藥物色譜分析6課件

1、藥物色譜分析-6化學(xué)鍵合相色譜法齊永秀藥物分析教研室一、化學(xué)鍵合相的特點(diǎn)和分類(lèi)二、化學(xué)鍵合相填料新進(jìn)展三、非極性鍵合相色譜法四、極性鍵合相色譜法五、離子交換鍵合相色譜法主要內(nèi)容第一節(jié) 化學(xué)鍵合相的特點(diǎn)和分類(lèi)定義一、特點(diǎn)：消除了擔(dān)體表面活性作用點(diǎn)，清除了某些可能的催化活性耐溶劑沖洗，使用過(guò)程中固定相流失熱穩(wěn)定性好表面改性靈活，容易獲得重復(fù)性產(chǎn)品載樣量大，溶劑殘留效應(yīng)小，梯度洗脫平衡快二、化學(xué)鍵相的穩(wěn)定性鍵合相中Si-O-Si鍵易受Lewis酸、NaOH、KOH等親電試劑的進(jìn)攻而斷裂，在低pH和高pH條件下均不穩(wěn)定。高溫會(huì)使硅膠溶解，鍵合硅膠在150下使用為宜物理吸附的水會(huì)與硅烷化試劑作用形成副產(chǎn)

2、物,其在有機(jī)溶劑中溶解,造成表觀的鍵合相流失的現(xiàn)象.三、化學(xué)鍵合相的分類(lèi)極性鍵合相、非極性鍵合相、離子交換鍵合相三種第二節(jié)化學(xué)鍵合相填料新進(jìn)展發(fā)展方向：提高填料的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，以及改善選擇性、提高分離度和適用性一、空間保護(hù)鍵合固定相在C18烷基的側(cè)鏈引入較大官能團(tuán)，阻礙硅羥基與分析物的相互作用，如異丙基或異丁基取代每個(gè)硅烷化試劑分子中含有兩個(gè)硅原子，每個(gè)硅原子含有一個(gè)長(zhǎng)鏈硅烷基官能團(tuán)，如Agilent公司的ZorbaxExtend-C18色譜柱，在高流動(dòng)相中穩(wěn)定性極佳，適于分離游離的強(qiáng)堿性化合物二、雙齒鍵合固定相解決利巴韋林等強(qiáng)水溶性藥物在反相柱中分析的難題，內(nèi)嵌極性官能團(tuán)是改善固定相

3、和水溶液兼容能力的途徑。1、1995年Waters公司推出專(zhuān)利極性官能團(tuán)嵌入技術(shù)，如右圖三、內(nèi)嵌極性基團(tuán)鍵合固定相圖9-5內(nèi)嵌極性官能團(tuán)結(jié)構(gòu)示意圖水屏蔽層能夠掩蔽解離后帶負(fù)電的硅羥基，減少拖尾，另可降低脫水現(xiàn)象，使填料和樣品作用完全，在含水量高的流動(dòng)相中，樣品也有穩(wěn)定保留和最佳峰形三、內(nèi)嵌極性基團(tuán)鍵合固定相2、Agilent公司的Zorbax Bonus-RP色譜柱:內(nèi)嵌酰胺基和三封端技術(shù)，圖9-83、內(nèi)嵌磺胺基官能團(tuán)鍵合相，有更出色的水解穩(wěn)定性如圖9-9（Dionex公司）4、Phenomenex公司的Synergi Fusion-RP色譜柱E采用極性嵌合及書(shū)疏水鏈來(lái)達(dá)到高選擇性的效果199

4、9年Waters公司發(fā)明了雜交顆粒技術(shù)，制成了Xterra色譜柱填料具有分離效率高、峰形優(yōu)良、范圍寬、分析速度快，四、硅碳雜化硅膠五、優(yōu)化柱床設(shè)計(jì)六、苯基丙胺鍵合固定相七、以氧化鋯為基質(zhì)的鍵合固定相八、包覆型填料第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）一、疏溶劑作用理論影響溶質(zhì)分子色譜保留的因素溶質(zhì)分子中的非極性部分總表面積對(duì)色譜保留值的影響。鍵合相表面烷基的總表面積對(duì)色譜保留值的影響 烷基的含碳量、鍵合相表面的含碳量對(duì)色譜行為有重要影響洗脫液的表面張力對(duì)色譜保留值的影響第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded

