凝膠過濾以及離子交換層析介質(zhì)

1、關(guān)于凝膠過濾及離子交換層析介質(zhì)第一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠過濾法又稱為分子篩層析、凝膠層析或排阻層析,是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)根據(jù)分子大小進行分離的一種方法。 凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。單個凝膠珠本身象“篩子”,不同類型凝膠的篩孔的大小不同。第二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠過濾示意圖第三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠過濾法的工作原理第四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠過濾層析過程示意圖小分子進入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進入珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙流出凝膠基質(zhì)凝膠珠帶網(wǎng)孔

2、的葡聚糖珠第五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠過濾的基本原理：含有尺寸大小不同分子的樣品進入層析柱后，較大的分子不能通過孔道擴散進入凝膠珠體內(nèi)部，較小的分子可以通過部分孔道，更小的分子可通過任意孔道擴散進入珠體內(nèi)部。從而使得小分子移動最慢,中等分子次之，不同分子尺寸的分子先后順序不同流出層析柱，達到分離的目的。第六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1、常見凝膠種類：（1）葡聚糖凝膠：商品名稱為Sephadex。市售有 Sephadex G10-G200。G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。G反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。（2）瓊脂糖凝膠：商品名稱為Sepharos

3、e或Bio-Gel A，瓊脂糖是從瓊脂中分離制得的，這種凝膠的優(yōu)點是孔徑大，排阻極限高。Sepharose2B,4B,6B。（3）聚丙烯酰胺凝膠 (商品名稱為Bio-gel P)： Sephacryl S100,S200,S300,S400。一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。 注：（1）和（2）屬于多糖類骨架的介質(zhì)，（3）屬于合成大分子骨架的介質(zhì)。一、凝膠過濾介質(zhì)第七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2、凝膠介質(zhì)應(yīng)具備的條件介質(zhì)本身為惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)、溶劑分子發(fā)生任何作用；應(yīng)盡量減少介質(zhì)內(nèi)含的帶電離子基團，以減少非特異性吸附，提高

4、蛋白質(zhì)的收率；介質(zhì)內(nèi)孔徑大小要分布均勻，即孔徑分布較窄；凝膠珠粒大小均勻；介質(zhì)要有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性及較高的機械強度，易于消毒。第八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠裝置圖色譜峰和分離結(jié)果第十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3、凝膠過濾的優(yōu)點分離條件溫和,蛋白質(zhì)不易變性,收率高,重現(xiàn)性好；工作范圍廣,分離分子量的覆蓋面大（幾百到數(shù)百萬）；設(shè)備簡單,易于操作,周期短,可連續(xù)使用多次（幾百次甚至幾千次）。第十二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4、色譜柱的重要參數(shù)(1)柱體

5、積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因此柱體積又稱“床”體積，常用Vt 表示。外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。內(nèi)水體積：因為凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進入顆粒內(nèi)部，這部分間隙的總和為內(nèi)水體積，常用Vi表示。 不包括固體支持物的體積（Vg）。支持物的體積（Vg） 第十三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月(2) 峰洗脫體積：指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液的體積，常用Ve 表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用

6、洗脫液體積為Ve。 當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時，洗脫體積計算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。 第十四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5、凝膠過濾的用途脫鹽:用于無機鹽和生物大分子的分離，上樣量大,為凝膠體積的1/41/5,流速大于200cm/h。分級分離:用于分離分子大小相近的物質(zhì)，通常為大分子物質(zhì)的分離。必須采用孔徑適當(dāng)、分離范圍與分子大小相適應(yīng)的凝膠，上樣量小，僅為床體積的5%10%。分子量測定 理論上柱長加長 有利于分離效果的提高， 但實際上卻對操作不利。第十五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于20

7、22年6月6、流動相用作流動相的溶劑必須能溶解試樣;與固定相凝膠性質(zhì)相似，能浸潤凝膠。當(dāng)采用軟性凝膠時，溶劑應(yīng)能使凝膠溶脹。溶劑的粘度要低，高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果，尤其是具有低擴散系數(shù)的高分子量試樣。一定的離子強度：第十六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1) 常用磷酸鹽和硫酸鹽進行離子強度的調(diào)節(jié)2)用氯化鈉作離子劑，疏水作用最小3)pH值不能太低，因為H+會腐蝕不銹鋼柱常用的有四氫呋喃、甲苯、鄰二氯苯、二氯乙烷、氯仿、苯、二甲基甲酰胺和水等。第十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一般來說，生物化學(xué)領(lǐng)域常采用水溶性溶劑，稱為凝膠過濾色譜；在合成高分子化學(xué)

8、領(lǐng)域，常采用有機溶劑，稱為凝膠滲透色譜。四氫呋喃是最常用的流動相，它對樣品有良好的溶解性能和低的黏度，并可使小孔徑聚苯乙烯凝膠溶脹，因此被優(yōu)先推薦使用。第十八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠滲透色譜示差折光檢測器流動相的折射率必須盡可能與樣品的折射率有較大的差別。凝膠過濾色譜紫外吸收檢測器使用在檢測波長無紫外吸收的溶劑作流動相。第十九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月流速蛋白質(zhì)分離時，流速對分離度的影響是一個很重要的因素，一般在低流速下蛋白質(zhì)分離是比較理想。樣品容量進樣體積和樣品的濃度將明顯地影響蛋白質(zhì)的分離度。樣品的濃度范圍一般在0.01%-0.5%，最好是高濃度、小體

