細菌內毒素檢查法講義

1、歷史回顧與發(fā)展趨勢細菌內毒素鱟試劑檢測內毒素的機理 2010年版藥典細菌內毒素檢查法介紹一、簡況 一百多年前，在西方醫(yī)學發(fā)展史上，一個最重要的發(fā)展就是注射給藥（特別是靜脈注射）方式的創(chuàng)立。毫無疑問它在人類與疾病作斗爭的過程中起了重要作用，但是無論過去還是現(xiàn)在，臨床上使用注射劑時經常出現(xiàn)注射引起的發(fā)熱、頭痛、惡心、膚色灰白、昏迷等，甚至導致患者死亡，這些反應總稱為不良反應。不良反應可分為熱原反應和過敏反應。因此，注射劑的熱原檢查是保證藥品安全的重要檢驗項目之一。 1912年第一次考慮用家兔做熱原試驗，1942年美國首先將家兔熱原檢查方法收入藥典。中國藥典于1953年開始收載。因此，半個世紀以來，

2、家兔法對保證藥品臨床使用的安全發(fā)揮了重要的作用。但是，隨著科學技術和制藥工業(yè)的發(fā)展，這一檢查法的局限性越來越明顯，所以用新的檢驗方法代替家兔法檢測熱原早已成為國內外醫(yī)藥界科研、生產、臨床檢驗等部門很緊迫的問題，基于科學實踐發(fā)展的要求從而發(fā)現(xiàn)并建立了細菌內毒素檢查方法。 細菌內毒素試驗方法有： 凝膠法（Gelation assay）屬限量； 濁度法（Turbidimetrec assay）屬定量； 顯色底物法（Chromogenic assay）屬定量法； 免疫方法（Immumology assay）等。歷史回顧和發(fā)展趨勢1、歷史回顧 美國是發(fā)明鱟試劑和最先建立鱟試驗方法的國家。 1956年，美

3、國動物學家發(fā)表論文鱟的一種細菌性疾病，闡述了細菌內毒素使鱟血凝固的現(xiàn)象。 1964年，和提出了鱟血凝集的初步機理。 1968年，和建立了鱟試驗的方法。 1973年，美國食品藥物管理局（FDA）承認鱟試劑為一種生物制品。 1980年，F(xiàn)DA制定了用鱟試劑檢查人用和獸用注射藥內毒素的準則；美國藥典20版（USPXX）收載細菌內毒素檢查法（BET），但在藥典各品種正文中未涉及。 1983年，USPXX版第四增補本規(guī)定了注射用水等5種常用藥品和40種放射性藥品用細菌內毒素檢查取代熱原檢查。 1991年，USPXX版第五增補本規(guī)定185種藥品以細菌內毒素檢查取代熱原檢查。 1995年，USPXX版規(guī)定4

4、71種藥品用細菌內毒素檢查法檢查，保留熱原檢查的藥品不足30種。 1999年，USPXX版規(guī)定670種藥品用細菌內毒素檢查法檢查，保留熱原檢查的藥品約20種。 2000年，國際調和委員會使美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）和日本藥局方（JP）達成BET的國際調和案，統(tǒng)一的BET已收載于USPXX和NF19的第二增補本中，并于2001年1月1日生效。 英國、歐洲藥典以及日本藥局方都已收載細菌內毒素檢查法，但規(guī)定檢查的品種各有不同。一個共同的特點是注射水是最先被允許檢查的品種。 中國目前是世界上鱟試劑產量最大的國家之一。 19751982年是我國鱟試劑的研制階段，當時由于缺乏標準化研究的基礎，上

5、千批次的實驗結果難于分析。 1983年，衛(wèi)生部授權國家藥品生物制品檢定所組織全國范圍的大輸液及放射性藥品鱟試驗的協(xié)作研究。 1988年，衛(wèi)生部頒布細菌內毒素檢查法，允許4種藥品使用細菌內毒素檢查法初檢。 1993年，中國藥典1990年版第二增補本收載細菌內毒素檢查法，但未涉及任何品種正文。 1995年，“中國藥典細菌內毒素檢查法實施會議紀要”提出爭取在35內我國上百種藥品由熱原檢查法改為細菌內毒素檢查法。 1996年，中國藥典1995年版二部附錄收載經修訂的細菌內的毒素檢查法，注射用水等五種常用藥品和九種放射性藥品正文規(guī)定了細菌內毒素檢查，取消了熱原檢查（其中5%及10%葡萄糖注射液是后來發(fā)通

