臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)：第二章 抗原抗體反應(yīng)

1、2022/8/71第二章 抗原抗體反應(yīng)Antigen - Antibody Reaction2022/8/72抗原抗體反應(yīng)（antigen and antibody reaction）是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。體內(nèi)（invivo）、體外(invitro)。體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)則根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的介質(zhì)（例如電解質(zhì)、補(bǔ)體、固相載體等）不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。2022/8/73第一節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的原理抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于抗原表位與抗體超變區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)

2、性與親和性。這種特性是由抗原、抗體分子空間構(gòu)型所決定的。此外，還需要它們之間的緊密接觸，才能有足夠的結(jié)合力。2022/8/74一、抗原抗體的結(jié)合力 有四種分子間引力參與并促進(jìn)抗原抗體間的特異性結(jié)合：1靜電引力（electrostatic force） 2范登華引力（Vonder Waals force）3氫鍵結(jié)合力（hydrogen bonding force） 4疏水作用力( hydrophobic interactional force )2022/8/751靜電引力（electrostatic force）是抗原抗體分子帶有相反電荷的氨基和羧基基團(tuán)之間相互吸引的力。又稱為庫(kù)倫引力（Cou

3、lombic force）。例如，一方分子上帶堿性氨基酸（如賴氨酸）游離氨基（NH3+），和酸性氨基酸（如天門(mén)冬氨酸）游離的羧基（COO），可與另一方帶相反電荷的對(duì)應(yīng)基團(tuán)相互吸引。兩者相互吸引可促進(jìn)結(jié)合。這種引力的大小和兩電荷間的距離的平方成反比。兩個(gè)電荷距離越近，靜電引力越強(qiáng)。2022/8/762范德華引力（Vonder Waals force）是原子與原子、分子與分子互相接近時(shí)分子極化作用發(fā)生的一種吸引力，是抗原與抗體兩個(gè)大分子外層軌道上電子之間相互作用時(shí)，因兩者電子云中的偶極擺動(dòng)而產(chǎn)生吸引力。范德華引力的大小與兩個(gè)相互作用的基團(tuán)的極化程度的乘積呈正比，與它們之間距離的7次方呈反比；分子構(gòu)

4、象的互補(bǔ)可以最大限度發(fā)揮該力的作用，引力更強(qiáng)，其能量小于靜電引力。2022/8/773氫鍵結(jié)合力（hydrogen bonding force）是供氫體上的氫原子與氫受體原子間的引力。如分子中的氫原子和電負(fù)性大的氮、氧等原子相互吸引的力。當(dāng)具有親水基團(tuán)（如OH，NH2及COOH）的抗體與相對(duì)應(yīng)的抗原彼此接近時(shí)，相互間即可形成氫鍵，使抗原與抗體相互結(jié)合。氫鍵結(jié)合力較范登華引力強(qiáng)。2022/8/784疏水作用力(hydrophobic interactional force )在水溶液中兩個(gè)疏水基團(tuán)相互接觸，由于對(duì)水分子排斥而趨向聚集而產(chǎn)生的力稱為疏水作用力。當(dāng)抗原表位與抗體超變區(qū)靠靠近時(shí)，相互間

5、正、負(fù)極性消失，親水層也立即失去，排斥了兩者之間的水分子，使抗原抗體進(jìn)一步相互吸引，從而促進(jìn)其相互結(jié)合。疏水作用力是這些力中最強(qiáng)的。對(duì)維系抗原抗體結(jié)合作用最大。2022/8/79二、抗原抗體的親和性和親合力親和性（affinity） 是指抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)對(duì)應(yīng)的抗原表位之間的結(jié)合強(qiáng)度，它取決于抗原抗體之間的空間構(gòu)型的互補(bǔ)程度。它是抗原抗體之間固有的結(jié)合力。親和性可用平衡常數(shù)K來(lái)表示：K=K1/K2 K表示抗原抗體結(jié)合的穩(wěn)定性和親和力,K1表示結(jié)合常數(shù),K2表示解離常數(shù)。K值越大，親和性越高；親和性越高，與抗原結(jié)合越牢。Ag+Ab AgAb2022/8/710抗體的親合力（avidity）

6、是指一個(gè)完整抗體的抗原結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合強(qiáng)度。與親和性、抗體結(jié)合價(jià)、抗原的有效抗原表位數(shù)等有關(guān)。表現(xiàn)出多價(jià)優(yōu)勢(shì)，如IgG為兩價(jià)，親和力為單價(jià)的103倍，IgM為510價(jià)，親和力為單價(jià)的107倍。2022/8/711三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體大多數(shù)抗原為蛋白質(zhì)，抗體是球蛋白，它們?nèi)芙庠谒薪詾橛H水膠體溶液，不會(huì)發(fā)生自然沉淀，且均待負(fù)電荷。抗原抗體的結(jié)合后，使水化層表面電荷減少或消失，水化層變薄，電子云也消失，蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。如再加入電解質(zhì)，如NaCl，則進(jìn)一步使疏水膠體物相互靠攏，形成可見(jiàn)的抗原抗體復(fù)合物。2022/8/712第二節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn) 特異性 比例性 可

