抗生素的活性

1、抗生素的活性及其測(cè)定 定義抗生素對(duì)微生物(細(xì)菌、真菌及原蟲等)抑制的能力稱為抗生素的活性，并以此進(jìn)行測(cè)定。生長(zhǎng)的概念，當(dāng)用于宏觀生物時(shí)較為熟知，通常以單位時(shí)間生長(zhǎng)體積的增加來表示。 定義對(duì)于微觀生物，必須予以進(jìn)一步明確。在這種情況下，生長(zhǎng)可以在兩種水平上加以區(qū)別，即群體生長(zhǎng)和單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)。群體生長(zhǎng)是指單位時(shí)間里微生物總數(shù)的增加，即微生物群體密度的增加。單細(xì)胞生長(zhǎng)是指“個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生二個(gè)子細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞材料的合成。細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)果導(dǎo)致微生物群體的生長(zhǎng)。定義通常，抗生素活性的定義是指抑制微生物群體生長(zhǎng)的能力。活性的測(cè)定以直接進(jìn)行單位體積中微生物總數(shù)的計(jì)數(shù)，或者測(cè)定培養(yǎng)物中與群體密度有關(guān)的某些參數(shù)，如光散射

2、性質(zhì)。定義抗生素對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)的抑制可能是可逆的或不可逆的作用。在可逆作用情況下，當(dāng)抗生素不存在時(shí)，大部分細(xì)菌開始生長(zhǎng)，抗生素對(duì)細(xì)菌的作用稱為抑菌作用；在不可逆作用情況下，只有少數(shù)細(xì)胞或沒有細(xì)胞存活，抗生素的這種作用稱為殺菌作用。 活性測(cè)定 抑菌活性抗生素活性的一種定量測(cè)定方法，是測(cè)定抗生素完全抑制某種細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度，稱為最低(最小)抑菌濃度(MIC)。下面描述的測(cè)定抗生素抗細(xì)菌活性的技術(shù)基本上也適用于酵母、真菌和某些原蟲的活性。在液體培養(yǎng)基中測(cè)定最低抑菌濃度按傳統(tǒng)方法測(cè)定MIC的方法如下：(1)準(zhǔn)備一系列含有同樣體積液體培養(yǎng)基的試管，被測(cè)試菌的接種量在每毫升103-106個(gè)細(xì)胞之間?，F(xiàn)在

3、大都采用含有01m1體積培養(yǎng)基的微孔板。 (2)抗生素的濃度在每個(gè)試管中是遞減的通常以對(duì)倍稀釋法逐管稀釋抗生素的濃度如在第一管中，抗生素的濃度為128 g ml，第二管為64g ml，第三管為32g ml，以此類推)。最后一管不加抗生素，作為細(xì)菌生長(zhǎng)的陽性對(duì)照。在液體培養(yǎng)基中測(cè)定最低抑菌濃度在液體培養(yǎng)基中測(cè)定最低抑菌濃度 (3)培養(yǎng)物在所測(cè)試細(xì)菌的最適溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間，至少繁殖10-15代(通常過夜) (4)以混濁度用肉眼觀察細(xì)菌在系列試管中的生長(zhǎng)情況(實(shí)際上，培養(yǎng)物的混濁度至少在有107個(gè)細(xì)胞ml數(shù)量級(jí)時(shí)才能觀察到)。在液體培養(yǎng)基中測(cè)定最低抑菌濃度在抗生素濃度足以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，試管保持透

4、明。從實(shí)驗(yàn)的角度而論，MIC是指“最后”一透明管中抗生素的濃度，即用肉眼沒有觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素的最低濃度。在液體培養(yǎng)基中測(cè)定最低抑菌濃度顯然，由于所用的方法是以抗生素對(duì)倍稀釋及用肉眼觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)，所得MIC不是一個(gè)十分準(zhǔn)確的數(shù)值。在確定細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，只差管，MIC值則相差一倍。在液體培養(yǎng)基中測(cè)定最低抑菌濃度盡管如此，MIC對(duì)研究抗生素的生物學(xué)及臨床應(yīng)用，均為一個(gè)很有用的參數(shù)。然而應(yīng)當(dāng)明確，MIC值與試驗(yàn)條件及所用菌種有關(guān)，不同菌株對(duì)抗生素敏感性不同；因此, MIC值不盡相同。 在固體培養(yǎng)基中測(cè)定最低抑菌濃度從概念看，這種方法與用液體培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)定是相似的?？股赜煤协傊暮线m的培養(yǎng)基進(jìn)行