6、知補充）。 1998年，中國藥典1995年版1998年增補本收載經重大修訂的細菌內毒素檢查法，其中對鱟試劑和細菌內毒素檢查用水的質量以及細菌內毒素檢查方法提出了更高要求。 2000年，中國藥典2000年版（二部）新增細菌內毒素檢查品種57種，且收載了細菌內毒素檢查法應用指導原則。 2005年，中國藥典2005年版（二部）新增細菌內毒素檢查品種約200種。2、發(fā)展趨勢 A.各國藥典收載細菌內毒素檢查法成為發(fā)展的趨勢 細菌內毒素檢查法作為一種新技術載入藥典，成為官方承認的一種法定的藥檢方法，反映了藥典標準水平、藥檢技術水平的提高，標志著一個國家制藥工業(yè)水平及藥品質量的提高。隨著時間的推移，必將有更

7、多國家的藥典收載細菌內毒素檢查法。 B.細菌內毒素檢查取代熱原檢查成為必然的趨勢 細菌內毒素檢查法所具有的優(yōu)點表明它比熱原檢查法更適應現(xiàn)代制藥工業(yè)的發(fā)展。從USPXX版開始收載細菌內毒素檢查法，到USPXX版已有超過90%的注射劑品種規(guī)定內毒素檢查。其它國家的藥典規(guī)定細菌內毒素檢查的品種同樣經歷了從無到有，從少到多的過程?？梢灶A見，細菌內毒素檢查最終必然會取代絕大多數(shù)注射劑品種的熱原檢查。 C.走向統(tǒng)一的細菌內毒素檢查法 USP、EP和JP是三個收載細菌內毒素檢查法（BET）較早的藥典，它們分別建立了各自的內毒素標準物和BET，WHO為了保持內毒素的國際標準品（IS）的效價（IU）與各國內毒素

8、標準品的效價（EU）的一致性，進行了內毒素IS國際協(xié)作研究，自此，內毒素的標準在IU與EU之間實現(xiàn)了統(tǒng)一，即1IU=1EU。雖然內毒素標準初步實行了統(tǒng)一，但在不同的藥典方法下測定的內毒素值仍有差別。細菌內毒素 細菌內毒素是細菌毒素的一類， 是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的復合物，它不是細菌或細菌的代謝產物，而是細菌死亡并解體后才釋放出來的一種具有內毒素生物活性的物質。其化學成分廣泛分布于革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、布氏桿菌、傷寒桿菌、變形桿菌、沙門氏菌等）及其它微生物（如衣原體、立克次氏體、螺旋體等）的細胞壁中，其化學成份主

9、要是由O-特異性鏈、核心多糖、類脂A三部分組成。 類脂A可從O-特異鏈及核心多糖分離出來，游離的類脂A可自身凝聚成大分子的復合體而難溶于水，并具有生物活性。所以，類脂A（Lipida）是內毒素多種生物活性或毒性反應的主要基團。該基團沒有種屬特異性，所以各屬細菌的類脂A結構相似，其毒性反應相似。如發(fā)熱、血液流動力學改變、彌漫性血管內凝血，并導致休克等。 由于類脂A是由4條主鏈和2條支鏈的脂肪酸與內酰胺連接組成，所以提純的內毒素是極為不穩(wěn)定的。這就要求內毒素應在低溫條件下保存，在工作中內毒素稀釋應盡可能地縮短時間，并要現(xiàn)配現(xiàn)用。 內毒素具有多種生物活性：1生物活性：它具有致熱性、致死性毒性、白細胞