7、逆性 階段性2022/8/713一、特異性抗原抗體的特異性（specificity）是指抗原分子上的抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)結(jié)合的特異性，由這兩個(gè)分子之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性決定的。不同的抗體超變區(qū)氨基酸殘基的變異性使曹溝形狀千變?nèi)f化，只有與其結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的抗原決定簇才能如楔狀嵌入，所以抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。這種特異性如同鑰匙和鎖的關(guān)系。2022/8/714例如白喉抗毒素只能與相應(yīng)的外毒素結(jié)合，而不能與破傷風(fēng)外毒素結(jié)合。因此，在抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，可以用已知的抗原或抗體來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的抗體或抗原。但較大分子的蛋白質(zhì)常含有多種抗原表位。如果兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、

8、抗體間構(gòu)型部分相同，皆可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。如，Weil-Felix reaction2022/8/715二、比例性比例性（proportionality）是指抗原抗體特異性時(shí)，生成結(jié)合物的量與反應(yīng)物的濃度的關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時(shí)，才出現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)。根據(jù)所形成的沉淀物及抗原抗體的比例關(guān)系可繪制出反應(yīng)曲線（圖13-1）。2022/8/716圖13-1 沉淀反應(yīng)中沉淀量與抗原抗體的比例關(guān)系2022/8/717三、可逆性抗原抗體反應(yīng)遵循生物大分子熱動(dòng)力學(xué)反應(yīng)原則，其反應(yīng)式為： Ab-AgAbAg=k1/k2=k 式中各反應(yīng)項(xiàng)的單位以mol表示，k1表示反應(yīng)速度常數(shù)，k2為逆反應(yīng)速度常數(shù)，K是反應(yīng)平

9、衡時(shí)的速度常數(shù)。由上式可知，K值是反映抗原抗體間結(jié)合能力的指示，所以抗體親和力通常以K值表示。2022/8/718抗原與抗體結(jié)合形成復(fù)合物后，在一定條件下，又可以解離為游離的抗原與抗體，這種特性稱為抗原抗體反應(yīng)的可逆性（renersibility）?？乖贵w的結(jié)合是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合，形成的復(fù)合物是不牢固的，在一定條件下可以解離因此抗原抗體反應(yīng)形成復(fù)合物的過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。 Ag + Ab AgAb 電解質(zhì)、pH合適溫度2022/8/719抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素：是抗體對(duì)應(yīng)抗原的親和力；是環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響。2022/8/720 四、階段性第一階段為抗原與抗體發(fā)生特異性

10、結(jié)合的階段。此階段反應(yīng)快，僅需數(shù)秒至數(shù)分鐘，但不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)；第二為可見(jiàn)反應(yīng)階段。這一階段抗原抗體復(fù)合物在環(huán)境因素（如電解質(zhì)、pH、溫度、補(bǔ)體）的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)和聚集，表現(xiàn)凝集、沉淀、溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)。此階段反應(yīng)慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。實(shí)際上這兩個(gè)階段以嚴(yán)格區(qū)分，所需時(shí)間亦受多種因素和反應(yīng)條件的影響，如反應(yīng)開(kāi)始時(shí)抗原抗體濃度較高，且兩者比例恰當(dāng)，則很快能形成可見(jiàn)反應(yīng)。2022/8/721第三節(jié) 影響抗原抗體反應(yīng)的因素抗原抗體自身的因素： 抗原 抗體環(huán)境因素： 電解質(zhì) 酸堿度 溫度 2022/8/722抗原抗體自身的因素2022/8/723（一）抗原抗原的理化

11、性狀、抗原表位種類和數(shù)目等均可影響抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果。例如，顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體反應(yīng)后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；可溶性抗原與相應(yīng)的抗體反應(yīng)后出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象；抗原單價(jià)抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象；血細(xì)胞與IgG類抗體反應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。2022/8/724（二）抗體1.來(lái)源 不同動(dòng)物來(lái)源的免疫血清，其反應(yīng)性存在差異。如家兔等大多數(shù)動(dòng)物的免疫血清，由于具有較寬的等價(jià)帶，與相應(yīng)抗原結(jié)合易出現(xiàn)可見(jiàn)的抗原抗體復(fù)合物。馬、人的免疫血清等價(jià)帶窄，抗原不足或過(guò)剩，均易形成可溶性復(fù)合物。而單克隆抗體一般不用于沉淀或凝集反應(yīng)。2.濃度 抗體的濃度是相對(duì)于抗原而言的，二者濃度合適時(shí)才易出現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)結(jié)果，所以在試驗(yàn)前應(yīng)先