5、系列稀釋，然后倒入平皿在培養(yǎng)基表面接種欲測(cè)的菌種(1 l, 菌懸液中的細(xì)菌濃度為109細(xì)胞m1)。在固體培養(yǎng)基中測(cè)定最低抑菌濃度經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)，以沒有細(xì)菌生長(zhǎng)或僅有少數(shù)單個(gè)分散的菌落形成的最低抗生素濃度作為最低抑菌濃度 這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于欲測(cè)細(xì)菌，以簡(jiǎn)化工作量累積曲線同種細(xì)菌的不同株對(duì)同一種抗生素顯示不同的敏感性。要評(píng)價(jià)抗生素的的臨床應(yīng)用前景，必須測(cè)定它對(duì)每一種細(xì)菌諸多臨床分離株的活性這點(diǎn)十分重要。累積曲線對(duì)于每種細(xì)菌的MIC的測(cè)定及其結(jié)果通常以下面幾種形式表示：(1)活性范圍，以較低的和較高的MIC值表示(2）MIC50表示抑制50的所測(cè)菌種的MIC值(3)MIC90表示抑制90所測(cè)菌種的

6、MIC值累積曲線所得結(jié)果，亦可用圖形表示，以每種濃度抑制細(xì)菌株的百分?jǐn)?shù)和相對(duì)應(yīng)的抗生素濃度來制圖。累積曲線的形狀將反映菌株對(duì)抗生素敏感度的不同(圖)。殺菌活性如果抗生素對(duì)細(xì)菌的抑制作用在較廣濃度范圍內(nèi)是可逆的，則稱為抑菌作用；當(dāng)在稍高于MIC值濃度下的抑制作用是不可逆的菌作用。最低殺菌濃度(MBC) MBC測(cè)定方法如下：(1)依照在液體培養(yǎng)基中測(cè)定MIC所有的操作，所用于接種的細(xì)菌數(shù)應(yīng)不小105。(2)經(jīng)培養(yǎng)后，在沒有可見生長(zhǎng)的試管中取出一些液體，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，涂布于含有合適的固體培養(yǎng)基的平皿中。(3)平皿培養(yǎng)48小時(shí)后再觀察生長(zhǎng)，其菌落數(shù)被認(rèn)為是相當(dāng)于活菌數(shù)，MBC被認(rèn)為是在乎皿上沒有菌落生

7、長(zhǎng)的最低抗生素濃度。實(shí)際上，MBC是以有菌落生長(zhǎng)(CFU)的抗生素濃度來判斷。該濃度下菌落生長(zhǎng)數(shù)比原接種量減少1000倍(即01存活數(shù))。殺菌曲線 不同抗生素濃度的殺菌速度是殺菌作用的一個(gè)重要參數(shù)，其測(cè)定方法如下；培養(yǎng)菌液，至少含有5105ml細(xì)菌數(shù)，加入一定量抗生素進(jìn)行培養(yǎng)，在一定間隔時(shí)間內(nèi)取樣，經(jīng)適當(dāng)稀釋，涂布于培養(yǎng)皿，經(jīng)48小時(shí)培養(yǎng)后，菌落計(jì)數(shù)，乘以稀釋度，即得到活菌數(shù)(一個(gè)菌落被認(rèn)為相當(dāng)個(gè)活菌數(shù))。殺菌曲線以不同濃度抗生素和不同菌株進(jìn)行同樣操作，其結(jié)果通常以作圖表示(圖)。以形成菌落數(shù)的細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)與時(shí)間作圖，所得曲線稱為累積殺菌曲線。應(yīng)用累積殺菌曲線來評(píng)價(jià)抗生素的殺菌作用，比用MBC

8、更接近實(shí)際情況。它與臨床上服用抗生素后生物體內(nèi)不同濃度抗生素的作用具有可比性。細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性的測(cè)定為在臨床上合理使用抗生素，經(jīng)常需要了解引起感染的病原菌對(duì)哪些抗生素敏感，對(duì)哪些抗生累耐藥對(duì)此，測(cè)定臨床分離株對(duì)不同抗生素的MIC值是最可靠的。細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性的測(cè)定然而，經(jīng)典式的測(cè)定MIC的方法不太適用于大量菌株的測(cè)定。因而建立了一些較為簡(jiǎn)單而價(jià)廉的方法，其中最常用的是擴(kuò)散法(又被稱為干皿擴(kuò)散法或瓊脂擴(kuò)散法)。在某些國家，尤其是英國，采用瓊脂參入或臨界濃度法，這里將簡(jiǎn)要介紹這些方法。1、 擴(kuò)散法用標(biāo)準(zhǔn)濃度的待測(cè)抗生素溶液，浸泡濾紙片。在瓊脂培養(yǎng)皿上，均勻涂布一層稀釋的待測(cè)細(xì)菌懸液。將含抗生素

