載體構(gòu)建操作流程

1、載體構(gòu)建操作流程一、載體準備1、質(zhì)粒準備電泳檢測載體質(zhì)量好的質(zhì)粒為三條帶，分別是超螺旋、開環(huán)和復制中間體（即沒有復制完全的兩個 質(zhì)粒連在了一起）；也有觀點認為是質(zhì)粒兩條鏈沒有斷裂的超螺旋結(jié)構(gòu)，開環(huán) DNA和線性DNA。超螺旋結(jié)構(gòu)應至少占到90%。測定質(zhì)粒濃度用核酸定量儀測定質(zhì)粒的濃度，A230、A260和A280值。2、質(zhì)粒雙酶切根據(jù)需要的酶切位點，選擇對應的酶，查找適合的Buffer，進行單酶切。以TaKaRa的限制酶為例，雙酶切的體系如下：試劑體積質(zhì)粒EEnzyme I1pLEnzyme II1pL10 xX Buffer2pL火菌水to 20|iL總體積20pL將上述體系置于37C （不

2、同酶可能存在差異）水浴鍋中酶切。根據(jù)酶切效率不同確定酶切時間，可以去除2叫進行電泳檢測。3、回收質(zhì)粒凝膠回收參照 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒說明書。1）稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時，以1mg=1H進行計向膠 塊中加入膠塊融化液Buffer GM,我們一般用1%的瓊脂糖凝膠電泳，所以一 般加入3個凝膠體積量。2）均勻混合后室溫15-25C融化膠塊。此時應間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約510分鐘）。3）將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。將上述操作的溶液轉(zhuǎn)

3、移至Spin Column中，12,000 rpm離心1分鐘，棄濾液。濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA的回收率。4）將 700 H 的 Buffer WB 加入 Spin Column 中，室溫 12,000 rpm 離心 30 秒鐘， 棄濾液。5）重復操作步驟。6）將 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘。7）將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處 加入30 H的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。8）將滅菌蒸餾水或El

4、ution Buffer加熱至60C使用時有利于提高洗脫效率。9）室溫12,000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。4、檢測取1叫凝膠回收產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測條帶大小與目的大小是否一致。用核酸定量儀測回收片段的濃度。二、插入片段準備1、兩端帶有酶切位點的PCR產(chǎn)物如果設計的擴增目的片段的引物帶有酶切位點及相應的保護堿基，可以采用限制 酶進行雙酶切，具體參考質(zhì)粒雙酶切的體系及鑒定方法。2、寡核苷酸（包括shRNA和linker）如果要構(gòu)建shRNA載體，那么需要合成shRNA上下游寡核苷酸引物。引物回來之后，首先根據(jù)說明書上提供的信息，用水溶解到終濃度為1g/lo引物退火試劑體積F2R2H2

5、。46在PCR儀上進行引物退火，退火體系設置為90C 3min, 37C 1hr。結(jié)束之后馬上進行連接，或者凍到-20C保存。三、連接我們實驗室采用的是 Fermentas T4 DNA Ligase EL0014 kit1、粘性末端連接按照下面體系進行加樣ComponentAmountLinear vector DNA20-100 ngInsert DNAmolar ratio over vector (1:1 to 5:1)10X T4 DNA Ligase Buffer2plT4 DNA Ligase (5 u/pl)1 u (0.2pl)Water, nuclease-freeto 2

6、0 plTotal volume20 pl在PCR儀中22C孵育10min,可根據(jù)片段大小適當調(diào)整連接時間。取5pl連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化50叫感受態(tài)細胞，剩下的保存?zhèn)溆谩?、鈍性末端連接按照下面體系進行加樣ComponentAmountLinear vector DNA20-100 ngInsert DNAmolar ratio over vector （1:1 to 5:1）10X T4 DNA Ligase Buffer 2plT4 DNA Ligase (5 u/pl)5 u (1pl)50% PEG 4000 Solution2plWater, nuclease-freeto 20 plT