9、積，在一般范圍內(nèi)可以得到好的分離效果，蛋白質(zhì)的樣品體積為柱體積的1%-3%比較合適。第二十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月7、凝膠過濾基礎(chǔ) 凝膠使用前要首先進行處理。 1）估計用量 根據(jù)選擇的層析柱估算出凝膠的用量。由于市售的是無水干膠，所以要計算干膠用量： 干膠用量(g)柱床體積(ml)/凝膠的床體積(ml/g) 考慮到損失，故一般凝膠用量再增加1020(質(zhì)量分數(shù))。 第二十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 2)水中膨化 一般吸水率較小的凝膠（型號較小、排阻極限較小的凝膠）膨化時間較短，在20條件下需24 h；吸水率較大的凝膠（型號較大、排阻極限較大的凝膠）膨化時間則較

10、長。加熱煮沸則使膨化時間大大縮短，一般在15 h即可完成，而且煮沸也可以去除凝膠顆粒中的氣泡。但應(yīng)注意盡量避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞。 瓊脂糖凝膠和有些市售凝膠是水懸浮的狀態(tài)，所以不需膨化處理，多孔玻璃珠和多孔硅膠也不需膨化處理。 第二十二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 3）排除凝膠中氣泡 膨化處理后，要對凝膠進行純化和排除氣泡。純化可以反復(fù)漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均一的細小凝膠顆粒。也可以一定的酸或堿浸泡一段時間，再用水洗至中性。排除凝膠中的氣泡很重要，否則會影響分離效果，可以通過抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。 第二十三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 4）

11、凝膠的保存 凝膠的保存一般是反復(fù)洗滌去除蛋白等雜質(zhì)，然后加入適當(dāng)?shù)目咕鷦?通常加入0.02(質(zhì)量分數(shù))的疊氮化鈉，4下保存。如果要較長時間的保存，則要將凝膠洗滌后脫水、干燥;可以將凝膠過濾抽干后浸泡在50(體積分數(shù))乙醇中脫水，抽干后再逐步提高乙醇濃度反復(fù)浸泡脫水，至95(體積分數(shù))乙醇脫水后將凝膠抽干。置于60烘箱中烘干，即可裝瓶保存。注意膨化的凝膠不能直接高溫烘干，否則可能會破壞凝膠的結(jié)構(gòu)。 第二十四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月8、凝膠層析的基本操作 1）層析柱的選擇層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇。層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率

12、要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過100cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:251:100之間。用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對分辨率要求較低，所以一般比較短。第二十五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2 ）裝柱（凝膠層析柱）a.除去氣泡的溶脹凝膠應(yīng)與層析柱操作溫度一致，裝柱過程中溫度也要恒定;b.應(yīng)調(diào)節(jié)有利于裝柱的凝膠漿稀稠度，適當(dāng)稀釋有利于裝柱過程中氣泡的排除;c.將柱子固定在穩(wěn)定的支架上，并保證其垂直。d.先向柱內(nèi)加滿洗脫劑，檢查是否漏水；再打開出液口，排出里面的氣泡，特別是

13、要排除床底支持物上的氣泡。關(guān)閉出液口，使柱中洗脫劑的體積約占總柱體積的15; 第二十六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 e.柱頸接上膠漿貯存器，將膠漿徐徐注入柱內(nèi)。注意避免產(chǎn)生氣泡; f.柱裝好后，停10min，然后打開出液口，排出過量洗脫劑; g.柱內(nèi)膠面上部保留23cm洗脫劑。再將恒壓洗脫劑瓶與柱上端相連。流過至少2倍柱體積的洗脫劑之后，流速開始穩(wěn)定下來; h.調(diào)節(jié)恒壓洗脫劑瓶的高低位置，得到理想流速。檢查流體靜力壓，不要超過規(guī)定值。如果使用蠕動泵，注意使流速不超過穩(wěn)定后利用重力調(diào)節(jié)所達到的流速，一般要低于后者10。第二十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月i.檢查柱裝得

14、是否均勻和V0的測定：用一個為該凝膠完全排阻的有色大分子物質(zhì)作樣品進行層析。層析時，若有色區(qū)帶移動不整齊，說明柱裝得不好。此大分子的洗脫體積(Ve)就是該凝膠柱的空體積(V0)。藍色葡聚糖(blue dextran)2000是平均分子質(zhì)量為2106Da并與藍色染料偶聯(lián)的一種葡聚糖，通常用它來測 V0，對于葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和6 以上的瓊脂糖凝膠均可用0.2 濃度的藍色葡聚糖2000，它在265nm及630nm處都有吸收峰。 第二十八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 3）洗脫液的選擇在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴于流動相性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率，改變洗脫

