生物催化劑修飾和改造

1、關(guān)于生物催化劑的修飾與改造第一張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第一節(jié) 酶化學(xué)修飾及修飾目的 一、酶化學(xué)修飾 1.限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因：1)細(xì)胞外穩(wěn)定性差；2)酶活性不夠高；3)具有抗原性。 第二張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 改變酶特性有兩種主要的方法： 1)通過(guò)分子修飾的方法來(lái)改變已分離出來(lái)的天然酶的活性。 2)通過(guò)基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。第三張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 酶化學(xué)修飾的概念酶的化學(xué)修飾（chemical modification）： 通過(guò)化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。酶選擇性化學(xué)修飾

2、： 描述肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專(zhuān)一性地修飾。第四張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、酶化學(xué)修飾的目的1. 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（50年代末）2. 人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用 范圍。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。 過(guò)氧化氫酶用右旋糖酐修飾后，在有機(jī)溶劑中的溶解性和酶活性也得到提高，如在三氯乙烷中酶活是天然酶的200倍，在水溶液中酶活是天然酶的15-20倍。 第五張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性）。-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修飾成親水性更強(qiáng)的-NHCH2COOH后，該酶抗不可逆熱失活的穩(wěn)定性在60可提高1000倍。

3、這種穩(wěn)定的酶能經(jīng)受滅菌的極端條件而不失活。 3）消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力）。4）產(chǎn)生新的催化能力。木瓜蛋白酶用黃素共價(jià)結(jié)合修飾后，蛋白酶變成氧化還原酶。第六張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第二節(jié) 酶化學(xué)修飾的原理一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑 大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。第七張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶 酶化學(xué)修飾后通過(guò)兩種途徑抗蛋

4、白水解酶：1. 大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2. 酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。第八張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1. 酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。 破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除 “遮蓋”了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合2. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。第九張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第三節(jié) 酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì) 一、充分認(rèn)識(shí)酶

5、分子的特性 包括酶的 1. 活性部位情況 2. 穩(wěn)定條件及反應(yīng)最佳條件 3. 側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性第十張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、 修飾劑的選擇 要考慮 1.修飾劑的分子量及鏈的長(zhǎng)度（要求有較大的分子量） 2.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置（要求有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)） 3.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件第十一張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、反應(yīng)條件的選擇 要注意 1. 酶與修飾劑的分子比例 2. 反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、pH條件 3. 反應(yīng)溫度及時(shí)間第十二張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 酶化學(xué)修飾的種類(lèi)及應(yīng)用 一、酶的表面化學(xué)修飾

6、 （一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾） 是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。 1.定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。第十三張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 修飾劑： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價(jià)結(jié)合。第十四張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 應(yīng)用：如：PEG超氧化物歧化酶（SOD） PEG人血紅蛋白 PEG天門(mén)冬酰胺酶（ASNase） 降低了抗原性 延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期又如：用Dextr

7、an修飾-淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、過(guò)氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。第十五張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）小分子修飾 （酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）定義：采用小分子試劑使酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。 20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。第十六張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類(lèi)。 1. 非極性R基氨基酸（共8種）： 丙氨酸(Alanine,Ala,A),

8、 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 纈氨酸(Valine,Val,V), 異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P)第十七張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.無(wú)電荷的極性R基氨基酸（共7種）：絲氨酸(Serine,Ser,S), 蘇氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,As

9、n,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)3.帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）：賴(lài)氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R),組氨酸(Histidine,His,H)4.帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）：天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D),谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)第十八張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月幾種重要的修飾反應(yīng)：烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)第十九張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 化學(xué)修飾反應(yīng)的類(lèi)型 1) 烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)

10、：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如NH2，-SH等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F(tuán)：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 第二十張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月烷基化反應(yīng)第二十一張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2) 酰基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)： 含有 結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；?。可作用基團(tuán)： 氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）第二十二張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月?；磻?yīng) 第二十三張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年

11、6月 3) 氧化和還原反應(yīng)試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亞胺可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。還原劑：2巰基乙醇、DTT等。可被還原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。第二十四張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。第二十五張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 4) 芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。 碘代： I2 + HI 硝化： (NO2)4C + +(NO2)3CH（四硝基甲烷）第二十六張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1) 氨

12、基的化學(xué)修飾：來(lái)源：Lys, Arg, His, Gln修飾反應(yīng)：?；c烷基化?；揎梽? 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修飾劑： 2，4二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等第二十七張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十八張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2) 羧基的化學(xué)修飾修飾羧基的反應(yīng)專(zhuān)一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸?？啥繙y(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目。 + 水溶性碳化二亞胺第二十九張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3)胍基的化學(xué)修飾來(lái)源：Arg修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對(duì)氨基?；?。修飾劑： 丁二酮 二羰基化合物

13、 1，2環(huán)己二酮 苯乙二醛第三十張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4)巰基的化學(xué)修飾 來(lái)源：Cys 修飾反應(yīng):烷基化 修飾劑：碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM) E-SH + R-X E-SR +HXN-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM）（常用的專(zhuān)一修飾巰基試劑）ESH 第三十二張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5) 二硫鍵的化學(xué)修飾還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）第三十三張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月氧化：過(guò)甲酸: Performic acid第三十四張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 6)咪唑基的化學(xué)修飾 來(lái)

14、源：His 修飾反應(yīng):?；c烷基化 酰基化修飾劑: 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate） + + C2H5OH +CO2 烷基化修飾劑：碘乙酸 + ICH2COOH + HI第三十五張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月7）酚羥基的化學(xué)修飾來(lái)源：Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）第三十六張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月8）吲哚基的化學(xué)修飾 來(lái)源：Trp 修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng) 修飾劑： N-溴代琥珀酰亞胺 2-羥基-5硝基芐溴第三十七張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸、丹磺酰氯

15、；2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來(lái)酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷T(mén)rp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺 各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑第三十八張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 但解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋喝魏我环N修飾劑不是絕對(duì)專(zhuān)一的。有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化失活， 不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。第三十九張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月蛋

16、白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性化學(xué)修飾的專(zhuān)一性是相對(duì)的；酶的構(gòu)象有些改變；化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行 。第四十張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法） 用雙功能基團(tuán)試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。 分子間交聯(lián)、分子內(nèi)交聯(lián)（四）固定化修飾（共價(jià)偶聯(lián)法） 通過(guò)酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。第四十一張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、酶分子內(nèi)部修飾（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾） 蛋白主鏈修飾采用酶法（用專(zhuān)一性較強(qiáng)的蛋

17、白酶或肽酶為修飾劑）。 （與前面化學(xué)修飾區(qū)別） 第四十二張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1 引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2 仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3 有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。 后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱(chēng)肽鏈有限水解。第四十三張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用實(shí)例：1）提高酶活力：天冬氨酸酶用胰蛋白酶進(jìn)行有限水解，從其羧基末端水解切除10多個(gè)氨基酸殘基，可使天冬氨酸酶的活力提高4-5倍以上。2）消除抗原性：木瓜蛋白酶用氨肽酶進(jìn)行水解，使其全部肽的2/3被去除，該酶的活力保持不變，而其抗原性卻大大降低。第四十四張，PPT共四十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）氨基酸置換修飾 將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。 （三）金屬離子置換修飾 通過(guò)改變酶分子中所含的金