12、進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，滴定抗原抗體最佳反應(yīng)濃度。3.特異性與親和力 特異性與親和力是影響抗原抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素，它們共同影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。試驗(yàn)試劑應(yīng)盡可能選擇高特異性、高親和力的抗體，以保證試驗(yàn)的可靠性。2022/8/725環(huán)境條件2022/8/726（一）電解質(zhì)抗原與抗體發(fā)生結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體的過(guò)程中須有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，水化層破壞，復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊的凝集或沉淀。若無(wú)電解質(zhì)參加，則不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85氯化鈉或各種緩沖液作抗原及抗體的稀釋液及反應(yīng)液。由于氯化鈉在水溶液中解離成Na+和C1，可分別中和復(fù)合物上

13、羧基和氨基的電荷，使復(fù)合物的顆粒的電荷下降，有利于復(fù)合物間相互聚集，形成大塊的復(fù)合物。但電解質(zhì)的濃度不宜過(guò)高，否則會(huì)出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。2022/8/727（二） 酸堿度蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點(diǎn)?？乖贵w反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行，PH過(guò)高或過(guò)低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)?？乖贵w反應(yīng)一般在pH為68進(jìn)行。例如當(dāng)pH達(dá)到或接近顆粒性抗原的等電點(diǎn)時(shí)，即使無(wú)相應(yīng)抗體存在，也會(huì)引起抗原非特異性的凝集（自凝），造成假陽(yáng)性反應(yīng)。2022/8/728（三）溫度抗原抗體反應(yīng)必須在合適的溫度中進(jìn)行。 一般以1540為宜，最佳反應(yīng)溫度為37，在此范圍內(nèi)，溫度升高可加速分子運(yùn)動(dòng)，抗原

14、與抗體碰撞機(jī)會(huì)增多，使反應(yīng)加速。但若溫度高于56時(shí)，可導(dǎo)致已結(jié)合的抗原抗體再解離，甚至變性或破壞；溫度越低，結(jié)合速度越慢，但結(jié)合牢固，更易于觀察。某些特殊的抗原抗體反應(yīng)，對(duì)溫度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在4左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20以上反而解離。2022/8/729此外，適當(dāng)振蕩和攪拌也能促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)，其作用于反應(yīng)物粒子大小成正比。2022/8/730對(duì)照的設(shè)置抗原抗體反應(yīng)的影響因素較多，因此應(yīng)十分注意實(shí)驗(yàn)條件的選擇和穩(wěn)定化，必須嚴(yán)格設(shè)置好試驗(yàn)對(duì)照。對(duì)照是實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制的手段之一,目的在于消除無(wú)關(guān)變量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。對(duì)照一般分為： （1）陽(yáng)性對(duì)照 、（2）陰性對(duì)照、 （

15、3）空白對(duì)照、（4）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照2022/8/7311.陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照(positive control)： 陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照，因此對(duì)照品，特別是陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測(cè)定，對(duì)照品最好也為人血清，因?yàn)檎Ｈ搜逶诟鞣N免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街锌僧a(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血清較難得到，國(guó)外試劑盒中的對(duì)照品多以復(fù)鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。 2022/8/732陽(yáng)性對(duì)照品多以含蛋

16、白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對(duì)標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國(guó)外檢測(cè)HBsAg的ELISA試劑盒檢測(cè)敏感度約為0.5ng/ml，陽(yáng)性對(duì)照品中含量約為10ng/ml。在對(duì)照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。2022/8/7332.陰性對(duì)照陰性對(duì)照(negative control) ： 陰性對(duì)照品的基本組成除了不含待測(cè)物質(zhì)（抗原或抗體）以外，其余成分應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)，確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HB

17、sAg，最好抗HBs也是陰性。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)一般要求同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照23份。2022/8/7343.空白對(duì)照空白對(duì)照(blank control): 指不做任何實(shí)驗(yàn)處理的對(duì)照組?？瞻讓?duì)照能明白地對(duì)比和襯托出實(shí)驗(yàn)組的變化和結(jié)果,增加說(shuō)服力。2022/8/735標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照（standard control)：在定量測(cè)定的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置是能夠定量的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的(參考)標(biāo)準(zhǔn)品，一般包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度。2022/8/736第四節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的類型隨著免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，在原有經(jīng)典免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，新的免疫學(xué)測(cè)定方法不斷出現(xiàn)，使免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)更特異、更敏感和更穩(wěn)定。目前根據(jù)抗原和抗體性質(zhì)的不同和反應(yīng)條件的差別，抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果不同，以及反應(yīng)時(shí)參與的其他條件不同，可將抗原抗體反應(yīng)分為五種類型：2022/8/737表13-1 抗原抗體反應(yīng)的基本類型反應(yīng)類型實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢 測(cè) 方 法敏感度沉淀反應(yīng)液相沉淀試驗(yàn)