草莓未受精子房的離體培養(yǎng)

1、草莓未受精子房的離體培養(yǎng)論文導(dǎo)讀:：在細胞全能性學(xué)說的根底上，以草莓為試材，MS為根本培養(yǎng)基，研究不同的離體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)草莓未受精子房雌核發(fā)育的情況，尋求高頻率誘導(dǎo)草莓雌核發(fā)育的條件。本研究采用單因子比擬實驗法，分析比擬了不同基因型、外源激素種類和濃度、蔗糖濃度、低溫預(yù)處理的時間、生長環(huán)境及發(fā)育狀況、溫度和光照條件六個關(guān)鍵因素對誘導(dǎo)草莓雌核發(fā)育的影響。試驗結(jié)果說明：選擇適宜的基因型的露地栽培苗的一級花蕾，4低溫預(yù)處理48h，接種于含6%蔗糖和0.8%瓊脂的MS根本培養(yǎng)基中附加2.0 mg/L的外源激素 2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在每12h變溫(2516) 且連續(xù)黑暗的條件下培養(yǎng)最容易誘導(dǎo)草莓

2、未受精子房雌核發(fā)育獲得單倍體胚囊植株。本研究為草莓倍性育種提供參考。論文關(guān)鍵詞：草莓，未受精子房，雌核發(fā)育，離體培養(yǎng)未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)是人工誘導(dǎo)形成單倍體植株的技術(shù)之一。與花藥培養(yǎng)相比，經(jīng)未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)誘導(dǎo)的單倍體植株至少有四個獨特的優(yōu)點：(1)有些植物花藥培養(yǎng)至今難以成功或誘導(dǎo)率太低，而未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)可提供一條單倍體育種新途徑：(2)對于雄性不育的植物無法用花藥來培養(yǎng)獲得單倍體，可采用未受精子房或胚珠培養(yǎng)來誘導(dǎo)；(3)未受精子房或胚珠培養(yǎng)的后代能產(chǎn)生較多的綠苗【1】；(4)培養(yǎng)地方品種或雜種一代的未受精胚珠或子房，可迅速獲得高純度種質(zhì)資源，在高效率利用種質(zhì)資源、提高

3、選育效果方面有理論研究和實際應(yīng)用價值。近年來國內(nèi)外學(xué)者在此方面做了許多探索性工作，到目前為止相繼有25種，2變種植物通過未受精胚珠或子房的離體培養(yǎng)，獲得了單倍體植株。但在果樹中至今沒有未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)的報道【2】。草莓是薔薇科草莓屬(Fragaria)多年生草本雌核發(fā)育，是世界許多國家廣泛栽培的一種漿果類植物。上世紀60年代以來草莓的離體培養(yǎng)研究和應(yīng)用頗受重視，各種器官、組織和細胞的培養(yǎng)迅速開展，開展了包括莖尖培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、抗性體細胞無性系篩選、基因轉(zhuǎn)化等方面的研究，并取得了一定的進展。1998年Ahokas用秋水仙素、二甲基亞砜、甘油處理二倍體和四倍體草莓體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體【5】，

4、但是草莓未受精子房離體培養(yǎng)誘導(dǎo)雌核發(fā)育的研究至今未見報道。1 材料和方法1.1 試驗材料供試材料由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系草莓資源圃提供。取不同基因型草莓開花前2d花藥未裂開的一級或二級花蕾作外植體，并置4冰箱低溫預(yù)處理不同時間備用免費。1.2 試驗方法試驗準備：配制MS培養(yǎng)基 Percen-tage 個 Number Percen-tage 有胚 With embryo 無胚 Without embryo 豐香Fenxiang 8X 37 6 16.2 12 32.4 6 14 16.2 明旭Mingxu 8X 590 72 12.2 251 42.5 175 68 29.7 實生Shisheng