15、液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其他層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴格。第二十九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 由于凝膠層析的分離機理簡單以及凝膠穩(wěn)定工作的pH值范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。第三十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 4 ）加樣量加樣要盡量快速、均勻。加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實驗效率低;加樣量的多少要根據(jù)具體的實驗要求而定凝

16、膠柱較大，加樣量較大；樣品中各組分相對分子質(zhì)量差異較大，加樣量也可以較大。一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的13(質(zhì)量分數(shù))左右。第三十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月從洗脫峰上看，如果所要各個組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當(dāng)增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。注意：樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的黏度不能過大，否則會影響分離效果。 可以首先以較小的加樣量先進行一次分析，根據(jù)洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。第三十二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5）洗脫速度要恒定而且合適

17、方法：a.使用恒流泵，b.恒壓重力洗脫。洗脫速度取決于柱長、凝膠種類、顆粒大小等。洗脫速度慢，樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好，但過慢會造成樣品擴散加劇，區(qū)帶變寬，反而會降低分辨率，而且實驗時間延長。選擇合適的洗脫速度，可以通過預(yù)備實驗來選擇。一般凝膠的流速是210 mlh，市售的凝膠一般會提供一個建議流速，可供參考。第三十三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據(jù)具體的實驗要求來選擇。 第三十四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月如果被分離的樣品中各個成分受溶液pH的影響，有時帶正電荷，

18、有時帶負電荷，可用離子交換層析方法進行分離。離子交換層析的固相是離子交換體，包括離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖。二、 離子交換層析適用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸及大部分發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化。生化分離中約75%的工藝用離子交換法。第三十五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1、原理:根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子的親和力不同而達到分離。主要依賴電荷間的相互作用，利用帶電分子中電荷的微小差異進行分離。離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團。含有酸性基團的稱為陽離子交換樹脂，可解離出H+，含有堿性基團的稱為陰離子交換樹脂，可解離出OH-。第三十六張，PPT共

19、五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月陽離子交換基強酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂第三十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月陰離子交換基強堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨乙基纖維素第三十八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月帶有SO3或COO基團，通常以SO3Na或COOH形式出現(xiàn)的叫做陽離子交換基；陽離子交換層析：用于帶正電荷蛋白質(zhì)的分離。帶有N（C2H5）基團通常以N（C2H5）Cl出現(xiàn)的叫做陰離子交換基。陰離子交換層析：用于帶負電荷蛋白質(zhì)的分離。第三十九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月+若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與H+發(fā)生

20、交換而結(jié)合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負電荷的物質(zhì)可與OH-發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。+第四十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月示意圖（交換樹脂表面） 第四十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2、常用離子交換劑的種類與特性 1.通用型離子交換樹脂功能基：適用于水處理，濕法冶金，化學(xué)合成及醫(yī)藥工業(yè)等用途廣泛的離子交換樹脂。2.生化專用離子交換介質(zhì)：主要用于生化領(lǐng)域，一般是凝膠過濾介質(zhì)的衍生物，其骨架、粒徑

21、、排阻極限等與母體相似。有纖維素類、葡聚糖系、瓊脂糖系、聚乙烯醇系等8類。詳見教材P183184。第四十三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月生化用離子交換劑的特點1、親水性及生物相容性：都具有親水性，有很好的生物相容性。 以天然大分子為主，依此特性選用含親水基團的單體開發(fā)合成剛性或半剛性的離子交換劑。第四十四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2、孔結(jié)構(gòu)：有3種結(jié)構(gòu)：凝膠孔（溶脹時孔變大）；大孔樹脂（孔在干、濕態(tài)都存在）；瓊脂糖介質(zhì)的孔（孔徑大小與瓊脂糖濃度有關(guān)）。3、電荷密度：電荷密度要適當(dāng)。4、粒度：粒徑小，分布均勻則分離效果好。5、純度：分工業(yè)級，分析級，生物技術(shù)級，分子生

22、物級。第四十五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3、全交換容量和工作容量全交換容量:每克干介質(zhì)或每毫升濕介質(zhì)具有的功能基含量，是一個定值。工作容量:每克干介質(zhì)或每毫升濕介質(zhì)在一定的操作條件下的交換吸附蛋白質(zhì)的實際容量，是一個變值。第四十六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4、離子交換層析的基本操作 （1）層析柱 離子交換層析要根據(jù)分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長。直徑和柱長比一般為1：101：50之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時要均勻平整，不能有氣泡。第四十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）裝柱 先把柱內(nèi)裝滿起始緩沖液，趕盡氣泡并把柱子垂直固定；將交換劑用起始緩沖液調(diào)稀攪勻后加入，柱內(nèi)的交換劑應(yīng)非常均勻地分布，不應(yīng)出現(xiàn)節(jié)面和氣泡，不能干柱，床面平整，床高距柱頂23cm為宜；第四十八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 （3）平衡緩沖液 平衡緩沖液指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。平衡緩沖液的離子強度和pH值的選擇首先要保證各個待分離物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）的穩(wěn)定。其次是要使各個待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。一般是使待分離樣品與