中國藥典2010高效液相色譜

1、附錄D高效液相色譜法高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內，各組分在柱內被分離，并依次進入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。1.對儀器的一般要求和色譜條件所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應定期檢定并符合有關規(guī)定。（1）色譜柱反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷相等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑；

2、分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含炭量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應選擇孔徑在15nm（lnm=10A）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規(guī)定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在310pm之間。粒徑更?。s2pm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內徑約2mm）。使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當

3、的調整。當對其測定結果產(chǎn)生爭議時，應以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結果為準。以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過C,為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60流動相的PH值應控制在28的。當PH大于8時，可使載體硅膠溶解；當PH小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用PH值大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包裹聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當需使用PH值小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產(chǎn)生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷

4、鍵合硅膠填充劑、有機-無機雜化填充劑等。（2）檢測器最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器、其他常見的檢測器有熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。紫外、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與供試品溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發(fā)光散檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與供試品的質量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與供試品溶液的濃度在一定范圍內呈線性

5、關系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關系，故進行計算時，一般需經(jīng)對數(shù)轉換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應符合紫外可見分光光度法（附錄VA）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。（3）流動相反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇-水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統(tǒng)），如經(jīng)試用不適合時，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應盡可能選用含較低濃度

6、緩沖液的流動相。由于c18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%，否則C1818鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應供試品并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。其中，調整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小于或等于50）%相對于自身的改變量不超過30且相對于總量的改變量不超過10為%限，如30相%對改變量的數(shù)值超過總

7、量的10時%，則改變量以總量的10為%限。對于必須用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下注明。2.系統(tǒng)適用性試驗色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子等四個指標。其中，分離度和重復性是尤為重要。按各品種項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進行試驗，必要時，可對色譜系統(tǒng)進行適當調整，以符合要求。（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質，一般為待測組分或內標物質的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供

8、試品溶液或各品種項下規(guī)定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）R和峰寬（W）或半高峰寬（Wh2），按n=16（tR/w）2或n=5.54（tR/Wh/2）2計算色譜柱的理論板數(shù)。（2）分離度用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關鍵指標?？梢酝ㄟ^測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當?shù)姆椒ń到?，通過測定待測組分與某一降解產(chǎn)物的分離度，對色譜系統(tǒng)進行評價與控制。無論是定性鑒別還是定量分析

9、，均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。除另外有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大于1.5。分離度的計算公式為：2（tR2tR1）2（tR2tR1）R=或R=W1W21.70（W1，h/2W2，h/2）式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W、W2及W,h2、W2，h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬。當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)（）和分離度（）均以峰寬（）的計算結果為準。（3）重復性用于評價連續(xù)進樣中，色譜系統(tǒng)響應值的重復性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面

10、積測量值的相對標準偏差應不大于2.0；采用內標法時，通常配制相當于80、100和120的對照品溶液，加入規(guī)定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標準偏差也應不大于2.0。（4）拖尾因子（T）用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規(guī)定。拖尾因子計算公式為：W0.05hT=2d1式中W005h為0.05峰高處的峰寬；0.05hd1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，峰高法定量時T應在0.951.05之間。峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的準確測量。必要時，應在各品種項下對拖尾因子作出規(guī)定

11、。3.測定法（1）內標法按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：ACss校正因子（f）=ARCR式中A為內標物質的峰面積或峰高；sAr為對照品的峰面積或峰高；RC為內標物質的濃度；sCR為對照品的濃度。R再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：Ax含量（C）=fxACs內s內式中A為供試品（或其雜質）峰面積或峰高；xC為供試品（或其雜質）的濃度；xA內

12、為內標物質的峰面積或峰高；C內為內標物質的濃度；s內s內f為較正因子。采用內標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。（2）外標法按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：含量（）式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中成分或雜質含量時，以定量環(huán)或或自動進樣器進樣為好。（3）加校正因子的主成分自身對照法測定雜質含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質對照品和

13、待測成分對照品各適量，配制測定雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種正文中，用于校正雜質的實測峰面積。這些需作較正計算的雜質，通常以主成分為參照采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。測定雜質含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤?，進樣，調節(jié)儀器靈敏度（以噪音水平可接受為限）或進樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰高約達滿量程的10%25%或其峰面積能準確積分通常含量低于0.5%的雜質，峰面積的相對標準偏差（RSD）應小于10%；含量在0.5%2%的雜質，峰面積的R

14、SD應小于2%。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質含量。（4）不加校正因子的主成分自身對照法測定雜質含量時，若沒有雜質對照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照溶液并調節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間，除另有規(guī)定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質含量。若供試品所含的部分雜

15、質未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜圖I，再記錄等體積純溶劑的色譜圖II。色譜圖I上雜質峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖II上的溶劑峰面積，即為總雜質峰的校正面積。然后依法計算。（5）面積歸一化法按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，通常只能用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質的檢查。附錄X訓A中藥質量標準分析方法驗證指導原則中藥質量標準分析方法驗證的目的是證明采用的方法是否適合于相