5、 8X 32 4 12.5 22 68.8 5 5 15.6 J10 8X 19 1 5.3 18 94.7 2 0 10.5 天津5號 TianjinNO5 8X 18 4 22.2 14 77.8 13 1 72.2 哈尼Hani 8X 55 0 0 17 30.9 0 0 0 弗州草莓 F.virginiana 8X 145 0 0 69 47.6 0 0 0 UC10 8X 34 2 5.9 0 0 5 0 14.7 EMC 2X 10 2 20.0 0 0 7 0 70.0 -3號Xinjiang NO.3 2X 68 0 0 0 0 0 0 0 The effect ofdiffe

6、rent genotype on the induction in vitro of unfertilized ovary instrawberrytable12.2 外植體的生長環(huán)境及發(fā)育狀況對草莓未受精于房離體誘導(dǎo)的影響從表2中可知，露地材料誘導(dǎo)結(jié)種率明顯高于保護地材料，而且一級花蕾誘導(dǎo)效果又明顯優(yōu)于二級花蕾。表2 外植體不同生長環(huán)境及發(fā)育狀況對草莓未受精子房離體誘導(dǎo)的影響Table 2 The effect of explant under thesituation of different growth environment and development status on the

7、induction in vitro of unfertilized ovary in strawberry 外植體 Explants 接種的花托數(shù) Inoculating receptaole number 子房膨大花托數(shù) Receptacle with inflated ovary 具愈傷組織花托數(shù) Receptacle with callus 種子數(shù) Seeds(number) 結(jié)種率 ( Spermideus rate 個Number () Percenage 個 Number () Percentage 有胚 With embryo 無胚 Without embryo 露地苗一級花蕾

8、 The first grade buds of outdoor plants 590 72 12.2 251 42.5 175 68 29.7 保護地一級花蕾 The first grade buds of greenhouse plants 90 8 8.9 17 18.9 11 5 12.2 露地苗二級花蕾 The second grade buds of outdoor plants 28 6 21.4 4 14.3 7 3 25.0 保地苗二級花蕾 The second grade buds of greenhouse plants 34 2 5.9 9 26.5 2 4 5.9 2

9、.3 低溫預(yù)處理對草莓未受精子房離體誘導(dǎo)的影響接種前外植體在4條件下低溫預(yù)處理，實驗說明對誘導(dǎo)草莓未受精子房產(chǎn)生有胚種子;的效果是非常明顯的。從表3中可知，在低溫處理一定時間內(nèi)，誘導(dǎo)效果隨處理時間的增長而提高，處理48h對誘導(dǎo)結(jié)種率最適宜，時間再長那么誘導(dǎo)結(jié)種率緩慢下降。表3不同低溫預(yù)處理時間對草莓未受精子房離體誘導(dǎo)的影響Table 3 The effect of different time after cold-pretreatment on theinduction in vitro of unfertilized ovary in strawberry. 處理時間 Time of co

10、ld- Pretreatment (h) 接種的花托數(shù) Inoculating receptaole number 子房膨大花托數(shù) Receptacle with inflated ovary 具愈傷組織花托數(shù) Receptacle with callus 種子數(shù) Seeds(number) 結(jié)種率 () Spermi- dues rate 個 Number () Percentage 個 Number () Percentage 有胚 With embryo 無胚 Without embryo 0 51 3 5.9 27 52.9 3 10 5.9 12 24 82 64 11 22 13.

