其功能的目的。如抗體芯片可排列數(shù)百種

23、單克隆抗體，通過這張芯片，人們在一次實驗中就能夠比較幾百種蛋白的表達(dá)變化。對于診斷疾?。喝鐐魅静?、腫瘤、遺傳病等臨床工作以及信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等基礎(chǔ)研究都具有廣泛的應(yīng)用前景 三、組織芯片 織芯片又稱組織微列陣（tissue microarray） 是將數(shù)十個 數(shù)百個乃至上千個小的組織片整齊的排列在一起到載玻片,形成微縮的組織切片。 其特點有:1. 體積小信息含量高.可根據(jù)不同需要進(jìn)行組合和設(shè)計;2. 即可用于形態(tài)學(xué)觀察也可用于免役組織化學(xué)染色.原位雜交, FISH 等原位組織細(xì)胞學(xué)觀察和研究.3.高效 快速,低消耗,自身內(nèi)對照和可比性強(qiáng),節(jié)時、省力、少材、高

24、效利用庫存蠟塊腫瘤標(biāo)本的新方法。一個蠟塊可連續(xù)切片200張，以供原位分析腫瘤相關(guān)基因DNA及其表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)，熒光原位分子雜交（FISH），mRNA原位雜交、免疫組化三種方法可同時在一個芯片蠟塊的連續(xù)組織芯片中應(yīng)用。因而可提高實驗效率，一張組織芯片上可列陣數(shù)十至數(shù)百個樣本。實驗條件最大程度上保持一致，有助于減少實驗誤差，一個組織芯片蠟塊可連續(xù)切200張片，進(jìn)行許多分子標(biāo)記檢測。最大限度地利用有限的標(biāo)本資源，尤其是少見的病例標(biāo)本，最小破損原有蠟塊?？赏瑫r檢測一種腫瘤不同階段的基因表達(dá)狀況。能在一張片上同時看到一個腫瘤組織在原位、轉(zhuǎn)移 、復(fù)發(fā)中的基因擴(kuò)增情況。 第六節(jié) 激光顯微切割術(shù) 顯微

25、切割（Laser micro-desection）就是在顯微鏡下用手工或儀器采樣的方法從組織切片或細(xì)胞涂片上將所要研究的形態(tài)或表型相同的細(xì)胞從組織三維構(gòu)造中分離出來，獲得純的細(xì)胞群（pure cell population），以備進(jìn)一步作分子水平的研究。微切割技術(shù)的貢獻(xiàn)就是克服了組織的細(xì)胞成分非常繁雜這一重大的缺點。 圖 激光顯微切割儀 一、微切割的方法 1材料來源 微切割可用于福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片、冰凍切片、培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞涂片。但所用載玻片不準(zhǔn)涂抹任何粘附劑，常用的組織切片是HE染色的常規(guī)石蠟切片（厚5m）。除此，可用甲基綠固定劑，以70%和95%的乙醇或丙酮為首選。 2切割及細(xì)胞

26、采集方法 微切割及細(xì)胞采集方法大體上可分為手工操作和儀器操作兩大類。兩者各有長短。從兩個方面評價這些方法，一是準(zhǔn)確性，即有無雜細(xì)胞污染；二是它的效率，能否在較短時間內(nèi)采集到足夠的細(xì)胞；當(dāng)然也要考慮方法所需費(fèi)用。（1）手工操作 就是用消毒的細(xì)針或刀片搔刮組織切片（厚515m）上的細(xì)胞，并將其移至Eppendorf管中。（2）儀器操作 利用激光進(jìn)行微切割和細(xì)胞采集，其特點是微切割的精度高，可進(jìn)行單個或幾個至數(shù)十個細(xì)胞的切割，可獲得很純的細(xì)胞群體，并適用于各種組織材料；再就是效率極高，整個過程僅需23min或數(shù)sec，但儀器價格昂貴。具體又有4種不同的方法：激光微光束微切割 激光加壓彈射 貼于膜上的

