抗生素的活性

1、抗生素的活性及其測定 定義抗生素對微生物(細(xì)菌、真菌及原蟲等)抑制的能力稱為抗生素的活性，并以此進(jìn)行測定。生長的概念，當(dāng)用于宏觀生物時較為熟知，通常以單位時間生長體積的增加來表示。 定義對于微觀生物，必須予以進(jìn)一步明確。在這種情況下，生長可以在兩種水平上加以區(qū)別，即群體生長和單個細(xì)胞生長。群體生長是指單位時間里微生物總數(shù)的增加，即微生物群體密度的增加。單細(xì)胞生長是指“個細(xì)胞產(chǎn)生二個子細(xì)胞時，細(xì)胞材料的合成。細(xì)胞生長的結(jié)果導(dǎo)致微生物群體的生長。定義通常，抗生素活性的定義是指抑制微生物群體生長的能力。活性的測定以直接進(jìn)行單位體積中微生物總數(shù)的計數(shù)，或者測定培養(yǎng)物中與群體密度有關(guān)的某些參數(shù)，如光散射

2、性質(zhì)。定義抗生素對細(xì)菌群體生長的抑制可能是可逆的或不可逆的作用。在可逆作用情況下，當(dāng)抗生素不存在時，大部分細(xì)菌開始生長，抗生素對細(xì)菌的作用稱為抑菌作用；在不可逆作用情況下，只有少數(shù)細(xì)胞或沒有細(xì)胞存活，抗生素的這種作用稱為殺菌作用。 活性測定 抑菌活性抗生素活性的一種定量測定方法，是測定抗生素完全抑制某種細(xì)菌生長的最低濃度，稱為最低(最小)抑菌濃度(MIC)。下面描述的測定抗生素抗細(xì)菌活性的技術(shù)基本上也適用于酵母、真菌和某些原蟲的活性。在液體培養(yǎng)基中測定最低抑菌濃度按傳統(tǒng)方法測定MIC的方法如下：(1)準(zhǔn)備一系列含有同樣體積液體培養(yǎng)基的試管，被測試菌的接種量在每毫升103-106個細(xì)胞之間?，F(xiàn)在

3、大都采用含有01m1體積培養(yǎng)基的微孔板。 (2)抗生素的濃度在每個試管中是遞減的通常以對倍稀釋法逐管稀釋抗生素的濃度如在第一管中，抗生素的濃度為128 g ml，第二管為64g ml，第三管為32g ml，以此類推)。最后一管不加抗生素，作為細(xì)菌生長的陽性對照。在液體培養(yǎng)基中測定最低抑菌濃度在液體培養(yǎng)基中測定最低抑菌濃度 (3)培養(yǎng)物在所測試細(xì)菌的最適溫度下培養(yǎng)一定時間，至少繁殖10-15代(通常過夜) (4)以混濁度用肉眼觀察細(xì)菌在系列試管中的生長情況(實際上，培養(yǎng)物的混濁度至少在有107個細(xì)胞ml數(shù)量級時才能觀察到)。在液體培養(yǎng)基中測定最低抑菌濃度在抗生素濃度足以抑制細(xì)菌生長時，試管保持透

4、明。從實驗的角度而論，MIC是指“最后”一透明管中抗生素的濃度，即用肉眼沒有觀察到細(xì)菌生長的抗生素的最低濃度。在液體培養(yǎng)基中測定最低抑菌濃度顯然，由于所用的方法是以抗生素對倍稀釋及用肉眼觀察細(xì)菌的生長，所得MIC不是一個十分準(zhǔn)確的數(shù)值。在確定細(xì)菌生長時，只差管，MIC值則相差一倍。在液體培養(yǎng)基中測定最低抑菌濃度盡管如此，MIC對研究抗生素的生物學(xué)及臨床應(yīng)用，均為一個很有用的參數(shù)。然而應(yīng)當(dāng)明確，MIC值與試驗條件及所用菌種有關(guān)，不同菌株對抗生素敏感性不同；因此, MIC值不盡相同。 在固體培養(yǎng)基中測定最低抑菌濃度從概念看，這種方法與用液體培養(yǎng)基進(jìn)行測定是相似的?？股赜煤协傊暮线m的培養(yǎng)基進(jìn)行