16、應檢測要求。在建立中藥質量標準時，分析方需經(jīng)驗證；在處方、工藝等變更或改變原分析方法時，也需對分析方法進行驗證。方法驗證過程和結果均應記載在藥品質量標準起草說明或修訂說明中。需驗證的分析項目有：鑒別試驗、限量檢查和含量測定，以及其他需控制部分（如殘留物、添加劑等）的測定。中藥制劑溶出度、釋放度等檢查中，其溶出量等檢測方法也應作必要驗證。驗證內容有：準確度、精密度（包括重復性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。應視具體方法擬訂驗證的內容。附表中列出的分析項目和相應的驗證內容可供參考。方法驗證內容如下：一、準確度準確度系指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度

17、，一般用回收率（%）表示。準確度應在規(guī)定的范圍內測試。用于定量測定的分析方法均需做準確度驗證。1、測定方法的準確度可用已知純度的對照品做加樣回收測定，即于已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。在加樣回收試驗中須注意對照品的加入量與供試品中被測成分含有量之和必須在標準曲線線性范圍之內；加入的對照品的量要適當，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實性差?；厥章?(C-A)/BX100%式中A為供試品所含被測成分量；B為加入對照品量；C為實測值。2、數(shù)據(jù)要求在規(guī)定范圍內，取同一濃度的供

18、試品，用6個測定結果進行評價，或設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試品溶液進行測定，用9個測定結果進行評價，一般中間濃度加入量與所取供試品含量之比控制在1：1左右。應報告供試品取樣量、供試品中含有量、對照品加入量、測定結果和回收率(%)計算值，以及回收率(%)的相對標準偏差(RSD%)或可信限。二、精密度精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差的相對標準偏差表示。精密度包含重復性、中間精密度和重現(xiàn)性。在相同操作條件下，由同一個分析人員在較短的間隔時間內測定所得結果的精密度稱為重復性；在同一個實驗室，不同時間由不同分

19、析人員用不同設備測定結果之間的精密度稱為中間精密度；在不同實驗室由不同分析人員測定結果之間的精密度稱為重現(xiàn)性。用于定量測定的分析方法均應考察方法的精密度。1、重復性在規(guī)定范圍內，取同一濃度的供試品，用6個測定結果進行評價，或設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試品溶液進行測定，用9個測定結果進行評價。2、中間精密度為考察隨機變動因素對精密度的影響，應進行中間精密度試驗、變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設備等。3、重現(xiàn)性當分析方法將被法定標準采用時，應進行重現(xiàn)性試驗。例如建立藥典分析方法時通過不同實驗室的復核檢驗得出重現(xiàn)性結果。復核檢測的目的、過程和重現(xiàn)性結果均應記載在起草說明中，應

20、注意重現(xiàn)性試驗用的樣品本身的質量均勻性和貯存運輸中的環(huán)境影響因素，以免影響重觀性結果。4、數(shù)據(jù)要求均應報告標準偏差、相對標準偏差或可信限。三、專屬性專屬性系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正確測定出被測成分的特性。鑒別試驗、限量檢查、含量測定等方法均應考察其專屬性。1、鑒別試驗應能與可能共存的物質或結構相似化合物區(qū)分。不含被測成分的供試品，以及結構相似或組分中的有關化合物，均不得干擾測定。顯微鑒別、色譜及光譜鑒別等應附相應的代表性圖像或圖譜。2、含量測定和限量檢查以下含被測成分的供試品（除去含待測成分藥材和飲片或不含待測成分的模似復方）試驗說明方法的專屬性。色譜法、光譜法等應附代表性圖譜，

21、并標明相關成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應符合要求。必要時可采用二極管陣列檢測和質譜檢測，進行峰純度檢查。四、檢測限檢測限系指供試品中被測物能被檢測出的最低量。確定檢測限常用的方法如下。1、直觀法用一系列已知濃度的供試品進行分析，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量?？捎糜诜莾x器分析方法，也可用于儀器分析方法。2、信噪比法僅適用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度供試品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比為3：1或2：1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。3、數(shù)據(jù)要求應附測試圖譜，說明測試過程和檢測限結果。五、定量限定量限系指供試品中被測成分能被定量測定的最低量，其測定結果應具一定準確度和精密度。用于限量檢查的定量測定的分析方法應確定定量限。常用信噪比法確定定量限。一般以信噪比為10：1時相應濃度或注入儀器的量進行確定。六、線性線性系指在設計的范圍內，測試結果與供試品中被測物濃度直接呈正比關系的程度。應在規(guī)定的范圍內測定線性關系?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試品的方法進行測定，至少制備5個濃度的供試品。以測得的響應信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性回歸