27、原組織微切割 激光俘獲微切割。 二、微切割后的細(xì)胞處理 1DNA提取 如果所獲細(xì)胞數(shù)量在105以上，則可用常規(guī)的方法提取DNA。2RNA提取微切割材料RNA的提取一般可采用市售的提取RNA的試劑盒。必須切底清除不需要的細(xì)胞，以防止污染細(xì)胞中高豐度mRNA影響分析結(jié)果。另外，盡可能使用沉淀性固定劑（乙醇、丙酮）而不用交聯(lián)性固定劑（福爾馬林、副醛）。三、微切割的應(yīng)用 1細(xì)胞基因突變及微衛(wèi)星變異的研究 2細(xì)胞基因拷貝數(shù)的變化和甲基化水平的檢測3定量RT-PCR4比較基因組雜交5cDNA微陣列（芯片） 第七節(jié) 原位分子雜交 原位核酸分子雜交（in situ hybridization, ISH）是應(yīng)用

28、特定標(biāo)記的已知核酸探針與組織或細(xì)胞中待測的核酸按堿基配對的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，雜交后的信號可以在光鏡或電鏡下進(jìn)行觀察。由于核酸分子雜交的特異性強(qiáng)、敏感性高、定位精確、定量可能，因此該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域的研究之中。 圖 食管癌腫瘤細(xì)胞c-fos mRNA原位雜交圖片 第八節(jié) 熒光原位分子雜交染色體分析技術(shù) 一、簡介（Introduction） 染色體原位分子雜交技術(shù)（Chromsome Analysis by Fluorescence in situ Hybridization）的發(fā)展為研究染色體上DNA的序列提供了一個最直接的方法。具有經(jīng)濟(jì)、安全、快速、穩(wěn)定，靈

29、敏度高，多彩FISH可在同一核內(nèi)顯示兩種或多種序列，還可對間期核染色體進(jìn)行研究；應(yīng)用不同的探針可顯示某一物種的全部基因，某一染色體染色片段及單拷貝序列；結(jié)合共焦激光顯微鏡可對間期核及染色體進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)研究， 精確檢測雜交信號優(yōu)點。 圖 組織切片間期染色體熒光原位雜交 二、探針（probes） 1基因組探針（Genomic probe）： 人類基因組內(nèi)一些高頻率的重復(fù)序列，在進(jìn)化上很少具有保守性。若 以基因組DNA作為探針，這些存在于探針和靶細(xì)胞順序中的高度重復(fù)序列之間會首先退火結(jié)合，越過那些保守的餓和單一的序列，故雜交會呈現(xiàn)出種特異性。利用這類探針在人鼠雜交細(xì)胞中可特異顯示人的遺傳物質(zhì)。 2染

30、色體特異性序列探針（Probe recognizing chromosome specific sequences)： 目前在人幾乎所有染色體中已經(jīng)克隆出一些重復(fù)序列，重復(fù)一百到五千次不等，各具染色體特異性。大多在某一染色體的著絲粒區(qū)或異染色質(zhì)區(qū)產(chǎn)生致密的雜交帶。從而可特異性地識別某一染色體。 3染色體文庫探針（chromosome labraries probe）： 染色體文庫收集人類單條染色體的DNA作為探針，又稱整體染色體探針或染色體染探針。單條染色體的獲得一般有兩種方法：來自僅攜有某一條人類染色體的體細(xì)胞雜交株，或經(jīng)流式細(xì)胞分類儀從染色體懸液中分離 4單一序列探針（single-cop

31、y sequences probe）： FISH有一弱點，就是要求探針足夠大，探針越小，雜交位點檢出率就越低。欲利用FISH檢測存在基因組內(nèi)的單一序列基因，最有效的方法是應(yīng)用含大插入片段的克隆載體，如全Cosmids（載約40kb的插入片段），更大的YAC載體（載100-800kb插入片段）。若掌握好，小到2kb的質(zhì)粒探針亦可用FISH方法定位，但效率較低。 三、FISH技術(shù)系列 124色mFISH核型分析技術(shù) 圖 食管癌細(xì)胞系24色染色體m FISH核型分析 2原位雜交顯帶技術(shù)(In situ hybridization banding,ISHB) 為了準(zhǔn)確定位原位雜交部位所處染色體及其區(qū)帶