7、otal volume20 pl在PCR儀中22C孵育1 hr,可根據(jù)片段大小適當調(diào)整連接時間取5pl連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，剩下的保存?zhèn)溆谩?、載體連接linker按照下面體系進行加樣ComponentAmountLinear vector DNA100-500 ng磷酸化的linker1-2 Ug10X T4 DNA Ligase Buffer2plT4 DNA Ligase (5 u/p l)2 u (0.4pl)50% PEG 4000 Solution2plWater, nuclease-freeto 20 plTotal volume20 pl充分混勻，短暫離心后，放在PCR儀中22C孵

8、育1 hr, 65C放置10min使酶失 活。取5pl連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，剩下的保存?zhèn)溆?。四、轉(zhuǎn)化按照DH5a說明書進行操作步驟取感受態(tài)細胞置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的建議用量為50-100但，可 以根據(jù)實際情況分裝使用。以下實驗以100 m感受態(tài)細胞為例。待感受態(tài)細胞融化后，向感受態(tài)細胞懸液中加入目的DNA （根據(jù)實際情況加 入適量的DNA，通常100但感受態(tài)細胞能夠被1 ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和），用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30分鐘。42C熱擊90秒，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。向每個離心管中加入900 pl無菌的SOC或LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后 置于37C搖

9、床，150rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘使菌體復蘇。取100 pl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，加到含相應抗生素的SOC或LB固體瓊脂培 養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒將細胞均勻涂開，直至干燥，倒置平板，37C培養(yǎng)12-16小時。注意：1）涂布用量可根據(jù)具體實驗調(diào)整。若轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取少量 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；若轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300 pl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平 板。若預計的克隆數(shù)較少，可通過離心（4,000 rpm, 2分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液， 懸浮菌體后將其涂布于平板中。2）新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于37C直至液體被吸收后再 倒置培養(yǎng)。3）涂布剩余的菌液可置于4C保存，如果次日的轉(zhuǎn)

10、化菌落數(shù)過少，可以將剩下 的菌液再涂布新培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。注意事項轉(zhuǎn)化所有步驟均在無菌條件下操作。感受態(tài)細胞應在-80C下保存，不可多次凍融和放置時間過長，以免降低感受 態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率。包裝中有0.1 ng/pl的pUC19DNA，供對照試驗使用。一定要使用與質(zhì)粒載體對應的抗生素。五、挑單克隆一般培養(yǎng)8-9個小時即可看到小的菌落，培養(yǎng)12個小時即可挑單克隆，一般培 養(yǎng)16個小時即可放到4C保存。挑菌1、待平板的菌落長至足夠大達到可挑的水平。2、在超凈工作臺中，在滅菌過的試管內(nèi)倒入5-10 mL滅過菌的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基 根據(jù)需要預先加入抗生素（由菌落所攜帶的質(zhì)粒上的抗性基因所決定）。注意抗 生素要

11、按比例加入培養(yǎng)基，并要清楚標記，未用完的培養(yǎng)基要及時放回4C冰箱。3、用鑷子夾取滅菌的牙簽挑取平板上的單菌落，在試管內(nèi)的培養(yǎng)基中蘸洗幾下， 旋緊管蓋后再將牙簽丟棄于臺外的收集箱中。注意挑菌時不提倡將牙簽直接投入 培養(yǎng)基中，挑菌時一定要挑清晰正常的單菌落，挑過菌的牙簽一定不要留在超凈 工作臺中。4、挑菌后請將裝滅菌牙簽的小燒杯封好，并及時清理工作臺面。5、接種過菌落的試管在搖床中合適的溫度下?lián)u動培養(yǎng)，搖速一般為170230 r/min。 注意試管要在搖床上放好，有適當?shù)膬A斜角度（45左右）。不同的菌株和搖菌 目的需要不同的溫度和搖速。六、克隆鑒定1、菌液PCR使用普通的PCR體系，每管加入1皿菌液進行PCR。注意事項：引物選擇：使用摻入片段的全長引物、定量引物、兩端通用引物、通用引物與定 量引物交叉使用。菌落的處理：一般搖4個小時即可進行鑒定。PCR體系：一般用20或251體系，用普通體系即可，如果片段長達大于2000, 可選用TaKaRa LA Taq體系。模板量：一般加菌液