5、 phase chromatography）二、雙保留機(jī)制第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）三、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的組成基本要求:純度高、沸點(diǎn)適中、黏度小、化學(xué)穩(wěn)定性好、紫外吸收本底小、對(duì)樣品有較寬的溶解范圍、與所選的色譜系統(tǒng)相匹配混合溶劑的黏度一般高于純?nèi)軇┑酿ざ?，流?dòng)相組成變化時(shí)壓力升高的現(xiàn)象在應(yīng)用梯度洗脫時(shí)應(yīng)特別注意第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）三、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的基本組成1、一元溶劑系統(tǒng)：一般不采用純水系統(tǒng)2、二元溶劑系統(tǒng)：

6、一般采用洗脫能力較弱的水作為底劑，再加入一定量與水相混溶的有機(jī)溶劑作為調(diào)節(jié)劑，如甲醇、乙腈，也可考慮四氫呋喃3、三元溶劑系統(tǒng)：在二元溶劑系統(tǒng)基礎(chǔ)上添加四氫呋喃、三乙胺、離子對(duì)試劑、緩沖鹽、醋酸、磷酸等第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）四、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的設(shè)計(jì)原則原則解釋首選溶劑非極性色譜首選溶劑為甲醇、乙腈、四氫呋喃，底劑為水多元溶劑由不同組別的純?nèi)軇┡c底劑（或極性調(diào)節(jié)劑）組成，一般不同時(shí)使用兩個(gè)相同組別的純?nèi)軇┫疵撃芰σ灾攸c(diǎn)組分的容量因子為25作為溶劑系統(tǒng)洗脫能力的量度替代溶劑當(dāng)不能達(dá)到分離要求時(shí)，可用相同洗脫

7、能力的不同溶劑系統(tǒng)代替原溶劑系統(tǒng)。離子抑制色譜在色譜柱耐受范圍內(nèi)，可加入調(diào)節(jié)劑，抑制弱酸的解離或弱堿的質(zhì)子化，增加其分配系數(shù)。第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）四、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的設(shè)計(jì)原則（一）中性化合物的分析減小保留值增加保留值使用碳鏈較短的鍵合相C8、C4使用碳鏈較長(zhǎng)的鍵合相C18、使用極性低的流動(dòng)相，增加有機(jī)溶劑的比例使用極性大的流動(dòng)相，增加流動(dòng)相中水的比例提高色譜柱溫度提高色譜柱溫度減小色譜柱長(zhǎng)度增加色譜柱長(zhǎng)度第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatogra

8、phy）四、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的設(shè)計(jì)原則（一）中性化合物的分析1、改變有機(jī)溶劑的比例篩選步驟：100%乙腈80%乙腈60%乙腈40%乙腈第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）四、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的設(shè)計(jì)原則（一）中性化合物的分析2、改變有機(jī)溶劑的類(lèi)型流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度與有機(jī)溶劑的類(lèi)型有關(guān)如圖：第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）四、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的設(shè)計(jì)原則（一）中性化合物的分析2、改變有機(jī)溶劑的類(lèi)型一般改變有機(jī)溶劑不會(huì)影響樣品的出峰順序

9、，但也有特例如圖：第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）四、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的設(shè)計(jì)原則（一）中性化合物的分析3、使用混合有機(jī)溶劑：在二元系統(tǒng)不能分離時(shí)采用如圖第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）四、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的設(shè)計(jì)原則（一）中性化合物的分析3、使用混合有機(jī)溶劑采用下圖方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分離樣品例：取代萘的溶劑選擇性實(shí)驗(yàn)，如圖第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）四、非極性鍵合相