11、4 34.4 64 24 78.1 37.5 16 14 12 13 19.5 21.9 48 590 72 12.2 251 42.5 175 68 29.7 60 73 17 23.3 24 32.9 18 14 24.6 72 31 8 25.8 0 0 7 8 22.6 24 外源激素對草莓未受精子房離體誘導(dǎo)的影響從表4統(tǒng)計結(jié)果分析得知，不加外源激素不能誘導(dǎo)子房的膨大和雌核發(fā)育；生長素類物質(zhì)2，4-D是誘導(dǎo)雌核發(fā)育并產(chǎn)生種子;所必需的；單獨添加2，4-D可誘導(dǎo)產(chǎn)生有胚的種子;；添加細胞分裂素類物質(zhì)BA和KT抑制了子房的膨大，并不同程度地促進了花托體細胞愈傷組織的形成免費。表4外源激素對

12、草莓未受精子房離體誘導(dǎo)的影響Table 4 Effects ofextrinsic hormone on the induction in vitro of unfertilized ovary in strawberry 激素種類及濃度 The kind and concentr-ation of hormone 接種的花托數(shù) Inoculating receptacle number 子房膨大花托數(shù) Receptacle with inflated ovary 具愈傷組織花托數(shù) Receptacle with callus 種子數(shù) Seeds(number) 結(jié)種率 Spermi-deus

13、 rate 個 Number (%) Percen-tage 個 Number (%) Percen-tage 有胚 With enbryo 無胚 Without enbryo 無激素 16 0 0 0 0 0 0 2.4-D0.5 8 3 37.5 0 0 0 9.7 2.4-D1.0 41 3 7.3 16 39.0 4 13.6 2.4-D1.5 22 3 13.6 9 40.9 3 29.7 2.4-D2.0 590 72 12.2 251 42.5 175 12.4 2.4-D2.5 32 3 9.4 17 53.1 4 0 2.4-D1.0+BA0.5 20 0 0 14 70.0

14、 0 0 2.4-D1.0+BA0.5+ NAA1.0 48 1 2.1 45 93.7 0 0 2.4-D1.0+BA0.5+ NAA1.0+KT0.5 83 0 0 65 78.3 0 0 2.4-D1.0+BA0.5+NAA1.0+KT1.0 132 3 2.3 104 78.8 0 0 2.4-D1.0+BA0.5+NAA1.0+KT0.5 76 0 0 33 43.4 0 0 2.4-D1.5+BA1.0+NAA0.5 112 0 0 54 48.2 0 0 2.4-D1.0+ NAA1.0+KT1.0 164 3 1.8 94 57.3 0 0 從圖1中更直接地反映出，當2,4-D

15、濃度小于2.0mg/L時，誘導(dǎo)結(jié)種率隨2,4-D濃度的增大而增高，2.0mg/L2,4-D的濃度在所研究的激素組合中誘導(dǎo)效果最好，結(jié)種率達29.7，當2,4-D濃度為2.5mg/L時，那么誘導(dǎo)率明顯下降。圖1 不同2,4-D濃度對誘導(dǎo)未受精草莓子房結(jié)種率的影響Fig1 Theeffect of different 2,4-D concentration on the spermideus rate of inducedunfertilized ovary in strawberry2.5 蔗糖濃度對草莓未受精子房離體誘導(dǎo)的影響從表5和圖2分析發(fā)現(xiàn)：隨著蔗糖濃度的升高體細胞愈傷組織的形成明顯受到

16、抑制；子房膨大率、結(jié)種率在蔗糖濃度低于6時雌核發(fā)育，隨蔗糖濃度的升高而增大；當蔗糖濃度高于6后，二者那么降低；在6的蔗糖濃度時子房膨大率、結(jié)種率均為最大，分別達12.2和29.7。 蔗糖濃度() Sucrose Concent-ration 接種的 花托數(shù) lnoculating receptacle number 子房膨大花托數(shù) Receptacle with Inflated ovary 具愈傷組織花托數(shù) Receptaole with callus 種子數(shù) Seeds(number) 結(jié)種率 () Spermideus rate 個Number () Percen- tage 個 Num

17、ber () Percen- tage 有胚 With embryo 無胚 Without embryo 0 79 2 2.5 62 78.5 6 5 7.6 2 41 1 9.1 29 70.7 6 4 14.6 4 71 8 11.3 33 46.5 10 5 14.1 6 590 72 12.2 251 42.5 175 68 29.7 8 65 1 1.5 19 29.2 1 1 1.5 10 384 2 0.5 49 12.8 3 2 0.8 表5蔗糖濃度對草莓未受精子房離體誘導(dǎo)的影響Table5 Theeffect of sucrose concentration on the i