9、的濾紙片放在培養(yǎng)皿上，其中的抗生素?cái)U(kuò)散進(jìn)入瓊脂中，產(chǎn)生一個(gè)遞減濃度梯度。培養(yǎng)皿保溫放置1620小時(shí)，其中的微生物生長(zhǎng)起來，密集的或半密集的菌落形成混濁的表層。許多實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)用標(biāo)準(zhǔn)濃度的待測(cè)抗生素溶液，浸泡濾紙片。在瓊脂培養(yǎng)皿上，均勻涂布一層稀釋的待測(cè)細(xì)菌懸液。1、 擴(kuò)散法在抗生素濃度高于MIC值的紙片周圍，細(xì)菌不能生長(zhǎng)，出現(xiàn)了一個(gè)透明的抑菌圈。這個(gè)透明圈的直徑與微生物對(duì)抗生素的敏感性相關(guān)。1、 擴(kuò)散法測(cè)量抑菌圖直徑，并與參考標(biāo)準(zhǔn)(中心點(diǎn))進(jìn)行比較。根據(jù)抑菌圈大小與參考標(biāo)準(zhǔn)的比較結(jié)果，可以將微生物的敏感性分為三類：敏感(抑制透明圈大于或等于參考標(biāo)準(zhǔn))居間(抑制透明圈略小于參考標(biāo)準(zhǔn))不敏感(抑制透明

10、圈明顯小于參考標(biāo)準(zhǔn))(即抗性)。為了更有效地使用擴(kuò)散法，需要將其進(jìn)行嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化，KirbyBauer推薦的方法最為常見。擴(kuò)散法的另變更是，同時(shí)培養(yǎng)待測(cè)菌株和同種微生物的標(biāo)準(zhǔn)菌株，以標(biāo)淮菌株上面形成的抑菌圈作為參考標(biāo)準(zhǔn)，來確定待測(cè)菌的敏感性。 2、 臨界濃度法的原理與固體培養(yǎng)基測(cè)定MIC方法測(cè)定細(xì)菌菌株對(duì)某個(gè)抗生素的敏感性時(shí)，把細(xì)菌接種在含有確定濃度抗生素的瓊脂培養(yǎng)皿上，觀察細(xì)菌是否生長(zhǎng)。與前面的方法不同，臨界濃度法的結(jié)論很明確，生長(zhǎng)或不生長(zhǎng)。 2、 臨界濃度法的原理與固體培養(yǎng)基測(cè)定MIC方法即能形成菌落的菌株，就認(rèn)為是有抗性，否則就是敏感, 而無法確定抗性或敏感的、也無可能將細(xì)菌劃分為“居間

11、”的類別中。為了避免這一缺點(diǎn)，在測(cè)定時(shí)，可以另加一個(gè)抗生素濃度更高的培養(yǎng)皿。這樣，可以對(duì)抗性的水平有一個(gè)了解，從而將那些在較低濃度抗生素培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)，而在較高濃度抗生素培養(yǎng)皿上不生長(zhǎng)的菌株劃分為“居間”。3、散布圖及中心點(diǎn)的選定使用上述方法測(cè)定細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性時(shí)必須要先區(qū)分一定菌株對(duì)抗生素敏感還是抗性的濃度標(biāo)準(zhǔn)。般主要根據(jù)藥理學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)等一系列參數(shù)確定這個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)。其中最主要的是血液中的水平、清除率和血清蛋白結(jié)合情況。3、散布圖及中心點(diǎn)的選定為了確定標(biāo)準(zhǔn)濃度(中心點(diǎn))的臨界抑菌圈直徑、需要測(cè)定大量(100至200株)代表各種致病菌的菌株的MIC值。對(duì)于每一株，要用紙片法測(cè)定一定量抗生素

12、所產(chǎn)生的抑菌圈直徑，然后繪出以MIC值的2為基數(shù)的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)和以抑圈圈直徑作橫坐標(biāo)的散布團(tuán)。3、散布圖及中心點(diǎn)的選定經(jīng)過均方處理，可以其出抑菌圈直徑與MIC對(duì)數(shù)的直線關(guān)系方程式。從中可以獲得中心點(diǎn)，即標(biāo)準(zhǔn)濃度的抑菌圈直徑，還可以算出其他已測(cè)數(shù)值的波動(dòng)值。4抗菌素譜抗菌譜是指某一種微生物對(duì)一組抗生素的敏感或抗性情況。通常是用前面介紹的任一種方法測(cè)定抗菌素譜。在使用擴(kuò)散法時(shí)，在涂布有待測(cè)菌株的培養(yǎng)皿上，放置不同抗生素的標(biāo)準(zhǔn)濾紙片。需要提醒的是，透明圈的直徑并不僅僅依賴于抗生素的活性，還與抗生素的擴(kuò)散速率有關(guān)。如果不加思索地認(rèn)為透明圈越大，抗生素的活性就越高將足錯(cuò)誤的。在使用臨界濃度方法時(shí)，可以利