10、減少、降低血壓，休克、激活凝血系統(tǒng)、誘導機體對內毒素的耐受性、鱟細胞溶解物的凝集、刺激淋巴細胞有絲分裂、誘導抗感染的非特異抵抗力、腫瘤細胞壞死作用等一系列生物活性。2耐熱性：細菌內毒素具有很強的耐熱性，一般的高壓滅菌不能使其滅活，需25030分鐘以上的干熱滅菌才能使其滅活，目前我國藥典熱原檢查法和細菌內毒素檢查法中關于玻璃用具的滅菌處理為25030分鐘以上，而日本藥局方采用2501小時以上。其它各國藥典也大多如此，國內細菌內毒素標準品的耐熱情況雖然未能考察，但可以認為對細菌內毒素檢查法中玻璃用具等的除菌最好采用250 30分鐘以上的干烤處理。 3外界因素影響：細菌內毒素的生物活性隨外界因素的影

11、響變化很大。目前已經知道，一些金屬離子、超聲波以及溫度等都會對細菌內毒素的生物活性產生很大影響，據(jù)國外文獻報導，鐵離子、鋁離子等會引起細菌內毒素活性的降低。 因此在試驗過程中最好使用玻璃用具，以避免這些因素，另外溫度的高低對細菌內毒素水溶液活性影響很大，根據(jù)國內外文獻報道：內毒素水溶液活性隨著環(huán)境溫度的升高而降低，因此對于內毒素水溶液一定要在低溫處保存，而且對已經稀釋好的內毒素水溶液，要盡可能的在2小時內用完，以避免活性降低。 鱟試劑檢測內毒素的機理 1956年，Bang發(fā)現(xiàn)細菌中提取的粗制品能使鱟因血細胞凝集而死亡，而肺炎球菌、葡萄球菌、鏈球菌的提取物與鱟血細胞無凝集反應。Levin進一步從

12、鱟血變形細胞中提取了幾種成分并與提純的內毒素進行凝集實驗的研究，并提出了內毒素的凝膠試驗法。鱟的種屬及分布鱟，又稱作王蟹，是一種棲生于海洋中的低等無脊椎動物，大約出現(xiàn)在古生代泥盆紀，距今已明幾億年的歷史，但直到現(xiàn)在它的形態(tài)并無重大變化故有“活化石”之稱，鱟是從古生代的三葉蟲演化而來。 鱟的種屬很少，目前全世界僅存三屬4種：1.美洲鱟LimuluspolyphemusLinnaEUs分布在北美西太平洋沿岸2.東方鱟TachyplEUstridentatusLeach分布在中國、日本、菲律賓等3.巨鱟TachyplEUsgigasMuller分布在泰國、印度尼西亞等4.園尾鱟Carcinoscor

13、piusrotundicaudapocock分布馬來半島、印尼等其中能夠用于制備鱟試劑的主要有：1.美洲鱟和2.東方鱟。鱟血呈天藍色，是由于存在能攜氧的含銅血藍蛋白（hemocyanin）所致。鱟血中僅有一種白細胞，又稱變形細胞，它含有高密度的顆粒，顆粒中含有與內毒素起凝集作用的酶系統(tǒng)，即凝固蛋白原（Coagulogen）凝固酶原（proclotting enzyme），B因子（factor B）和C因子（factor C）等。內毒素可使C因子激活，激活的C因子可使B因子激活，激活B因子又可使凝固酶原活化成凝固酶，后者通過酶解作用使凝固蛋白原轉變?yōu)槟痰鞍祝╟oagulin）。凝固蛋白又通過交

14、聯(lián)（crosslinking enzyme）作用，相互聚合而形成纖維狀的凝膠。2010年版藥典細菌內毒素檢查法介紹整體結構1. 綜述部分檢查法的描述試驗的準備限值（L）的確定確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）2. 實驗部分凝膠法 光度測定法a 鱟試劑靈敏度復核 a 標準曲線的可靠性實驗b 干擾實驗 b 干擾實驗c 檢查法：限量試驗 c 檢查法 半定量試驗綜述部分1. 檢查法的描述2. 試驗的準備3. 限值（L）的確定4. 確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） 本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。 檢查法的描述細菌內毒素檢查包括兩