10、色譜法的流動(dòng)相的設(shè)計(jì)原則（二）酸性化合物和堿性化合物的分析：與中性化合物分析相似，區(qū)別是加入pH值調(diào)節(jié)劑和緩沖鹽。pH值的選擇：目的是調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值或利用同離子效應(yīng)，抑制樣品組分的解離，增加其在固定相中的溶解度，達(dá)到分離有機(jī)弱酸弱堿的目的，稱為離子抑制色譜（ISC）適于分析的3.0pKa7.0弱酸， 7.0pKb8.0弱堿或兩性化合物流動(dòng)相對(duì)反相保留的影響與樣品類(lèi)型（酸、堿、中性）的關(guān)系，如圖表 酸性、堿性官能團(tuán)的pKa值取代基pKa酸性堿性酯基取代芳環(huán)取代酯基取代芳環(huán)取代磺酸,-SO3H11氨基酸24912羧酸-COOH4545硫醇,-SH101167嘌呤249酚,-OH1012吡嗪1亞

11、砜,-SO12噻唑13胺，吡啶8115咪唑7哌嗪10第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）四、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的設(shè)計(jì)原則（二）酸性化合物和堿性化合物的分析：緩沖鹽的選擇：目的是維持組分在色譜柱的內(nèi)的平衡，得到較好的重現(xiàn)性。要求：應(yīng)具有適當(dāng)?shù)木彌_容量緩沖溶液濃度應(yīng)適當(dāng)，一般為1050mmol/L與色譜系統(tǒng)相匹配，注意緩沖劑的截止波長(zhǎng)緩沖液的揮發(fā)性，應(yīng)盡量選擇揮發(fā)性緩沖鹽第三節(jié) 非極性鍵合相色譜法（non-polar bonded phase chromatography）四、非極性鍵合相色譜法的流動(dòng)相的設(shè)計(jì)原則（二）酸性

12、化合物和堿性化合物的分析：胺類(lèi)添加劑：在分析堿性化合物時(shí)抑制拖尾現(xiàn)象建立酸性和堿性樣品分析方法的步驟圖示分析酸性和堿性藥物時(shí)的常見(jiàn)問(wèn)題及方法分析堿性藥物時(shí)會(huì)遇見(jiàn)的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法常見(jiàn)問(wèn)題原因解決方法色譜峰拖尾或不出峰親醇基效應(yīng)所致流動(dòng)相中加入小分子有機(jī)胺使用離子對(duì)技術(shù)添加緩沖液色譜峰裂分或多重峰進(jìn)樣后游離藥物與質(zhì)子化的藥物在流動(dòng)相中重新平衡所致流動(dòng)相溶樣后再進(jìn)樣調(diào)整進(jìn)樣溶液的pH值分析酸性和堿性藥物時(shí)的常見(jiàn)問(wèn)題及方法分析酸性藥物時(shí)會(huì)遇見(jiàn)的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法常見(jiàn)問(wèn)題原因解決方法色譜峰拖尾或不出峰待測(cè)物質(zhì)離子化所致調(diào)整流動(dòng)相pH值至酸性加入酸性緩沖液進(jìn)行離子抑制色譜峰裂分或多重峰二次化學(xué)平衡所致流動(dòng)相溶樣后再進(jìn)樣調(diào)整進(jìn)樣溶液的pH值第四節(jié) 極性鍵合相色譜法（polar bonded phase chromatography）極性鍵合色譜法的特性優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)使用非水流動(dòng)相時(shí)，色譜柱穩(wěn)定可改變流動(dòng)相或色譜柱來(lái)改變分離選擇性特別適用于在水溶液中易降解的化合物溶劑黏度低，柱壓低有機(jī)谷物多溶于正相色譜的溶劑，適于制備液相離子型樣品適于非極性色譜不易控制溶劑強(qiáng)度有時(shí)柱效較非極性色譜低低沸點(diǎn)溶劑易揮發(fā)或產(chǎn)生氣泡吸附水使樣品保留不穩(wěn)定，有時(shí)不能采用梯度洗脫有機(jī)