32、，染色體必須顯帶。但無論是先雜交后顯帶，還是顯帶后雜交，雜交與顯帶過程回互相影響效果。后來人們注意到，人類短間隔插入重復(fù)序列中的一種Alu家族，Alu片段約300bp長，在基因組中重復(fù)約九十萬次，平均間隔3-4kb就插入一個。有人利用部分Alu序列作為引物，用PCR方法擴(kuò)增Alu之間的DNA，稱Alu-PCR法。但Alu序列在基因組內(nèi)分布不是隨機(jī)的，有些區(qū)域比較密集，有些區(qū)域較稀疏。只有前者才有PCR產(chǎn)物。人們用Alu-PCR產(chǎn)物作為探針與人類染色體標(biāo)本雜交，結(jié)果得到類似R帶的熒光帶型。故人們在進(jìn)行基因定位時，只需將目的探針與Alu-PCR探針同時應(yīng)用，用不同顏色的熒光標(biāo)記，就可同時顯示雜交信

33、號和染色體帶型。 3FISH基因定位（FISH mapping）基因定位時，不但需要確定某段靶序列在染色體上的位置，尚需確定兩個或兩個以上靶序列在線性DNA分子的排列次序和距離，才能繪出基因圖。一般用同位素雜交：先確定每一靶序列在中期染色體上的位置，然后根據(jù)它們到端粒的距離確定出線形排列次序。而用FISH方法，兩種或兩種以上的探針能同時與中期染色體雜交，只要根據(jù)兩種顏色雜交位點的相互位置，就能直接確定次序。但中期染色體是線形DNA分子經(jīng)過折疊和包裝后形成的，若兩個靶序列相距很近，例如間距小于1Mbp，受包裝過程的影響，它們在線形DNA分子上的排列與在中期染色體上的排列不一定相同，甚至可能完全相

34、反。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，靶序列之間在間期核的平均相對距離與它們在線形DNA分子上的距離呈正相關(guān)。利用間期核FISH分析不但能排除染色體包裝的影響，還能提高測距的分辨率。 圖 食管癌細(xì)胞單條染色體涂染熒光原位分子雜交，用BAC位點探針特異位點定位BAC FISH4染色體原位抑制雜交（chromosome in situ suppression,CISS） 當(dāng)采用染色體文庫探針，或cosmid,YAC進(jìn)行FISH時，那些無處不有的重復(fù)序列家族如Alu、Kpn1家族等會不時穿插出現(xiàn)在探針的序列中，它們干擾了探針識別靶序列的特異性。所謂CISS指的是用人類基因組總DNA(THDNA)，經(jīng)過超聲處理打碎成500

35、bp左右的片段后，與探針混合，變性后在37孵育一段時間，這時探針中的重復(fù)序列與THDNA中的重復(fù)序列之間首先退火，此后再與染色體雜交，就會實現(xiàn)與靶序列之間的特異性結(jié)合。 （1）染色體涂染（chromosome painting）一種用單一染色體文庫探針在中期分裂相或間期核內(nèi)使某一染色體物質(zhì)從Pter至qter整個顯色的方法稱染色體涂染。人們已獲得了一系列單一染色體文庫探針。但在實際操作過程中，所有染色體均毫無區(qū)別的顯示了熒光。當(dāng)加入一定量競爭性DNA后（100-200g/ml），只有目的染色體著色，其它染色體的熒光全部被抑制。但若繼續(xù)增加競爭性DNA量，則目的染色體本身的熒光亦被抑制。染色體涂

36、染法特別適用于檢出染色體多體和易位。 （2）全cosmid和YAC的CISS 在進(jìn)行人類單一序列基因片段的FISH時，為了提高雜交檢出的效率，需用含大插入片段的克隆載體。如用整個cosmid克隆的基因組片段或用YAC克隆的基因片段作為探針進(jìn)行CISS雜交。 5反向染色體涂染（Reverse chromosome painting） 在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中經(jīng)常遇到的問題之一是：很難辨認(rèn)一條新生的染色體或染色體上的一段額外來源。上述各種技術(shù)常對此束手無策。因為帶型不具染色體特異性；而著絲粒特異性探針與單一染色體文庫探針雖具染色體特異性，但無法確定選用哪一條。新的FISH方法如下：首先利用流式細(xì)胞分類方