5、系列稀釋，然后倒入平皿在培養(yǎng)基表面接種欲測的菌種(1 l, 菌懸液中的細(xì)菌濃度為109細(xì)胞m1)。在固體培養(yǎng)基中測定最低抑菌濃度經(jīng)過一定時間培養(yǎng)，以沒有細(xì)菌生長或僅有少數(shù)單個分散的菌落形成的最低抗生素濃度作為最低抑菌濃度 這種方法的優(yōu)點在于欲測細(xì)菌，以簡化工作量累積曲線同種細(xì)菌的不同株對同一種抗生素顯示不同的敏感性。要評價抗生素的的臨床應(yīng)用前景，必須測定它對每一種細(xì)菌諸多臨床分離株的活性這點十分重要。累積曲線對于每種細(xì)菌的MIC的測定及其結(jié)果通常以下面幾種形式表示：(1)活性范圍，以較低的和較高的MIC值表示(2）MIC50表示抑制50的所測菌種的MIC值(3)MIC90表示抑制90所測菌種的

6、MIC值累積曲線所得結(jié)果，亦可用圖形表示，以每種濃度抑制細(xì)菌株的百分?jǐn)?shù)和相對應(yīng)的抗生素濃度來制圖。累積曲線的形狀將反映菌株對抗生素敏感度的不同(圖)。殺菌活性如果抗生素對細(xì)菌的抑制作用在較廣濃度范圍內(nèi)是可逆的，則稱為抑菌作用；當(dāng)在稍高于MIC值濃度下的抑制作用是不可逆的菌作用。最低殺菌濃度(MBC) MBC測定方法如下：(1)依照在液體培養(yǎng)基中測定MIC所有的操作，所用于接種的細(xì)菌數(shù)應(yīng)不小105。(2)經(jīng)培養(yǎng)后，在沒有可見生長的試管中取出一些液體，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，涂布于含有合適的固體培養(yǎng)基的平皿中。(3)平皿培養(yǎng)48小時后再觀察生長，其菌落數(shù)被認(rèn)為是相當(dāng)于活菌數(shù)，MBC被認(rèn)為是在乎皿上沒有菌落生

7、長的最低抗生素濃度。實際上，MBC是以有菌落生長(CFU)的抗生素濃度來判斷。該濃度下菌落生長數(shù)比原接種量減少1000倍(即01存活數(shù))。殺菌曲線 不同抗生素濃度的殺菌速度是殺菌作用的一個重要參數(shù)，其測定方法如下；培養(yǎng)菌液，至少含有5105ml細(xì)菌數(shù)，加入一定量抗生素進(jìn)行培養(yǎng)，在一定間隔時間內(nèi)取樣，經(jīng)適當(dāng)稀釋，涂布于培養(yǎng)皿，經(jīng)48小時培養(yǎng)后，菌落計數(shù)，乘以稀釋度，即得到活菌數(shù)(一個菌落被認(rèn)為相當(dāng)個活菌數(shù))。殺菌曲線以不同濃度抗生素和不同菌株進(jìn)行同樣操作，其結(jié)果通常以作圖表示(圖)。以形成菌落數(shù)的細(xì)胞數(shù)的對數(shù)與時間作圖，所得曲線稱為累積殺菌曲線。應(yīng)用累積殺菌曲線來評價抗生素的殺菌作用，比用MBC

8、更接近實際情況。它與臨床上服用抗生素后生物體內(nèi)不同濃度抗生素的作用具有可比性。細(xì)菌對抗生素敏感性的測定為在臨床上合理使用抗生素，經(jīng)常需要了解引起感染的病原菌對哪些抗生素敏感，對哪些抗生累耐藥對此，測定臨床分離株對不同抗生素的MIC值是最可靠的。細(xì)菌對抗生素敏感性的測定然而，經(jīng)典式的測定MIC的方法不太適用于大量菌株的測定。因而建立了一些較為簡單而價廉的方法，其中最常用的是擴(kuò)散法(又被稱為干皿擴(kuò)散法或瓊脂擴(kuò)散法)。在某些國家，尤其是英國，采用瓊脂參入或臨界濃度法，這里將簡要介紹這些方法。1、 擴(kuò)散法用標(biāo)準(zhǔn)濃度的待測抗生素溶液，浸泡濾紙片。在瓊脂培養(yǎng)皿上，均勻涂布一層稀釋的待測細(xì)菌懸液。將含抗生素