15、種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度 法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結果為準。細菌內毒素標準物質 a 國家標準品 b 工作標準品細菌內毒素檢查用水 a 凝膠法細菌內毒素檢查用水系指內毒素含量小于的滅菌 注射用水 b 光度測定法細菌內毒素檢查用水，其內毒素含量應小于 試驗的準備 試驗器械的要求試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。常用的方法是在250 干 烤至少30分鐘，也可采用其他確證不干擾細菌內毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素并且對試驗無干

16、擾的器械。試驗操作過程應防止微生物的污染。試驗的準備供試品溶液的制備某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在的范圍內。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產廠家推薦的適宜的緩沖液調節(jié)pH值。緩沖液必須經過驗證不含內毒素和干擾因子。限值（L）的確定 藥品、生物制品的細菌內毒素限值（L）除藥典有規(guī)定的，一般按以下公式確定： LKM L為供試品的細菌內毒素限值；以EU/ml、EU/mg或EU/U表示； K為規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內毒素量；以EU/（kgh）表示

17、。注射劑，K=5EU/（kgh），其中放射性藥品注射劑，K=2.5EU/（kgh），鞘內用注射劑，K=0.2EU/（kgh）； M為人用每公斤體重每小時最大劑量；以ml/（kgh）、mg/（kgh）或u/（kgh）表示，人均體重按60kg計算，注射時間小于1小時，按1小時計算 按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產和臨床用藥實際情況做必要調整，但需說明理由。計算舉例：注射用阿莫西林鈉根據(jù)國家藥典委員會編纂的臨床用藥須知：“肌肉注射或稀釋后靜脈滴注，一次1g，一日34次：小兒按體重每日50100mg/kg，分34次靜脈滴注?！盡成人1000mg/h60kg16.67mg/(kgh) M兒

18、童100mg/(kgh)333.3mg/(kgh)L=K/M限值（L）的確定限值計算時做必要調整的幾種情況從嚴原則聯(lián)合用藥特殊情況等限值（L）的確定確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） 最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內毒素限值的檢測。MVDcL L：供試品的內毒素限值 c：供試品溶液的濃度 ：在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度(EU/ml)， 或在光度測定法中所使用的標準曲線上最 低的內毒素濃度(如標準曲線為50、5、 三個濃度組成) 計算舉例a 當L以EU/ml表示時，則濃度C的單位為 適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應 小于xx EU/ml。

19、例：替硝唑注射液，計算限值為，使用 靈敏度為的鱟試劑進行檢驗，則：MVD4倍 確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） 計算舉例b 當L以EU/mg表示時，則C的單位為mg/ml或U/ml適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液體但是規(guī)定限值為應小于xx EU/mg或EU/U。例：注射用阿莫西林鈉計算限值為，使用靈敏度為的鱟試劑進行檢驗。需先稱取一定重量的注射用阿莫西林鈉，在已除去外源性內毒素的容器中，用細菌內毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。如稱取100mg注射用阿莫西林鈉，用5ml內毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。MVD24倍如果供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD 取

20、1，計算供試品的最小有效稀釋濃度c=/L ；適用于供試品為固體的情況。計算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。 例：注射用阿莫西林鈉計算限值為，使用靈敏度為的鱟試劑進行檢驗。最小有效稀釋濃度c 例：注射用青霉素鈉（規(guī)格：80萬單位）限值為，使用靈敏度為的鱟試劑進行檢驗。最小有效稀釋濃度c 2500u/ml 實驗部分 凝膠法光度測定法a 鱟試劑靈敏度復核a 標準曲線的可靠性實驗b 干擾實驗b 干擾實驗c 檢查法：限量試驗c 檢查法 半定量試驗目的 考察鱟試劑的靈敏度是否準確 考察檢驗人員操作方法是否正確 實驗條件是否符合規(guī)定何時進行 使用新批號的鱟試劑 試驗條件發(fā)生可能影響檢驗結

21、果的改變時 鱟試劑靈敏度復核試驗鱟試劑靈敏度復核試驗 內毒素濃度20.50.25陰性對照鱟試劑平行管鱟試劑靈敏度復核試驗放入371的恒溫器中，保溫60分鐘2分鐘將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；形成的凝膠不堅實、變形或從管壁滑脫者為陰性；保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。 結果判斷：若最大濃度2管均為陽性，最低濃度管均為陰性，陰性對照管陰性，試驗方有效。結果計算：反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值 c=lg-1(X/4) 式中X為反應終點濃度的對數(shù)值（lg）。（反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后