13、用復(fù)合接種器在一個(gè)加有標(biāo)準(zhǔn)濃度抗生素的培養(yǎng)皿上，同時(shí)接種許多待測(cè)菌株。4抗菌素譜比較準(zhǔn)確的方法是，在液體培養(yǎng)基中測(cè)定抗菌素譜。目前，常常利用部分或全部自動(dòng)化的儀器，在微型系統(tǒng)中測(cè)定抗菌素譜?？股氐南嗷プ饔?相互作用或干擾，是指兩個(gè)抗微生物劑同時(shí)加入微生物培養(yǎng)物時(shí)，一個(gè)抗微生物劑對(duì)另一個(gè)抗微生物劑的作用的影響?？股氐南嗷プ饔脜f(xié)同作用，是指聯(lián)合作用時(shí)的抗微生物效應(yīng)，大于單獨(dú)作用時(shí)的效應(yīng)之和。累加作用，是指聯(lián)合作用時(shí)的抗微生物效應(yīng)，等于單獨(dú)作用時(shí)的效應(yīng)之和。拮抗作用，是指一種成分降低另一種成分的抗微生物效應(yīng)。無關(guān)作用，指的是一種成分(例如對(duì)所測(cè)菌無活性)的存在并不影響另一種成分的活性。抗生素的相

14、互作用盡管這四種情況在概念上非常清楚和明確，但是造成這幾種情況的原因以及描述它們的參數(shù)都復(fù)雜難懂。要定量測(cè)定相互還有一種更簡(jiǎn)單因而也不太準(zhǔn)確的方法檢測(cè)相互作用。抗生素的相互作用將浸泡有不同抗生素的兩個(gè)紙條，以90度垂直交叉，放置在涂布有受試微生物的培養(yǎng)皿上。如果紙條相互交叉部分的抑菌帶變寬了，說明是協(xié)同作用；反之，如果抑制帶變窄了，說明是拮抗作用。影響抗生素活性測(cè)定的因素 體外抗生素活性的測(cè)定受實(shí)驗(yàn)條件的影響如培養(yǎng)基組成、細(xì)菌接種物密度和接種量。此外，用固體培養(yǎng)基測(cè)定時(shí)還有一些特殊因素在定量測(cè)定抗生素時(shí),其他要考慮的因素1抗生素溶液的體積 如果體積不足孔(或紙片)中的抗生素濃度，由于擴(kuò)散，會(huì)隨

15、時(shí)間明顯變化。因?yàn)閿U(kuò)散速率本身介于孔和瓊脂間的濃度梯度的函數(shù)，這樣會(huì)造成透明圈的直徑出現(xiàn)波動(dòng)。在定量測(cè)定抗生素時(shí),其他要考慮的因素2瓊脂的厚度和濃度 當(dāng)瓊脂的厚度較薄時(shí)，透明圈會(huì)大一些。因而在制備大培養(yǎng)平板時(shí)，必須保證板子絕對(duì)水平，這樣才能制備厚度均一的培養(yǎng)平板。在定量測(cè)定抗生素時(shí),其他要考慮的因素關(guān)于濁度法，需要專門指出的是, 生長(zhǎng)速率與溫度關(guān)系很大也就是說，試管中間溫度的小差異，也會(huì)導(dǎo)致大誤差。不論測(cè)定抗生素的濃度，還是測(cè)定菌株的敏感度，情況都是這樣。在定量測(cè)定抗生素時(shí),其他要考慮的因素上面所討論的幾個(gè)因素，只是影響抗生素對(duì)細(xì)菌的活性的諸多因素中的一部分。在使用抑制細(xì)菌生長(zhǎng)方法定量測(cè)定抗生素活性時(shí)，有必要使所有測(cè)定條件特定化和標(biāo)準(zhǔn)化，以使不同的實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)可以重復(fù)。抗菌活性測(cè)定的微型化和自動(dòng)化最近幾年，細(xì)菌多重耐藥性的廣泛擴(kuò)散，在微生物實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的抗菌素譜的需求急劇增加。需要開發(fā)簡(jiǎn)便價(jià)廉的微生物技術(shù)。這方面的需要主要向兩方面發(fā)展：微型化自動(dòng)化抗菌活性測(cè)定的微型化和自動(dòng)化一般在1-2m1體積培養(yǎng)基中進(jìn)行測(cè)試。但是現(xiàn)在、通常在更小的體積如100 l中進(jìn)行，并且廣泛采用塑料板即微孔滴定板(每板96孔，每孔200l。培養(yǎng)基、接種物、抗生素溶液都用多孔移液器加入，節(jié)省了大量材料和勞力?？咕钚詼y(cè)定的微型化和自動(dòng)化已經(jīng)開發(fā)出抑菌圈測(cè)讀和菌落汁數(shù)的自動(dòng)化系統(tǒng)，由光