9、的濾紙片放在培養(yǎng)皿上，其中的抗生素擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂中，產(chǎn)生一個遞減濃度梯度。培養(yǎng)皿保溫放置1620小時，其中的微生物生長起來，密集的或半密集的菌落形成混濁的表層。許多實驗室現(xiàn)用標(biāo)準(zhǔn)濃度的待測抗生素溶液，浸泡濾紙片。在瓊脂培養(yǎng)皿上，均勻涂布一層稀釋的待測細(xì)菌懸液。1、 擴(kuò)散法在抗生素濃度高于MIC值的紙片周圍，細(xì)菌不能生長，出現(xiàn)了一個透明的抑菌圈。這個透明圈的直徑與微生物對抗生素的敏感性相關(guān)。1、 擴(kuò)散法測量抑菌圖直徑，并與參考標(biāo)準(zhǔn)(中心點)進(jìn)行比較。根據(jù)抑菌圈大小與參考標(biāo)準(zhǔn)的比較結(jié)果，可以將微生物的敏感性分為三類：敏感(抑制透明圈大于或等于參考標(biāo)準(zhǔn))居間(抑制透明圈略小于參考標(biāo)準(zhǔn))不敏感(抑制透明

10、圈明顯小于參考標(biāo)準(zhǔn))(即抗性)。為了更有效地使用擴(kuò)散法，需要將其進(jìn)行嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化，KirbyBauer推薦的方法最為常見。擴(kuò)散法的另變更是，同時培養(yǎng)待測菌株和同種微生物的標(biāo)準(zhǔn)菌株，以標(biāo)淮菌株上面形成的抑菌圈作為參考標(biāo)準(zhǔn)，來確定待測菌的敏感性。 2、 臨界濃度法的原理與固體培養(yǎng)基測定MIC方法測定細(xì)菌菌株對某個抗生素的敏感性時，把細(xì)菌接種在含有確定濃度抗生素的瓊脂培養(yǎng)皿上，觀察細(xì)菌是否生長。與前面的方法不同，臨界濃度法的結(jié)論很明確，生長或不生長。 2、 臨界濃度法的原理與固體培養(yǎng)基測定MIC方法即能形成菌落的菌株，就認(rèn)為是有抗性，否則就是敏感, 而無法確定抗性或敏感的、也無可能將細(xì)菌劃分為“居間

11、”的類別中。為了避免這一缺點，在測定時，可以另加一個抗生素濃度更高的培養(yǎng)皿。這樣，可以對抗性的水平有一個了解，從而將那些在較低濃度抗生素培養(yǎng)皿上生長，而在較高濃度抗生素培養(yǎng)皿上不生長的菌株劃分為“居間”。3、散布圖及中心點的選定使用上述方法測定細(xì)菌對抗生素的敏感性時必須要先區(qū)分一定菌株對抗生素敏感還是抗性的濃度標(biāo)準(zhǔn)。般主要根據(jù)藥理學(xué)及藥代動力學(xué)等一系列參數(shù)確定這個濃度標(biāo)準(zhǔn)。其中最主要的是血液中的水平、清除率和血清蛋白結(jié)合情況。3、散布圖及中心點的選定為了確定標(biāo)準(zhǔn)濃度(中心點)的臨界抑菌圈直徑、需要測定大量(100至200株)代表各種致病菌的菌株的MIC值。對于每一株，要用紙片法測定一定量抗生素

12、所產(chǎn)生的抑菌圈直徑，然后繪出以MIC值的2為基數(shù)的對數(shù)作縱坐標(biāo)和以抑圈圈直徑作橫坐標(biāo)的散布團(tuán)。3、散布圖及中心點的選定經(jīng)過均方處理，可以其出抑菌圈直徑與MIC對數(shù)的直線關(guān)系方程式。從中可以獲得中心點，即標(biāo)準(zhǔn)濃度的抑菌圈直徑，還可以算出其他已測數(shù)值的波動值。4抗菌素譜抗菌譜是指某一種微生物對一組抗生素的敏感或抗性情況。通常是用前面介紹的任一種方法測定抗菌素譜。在使用擴(kuò)散法時，在涂布有待測菌株的培養(yǎng)皿上，放置不同抗生素的標(biāo)準(zhǔn)濾紙片。需要提醒的是，透明圈的直徑并不僅僅依賴于抗生素的活性，還與抗生素的擴(kuò)散速率有關(guān)。如果不加思索地認(rèn)為透明圈越大，抗生素的活性就越高將足錯誤的。在使用臨界濃度方法時，可以利