22、一個呈陽性結果的濃度。） 鱟試劑靈敏度復核試驗鱟試劑靈敏度復核試驗內毒素濃度20.50.25陰性對照終點鱟試劑平行管0.50.5c=lg-1(lg+lg+lg0.5+lg0.5)/4=0.707當c在2（包括和2）時，方可用于細菌內毒素檢查。實驗時，以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。鱟試劑靈敏度復核試驗凝膠法干擾試驗 目的：是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內毒素和鱟試劑的反應不存在干擾作用，為能否使用細菌內毒素檢查法提供依據(jù)。 導致干擾的因素：排除干擾的方法： pH值 稀釋 抗凝因子 中和 螯合劑 過濾 葡聚糖 加熱 試驗操作： 在干擾試驗中，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最

23、大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，即與所使用的鱟試劑反應，不出現(xiàn)陽性的供試品溶液。 凝膠法干擾試驗 凝膠法干擾試驗當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。（注：須三個批號以上的供試品，兩個以上鱟試劑廠家的試劑）當鱟試劑、供試品的配方、生產工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。如：內毒素檢查時，供試品陽性對照為陰性時。目的：初步確定供試品的最大不干擾濃度（當限值以EU/mg或EU/U活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當限值以EU/ml表示），為正式干擾實驗提供依據(jù)；優(yōu)點：減少摸索過程、節(jié)省成本。預試驗操作步驟

24、：將供試品溶液進行一系列倍數(shù)的稀釋；使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進行檢驗，每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即含濃度標準內毒素的該濃度的供試品稀釋液）；另做2支陰性對照和2支陽性對照。 預試驗預試驗結果判斷：當陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗為有效；當系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認為供試品在該濃度下不干擾實驗，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)，即可選擇該稀釋倍數(shù)進行正式干擾實驗。 預試驗預試驗 陰性 陽性稀釋倍數(shù)原液5倍10倍20倍40倍供試品溶液 PPC NC PC 如上結果可初步確定該樣品的最小干擾稀釋倍數(shù)為20倍，可在此濃度下 進行正

25、式干擾實驗。 一般建議：40倍正式干擾試驗 目的：檢驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內毒素的反應有無干擾作用。操作：用內毒素檢查用水和供試品將同一支內毒素標準品分別制備一系列濃度的內毒素溶液。同時制備2支供試品陰性對照和2支陰性對照。 編 號內毒素濃度/配制內毒素的溶劑稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2/供試品溶液供試品溶液12421440.5480.254C2/檢查用水檢查用水12421440.5480.254D無/檢查用水2A：供試品溶液 B：供試品陽性對照 C：陽性對照 D：陰性對照結果判斷當供試品陰性對照A和陰性對照D都為陰性，并且系列溶液C的結果在鱟試劑

26、靈敏度范圍內時，試驗方為有效。分別計算用檢查用水制成的內毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液和稀釋液制成的內毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Et）； ES =lg-1(XS/4) Et =lg-1(Xt/4)當ES在2(包括和2)及Et在S 2 ES（包括0.5 ES和2 ES）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。 內毒素濃度2.00.50.25終點內毒素/檢查用水（系列溶液C）陰性對照（溶液D）內毒素/供試品溶液（系列溶液B）2.02.0供試品陰性對照（溶液A） ES =lg-1(XS/4) Et =lg-1(Xt/4)1.41當存在干擾時，可通過對供試品進行更大

27、倍數(shù)的稀釋或有關其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。導致干擾的因素：排除干擾的方法：pH值稀釋抗凝因子中和螯合劑過濾葡聚糖加熱檢查法凝膠法凝膠限量試驗凝膠半定量試驗凝膠限量試驗檢驗供試品中的內毒素含量是否小于限度的定性方法。編 號內毒素濃度/配制內毒素的溶液平行管數(shù)A供試品溶液無/供試品溶液2B供試品陽性對照2/供試品溶液2C陽性對照2/檢查用水2D陰性對照無/檢查用水2當陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效例：替硝唑注射液，計算限值為，使用靈敏度為的鱟試劑進行檢驗，計算： MVD4倍供試品溶液：4