18、nduction in vitro ofunfertilized ovary in strawberry圖2 不同蔗糖濃度對誘導(dǎo)草莓未受精子房發(fā)育的影響Fig2 Theeffect of different sucrose concentration on the induction ofunfertilized ovary in strwberry2.6溫度和光照對草莓未受精子房離體誘導(dǎo)的影響本實驗就溫度和光照對誘導(dǎo)效果的影響進行了研究，表6說明前期黑暗培養(yǎng)優(yōu)于光照培養(yǎng)，變溫培養(yǎng)又優(yōu)于恒溫培養(yǎng)，總結(jié)果是：變溫黑暗變溫光照黑暗交替恒溫黑暗變溫光照恒溫光照。表6 培養(yǎng)條件對誘導(dǎo)效果的影響 培養(yǎng)條

19、件 Culture condition 接種的花托數(shù) Inoculating receptaole number 子房膨大花托數(shù) Receptacle with inflated ovary 具愈傷組織花托數(shù) Receptacle with callus 種子數(shù) Seeds(number) 結(jié)種率 () Spermi-deus rate 個 Number () Percen-tage 個 Number () Percen-tage 有胚 With embryo 無胚 Without embryo 25恒溫連續(xù)光照 Constant temperature at 25,light 70 3 4.

20、3 38 54.3 4 6 5.7 25C恒溫連續(xù)黑暗 Constant temperature at 25，darkness 83 12 14.4 30 36.2 15 7 18.1 2516C變溫連續(xù)光照 Alternative temperature at2516,light 68 4 5.9 40 58.8 6 7 8.8 25C16變溫連續(xù)黑暗 Alternative temperature at2516,darkness 590 72 12.2 251 42.5 175 68 29.7 2516變溫、光照黑暗交替 Alternative culture condition at 2

21、5 light16 dorkness 54 9 16.7 18 33.3 14 10 25.9 The effectof culture condition on the induction resulttable63討論離體誘導(dǎo)非洲菊未授粉胚珠形成愈傷組織的8個品種中誘導(dǎo)率不同 【6】。水稻未受精子房培養(yǎng)中，胚囊愈傷組織的誘導(dǎo)頻率依野生稻、秈稻、粳稻的次序增加【7】。目前還有玉米Zea mays L.、甜菜Beta vulgaris L.、洋蔥Allium cepaL.、小麥Triticumsativum Lam.、向日葵Helianthus annuus L.等植物子房培養(yǎng)再生單倍體植株具

22、有基因型依賴性。可見，不同基因型的同種植物單倍體的誘導(dǎo)率變化很大，選擇適宜的基因型對誘導(dǎo)雌核發(fā)育是很重要的。本研究證實草莓離體培養(yǎng)再生單倍體植株同樣具有基因型依賴性。基因型相同但生長環(huán)境及發(fā)育狀況不同誘導(dǎo)雌核發(fā)育的效果也不同。試驗中草莓春季露地苗比冬季保護地苗誘導(dǎo)率高，一級花蕾比二級花蕾誘導(dǎo)率高。文獻報道水稻Oryza.sativa L.的雌核發(fā)育主穗比分蘗穗易誘導(dǎo)。劉栓桃等分別用9種基因型的西葫蘆(Cucurbita pepo L.)開花前一天、開花當天以及開花后一天的未受精胚珠為外植體，研究了不同取樣時期對再生植株產(chǎn)率的影響，結(jié)果其中8種基因型均以開花當天的胚珠最適合誘導(dǎo)培養(yǎng)，再生植株產(chǎn)率