13、用復(fù)合接種器在一個加有標(biāo)準(zhǔn)濃度抗生素的培養(yǎng)皿上，同時接種許多待測菌株。4抗菌素譜比較準(zhǔn)確的方法是，在液體培養(yǎng)基中測定抗菌素譜。目前，常常利用部分或全部自動化的儀器，在微型系統(tǒng)中測定抗菌素譜?？股氐南嗷プ饔?相互作用或干擾，是指兩個抗微生物劑同時加入微生物培養(yǎng)物時，一個抗微生物劑對另一個抗微生物劑的作用的影響?？股氐南嗷プ饔脜f(xié)同作用，是指聯(lián)合作用時的抗微生物效應(yīng)，大于單獨作用時的效應(yīng)之和。累加作用，是指聯(lián)合作用時的抗微生物效應(yīng)，等于單獨作用時的效應(yīng)之和。拮抗作用，是指一種成分降低另一種成分的抗微生物效應(yīng)。無關(guān)作用，指的是一種成分(例如對所測菌無活性)的存在并不影響另一種成分的活性?？股氐南?/p>

14、互作用盡管這四種情況在概念上非常清楚和明確，但是造成這幾種情況的原因以及描述它們的參數(shù)都復(fù)雜難懂。要定量測定相互還有一種更簡單因而也不太準(zhǔn)確的方法檢測相互作用?？股氐南嗷プ饔脤⒔萦胁煌股氐膬蓚€紙條，以90度垂直交叉，放置在涂布有受試微生物的培養(yǎng)皿上。如果紙條相互交叉部分的抑菌帶變寬了，說明是協(xié)同作用；反之，如果抑制帶變窄了，說明是拮抗作用。影響抗生素活性測定的因素 體外抗生素活性的測定受實驗條件的影響如培養(yǎng)基組成、細(xì)菌接種物密度和接種量。此外，用固體培養(yǎng)基測定時還有一些特殊因素在定量測定抗生素時,其他要考慮的因素1抗生素溶液的體積 如果體積不足孔(或紙片)中的抗生素濃度，由于擴(kuò)散，會隨

15、時間明顯變化。因為擴(kuò)散速率本身介于孔和瓊脂間的濃度梯度的函數(shù)，這樣會造成透明圈的直徑出現(xiàn)波動。在定量測定抗生素時,其他要考慮的因素2瓊脂的厚度和濃度 當(dāng)瓊脂的厚度較薄時，透明圈會大一些。因而在制備大培養(yǎng)平板時，必須保證板子絕對水平，這樣才能制備厚度均一的培養(yǎng)平板。在定量測定抗生素時,其他要考慮的因素關(guān)于濁度法，需要專門指出的是, 生長速率與溫度關(guān)系很大也就是說，試管中間溫度的小差異，也會導(dǎo)致大誤差。不論測定抗生素的濃度，還是測定菌株的敏感度，情況都是這樣。在定量測定抗生素時,其他要考慮的因素上面所討論的幾個因素，只是影響抗生素對細(xì)菌的活性的諸多因素中的一部分。在使用抑制細(xì)菌生長方法定量測定抗生素活性時，有必要使所有測定條件特定化和標(biāo)準(zhǔn)化，以使不同的實驗室之間的數(shù)據(jù)可以重復(fù)?？咕钚詼y定的微型化和自動化最近幾年，細(xì)菌多重耐藥性的廣泛擴(kuò)散，在微生物實驗室測定的抗菌素譜的需求急劇增加。需要開發(fā)簡便價廉的微生物技術(shù)。這方面的需要主要向兩方面發(fā)展：微型化自動化抗菌活性測定的微型化和自動化一般在1-2m1體積培養(yǎng)基中進(jìn)行測試。但是現(xiàn)在、通常在更小的體積如100 l中進(jìn)行，并且廣泛采用塑料板即微孔滴定板(每板96孔，每孔200l。培養(yǎng)基、接種物、抗生素溶液都用多孔移液器加入，節(jié)省了大量材料和勞力?？咕钚詼y定的微型化和自動化已經(jīng)開發(fā)出抑菌圈測讀和菌落汁數(shù)的自動化系統(tǒng)，由光