37、法分離出異常的染色體利用染色體顯微解剖技術(shù)分離出異常的染色體區(qū)帶用PCR法擴(kuò)增異常的單一染色體或染色體區(qū)帶DNA用PCR產(chǎn)物作為探針庫與正常中期染色體進(jìn)行CISS雜交顯示出在正常染色體作為異常染色體起源的部分。故所謂反向染色體涂染是指用異常染色體的DNA作為探針，在正常染色體中尋查其起源部分的方法。 四、FISH的應(yīng)用 1基因定位與基因制圖（Gene mapping） 原理前面已敘述。FISH已經(jīng)極大地加速了人類基因定位和基因制圖的進(jìn)程。 2基因診斷(Gene diagnosis) 精確、直觀、明了 3間期細(xì)胞遺傳學(xué)（Interphase cytogenetics） 4FISH在腫瘤生物學(xué)中的

38、應(yīng)用（1）腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)（Onco-cytogenetics） （2）基因定位：FISH可用于分離出的癌基因與抑癌基因初步定位（3）病毒基因插入基因組部分的檢測：雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒以激活原癌基因為主，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白產(chǎn)物與抑癌基因蛋白產(chǎn)物相互作用而誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但病毒基因特別是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因組。利用FISH可以檢測到病毒整合到人基因組中的情況，對深入研究病毒致癌機(jī)理，以及檢測、防治均具有重要意義。 （4）基因的擴(kuò)增與缺失原癌基因的激活與抑癌基因的失活是目前腫瘤研究的熱點。已知原癌基因的激活方式有：突變、基因擴(kuò)增、易位、病毒序列插入。抑癌基因的激活方

39、式有：點突變、基因缺失。FISH為研究基因的擴(kuò)增和缺失提供了新的方法，能將基因擴(kuò)增和染色體重復(fù)分開。 第九節(jié) 比較基因組雜交技術(shù) 比較基因組雜交技術(shù)(comparative genome hybridization,CGH)。 其基本原理是用不同的熒光染料分別標(biāo)記正常人基因組DNA與腫瘤細(xì)胞DNA，然后與正常人中期染色體雜交，通過檢測染色體上兩種熒光（紅、綠）的相對強(qiáng)度比率，兩組DNA相異部分會顯出顏色偏移，從而可計算出DNA的缺失與放大，從而了解腫瘤組織DNA拷貝數(shù)的改變，并能同時在染色體上定位。這樣的方法使我們只要從新鮮組織或石蠟包埋腫瘤組織中提取少量DNA，就可進(jìn)行全基因組檢測。應(yīng)用CG

40、H技術(shù)檢測癌變過程中的不同階段，腫瘤進(jìn)展的不同時期及不同類型腫瘤的非隨機(jī)性染色體改變，有助于從分子細(xì)胞遺傳學(xué)角度了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對發(fā)現(xiàn)腫瘤遺傳學(xué)標(biāo)記，初步查尋腫瘤相關(guān)基因的位置均具有重要意義。其對檢測原癌基因擴(kuò)增較為靈敏，但對基因缺失敏感性則相對較弱。 圖 食管癌細(xì)胞系CGH圖 第十節(jié) 組織培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)（Tissue and cell culture）是將活體內(nèi)部分組織細(xì)胞取出后在人工條件下使其生長，繁殖和傳代。在體外對細(xì)胞進(jìn)行生命活動，細(xì)胞癌變等問題研究。還可施加實驗因子進(jìn)行形態(tài)、生化、免疫、分子生物學(xué)觀察，已廣泛應(yīng)用與病理學(xué)的各個研究領(lǐng)域。 原代培養(yǎng)：由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點：離體時間短遺傳性和體內(nèi)組織相似。宜作細(xì)胞形態(tài)，機(jī)能，分化研究。傳代培養(yǎng)：把細(xì)胞自原代培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶中分離、稀釋而移至另一新的培養(yǎng)瓶中的操作程序即為傳代或再培養(yǎng)。以便持續(xù)培養(yǎng)，得到大量同種細(xì)胞，細(xì)