23、最高。試驗中露地材料誘導(dǎo)結(jié)種率明顯高于保護地材料。對于玉米，溫室中春季生長的植株有利于雌核發(fā)育，非洲菊中秋季的材料比春季的愈傷組織誘導(dǎo)頻率高，而春季材料誘導(dǎo)的愈傷組織比秋季的易分化。上述材料均說明選擇處于較優(yōu)越的生長條件抗性好的供體材料對雌核發(fā)育有利。用子房或胚珠誘導(dǎo)雌核發(fā)育外植體是否低溫預(yù)處理，文獻不盡相同。早在1981年周嫦和楊弘遠在對水稻幼花接種后先在1214冰箱中放置6天，然后再培養(yǎng)可起到促進的效果。在對向日葵的研究中說明雌核發(fā)育，接種前進行24h或48h低溫預(yù)處理(24)，孤雌生殖誘導(dǎo)率有所提高，而珠被愈傷組織那么受到明顯抑制。本試驗也表現(xiàn)為4低溫預(yù)處理48h最正確免費。然而在西葫蘆

24、(Cucurbita pepoL)的研究中，發(fā)現(xiàn)不經(jīng)低溫處理的子房誘導(dǎo)單倍體植株的比率高。大多數(shù)成功的實驗都采用了外源激素誘導(dǎo)雌核發(fā)育，且不同植物需要不同的激素和濃度，如百合、西葫蘆。在本試驗中，當2,4-D濃度小于2.0mg/L時，誘導(dǎo)效果和2,4-D濃度呈正相關(guān)，添加細胞分裂素類物質(zhì)BA和KT使激素總水平較高，那么抑制了子房的膨大，并不同程度地促進了花托體細胞愈傷組織的形成。使未受精子房或胚珠成功誘導(dǎo)出單倍體植株的培養(yǎng)基中都添加了一定濃度的蔗糖，但不同的植物培養(yǎng)要求的最適蔗糖濃度是不同的，如楊樹培養(yǎng)的適宜濃度為10，非洲菊培養(yǎng)1效果最正確，煙草在蔗糖濃度為0.40gL時，胚狀體誘導(dǎo)率較高。

25、多數(shù)植物由于缺乏嚴格的比擬實驗，尚難掌握其最適濃度，在本試驗中比擬了0%、2%、4%、6%、8%、10%的蔗糖濃度，最終確定最適濃度是6%雌核發(fā)育，濃度過高或過低均不利。這一研究結(jié)果和閆華等研究蔗糖濃度對向日葵離體孤雌生殖和體細胞增生的調(diào)節(jié)作用的趨勢相似。誘導(dǎo)雌核發(fā)育的不同階段，除改變培養(yǎng)基組成外，采用不同的培養(yǎng)溫度和光照條件，雌核發(fā)育的誘導(dǎo)率也會有較大的差異。楊樹子房光照培養(yǎng)比黑暗培養(yǎng)時體細胞愈傷組織較少，雌核發(fā)育也較快。黑暗條件是水稻雌核發(fā)育、胚狀體形成的有利條件 ，但豌豆再生植株和甜菜再生植株必須光照培養(yǎng)。到目前為止，在進行未受精子房誘導(dǎo)雌核發(fā)育時在培養(yǎng)溫度和光照方面缺乏比照試驗，許多植

26、物不能確定最適的培養(yǎng)溫度和光照條件。文中進行了5組比擬試驗，確定了草莓未受精子房離體培養(yǎng)誘導(dǎo)雌核發(fā)育的最適光照和溫度條件是每12h變溫(2516)黑暗培養(yǎng)。植物未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)誘導(dǎo)雌核發(fā)育產(chǎn)生單倍體的過程十分復(fù)雜，但其理論和實際意義重大，值得深入研究。References【1】LIU Yong-sheng.Plant cultivationtechnique in the embryo of horticultural plants. Journal of HenanVocation-technical Teachers College,1990,18(2):32-36.【2】WANG

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