28、倍替硝唑稀釋液供試品陽性對照為：含標準內毒素的4倍替硝唑稀釋液陽性對照為：濃度為的標準內毒素溶液凝膠限量試驗結果判斷供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照 試驗有效凝膠限量試驗結果判斷供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照 此批替硝唑注射液的內毒素含量小于0.5EU/ml，符合規(guī)定供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照 此批替硝唑注射液的內毒素含量不小于0.5EU/ml，不符合規(guī)定凝膠限量試驗結果判斷供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照 須復試復試時，供試品溶液需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；四管中如有一管為陽性，即可判供試品不符合規(guī)定。供試品溶液供試品陽性對

29、照陰性對照陽性對照 凝膠半定量試驗半定量試驗是使用凝膠法估測供試品中內毒素含量的方法，系通過反應終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。原理：通過供試品系列稀釋液與鱟試劑反應，其反應終點濃度的稀釋倍數(shù)與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內毒素含量。凝膠半定量試驗操作：用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度和稀釋倍數(shù)下開始進行對倍稀釋，制備成2、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過所使用鱟試劑的MVD。凝膠半定量試驗溶液的制備編號內毒素濃度/配制內毒素的溶劑稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水12224282B2/供試品溶液22C2/檢查用水檢查用水12221240.

30、5280.252D無/檢查用水2A：沒有超過MVD并且通過干擾試驗的供試品系列稀釋液；B：供試品陽性對照（為確證不存在干擾作用）；C：標準內毒素系列（為確證本試驗的操作和環(huán)境都符合規(guī)定）；D：陰性對照。凝膠半定量試驗結果判斷當陰性對照溶液D的平行管均為陰性；供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性；系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值在2之間，則試驗有效。若內毒素濃度小于規(guī)定的限度，判供試品符合規(guī)定。若內毒素濃度大于或等于規(guī)定的限度，判供試品不符合規(guī)定。凝膠半定量試驗結果計算內毒素濃度2.00.50.25終點標準內毒素系列溶液C0.5稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A42供試品陽性對照溶液B 陰性對

31、照溶液D CElg-1(X/2)=lg-1(lg4+lg2)/2=2.83例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值為； 通過使用3個鱟試劑廠家的鱟試劑對3個不同廠家的7個樣品進行干擾試驗證實：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀釋2倍后即不干擾內毒素檢查； 使用靈敏度為的鱟試劑對一批右旋糖酐20葡萄糖注射液進行凝膠半定量試驗。MVD倍 從已確定不干擾的稀釋倍數(shù)2倍起，再進行1、2、4、8倍稀釋(相當于將供試品原液進行了2、4、8、16倍稀釋，最終的稀釋倍數(shù)沒有超MVD)。 內毒素濃度0.060.030.0150.0075終點標準內毒素系列溶液C0.0150.03稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A40.0320.

32、03供試品陽性對照溶液B 陰性對照溶液D CElg-1(X/2)=lg-1(lg4+lg2)/2=2.830.0849EU/ml如果檢驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘上稀釋倍數(shù)。 由于檢驗時采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干擾稀釋倍數(shù)2倍稀釋液，因此計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘上稀釋倍數(shù)2； 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內毒素含量為：如試驗中供試品溶液的結果均為陰性，應記為內毒素濃度小于（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記錄為小于乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù)）。內毒素濃度0.060.030.0150.0075終點標準內毒素系列溶液C0.0150.03稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A10.0310.03供試品陽性對照溶液B 陰性對照溶液D 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內毒素含量為：小于20.030.06EU/ml如試驗中供試品溶液的結果均為陽性，應記為內毒素濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以 。內毒素濃度0.060.030.0150.0075終點標準內毒素系列溶液C0.0150.03稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A80.0380.03供試品陽性對照溶液B 陰性對照溶液D 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內毒素含量為：大于80.030.48EU/ml濁 度 法 顯色基質法 系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的