食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心分子生物學(xué)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目策劃書(shū)

1、食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心分子生物學(xué)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目書(shū)尊敬的領(lǐng)導(dǎo):感謝貴單位給我機(jī)會(huì)向你們介紹分子生物學(xué)平臺(tái)建設(shè)方案,該分子平臺(tái)包含CR電泳成像系統(tǒng)、熒光定量C儀、微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)、全自動(dòng)病原微生物檢測(cè)系統(tǒng)、脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)，以及酶標(biāo)儀洗板機(jī)、蛋白純化系統(tǒng)、細(xì)胞分選系統(tǒng)等，通過(guò)有機(jī)結(jié)合,技術(shù)互補(bǔ),實(shí)現(xiàn)目前行業(yè)內(nèi)最領(lǐng)先最專(zhuān)業(yè)的分子檢測(cè)技術(shù)，為食品藥品安全提供整體的解決方案。該分子平臺(tái)可開(kāi)展的應(yīng)用與研究方向包括但不限于:、病原微生物快速檢測(cè)、活菌定量檢測(cè)、致病菌溯源2、動(dòng)物源性成分的定性與定量分析3、轉(zhuǎn)基因成分的定性與定量分析4、中藥材的真?zhèn)舞b不、生物制品的檢測(cè)6、藥物安全評(píng)價(jià)7、檢測(cè)新技術(shù)的研究及試劑盒

2、的開(kāi)發(fā)等目 錄O o1-8 z u 一、分子平臺(tái)應(yīng)用實(shí)例 PAGEREF _T33940 3、食源性致病菌快速檢測(cè) PGEF _Toc33940645 h 32、致病菌活菌定量檢測(cè)7、致病菌溯源104、動(dòng)物源性成分檢測(cè)15、肉類(lèi)及肉類(lèi)制品中的成分摻假和虛標(biāo)96、轉(zhuǎn)基因成分定性與定量檢測(cè)237、中藥真?zhèn)舞b不、生物制品檢測(cè)79、藥物安全評(píng)價(jià)43二、要緊儀器介紹41、PR電泳成像系統(tǒng)442、CFX96 Tch型熒光定量P系統(tǒng)453、QX00微滴式數(shù)字PR系統(tǒng)44、Q-Check全自動(dòng)病原微生物檢測(cè)系統(tǒng)7、脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)46、蛋白純化系統(tǒng)47、細(xì)胞分選系統(tǒng)三、分子平臺(tái)推舉規(guī)劃51四、分子平臺(tái)推舉配置5

3、2一、分子平臺(tái)應(yīng)用實(shí)例1、食源性致病菌快速檢測(cè)背景介紹民以食為天，食品作為人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡囊徊糠?它的安全關(guān)系到人類(lèi)的生命安全和生存進(jìn)展，而食源性致病菌是威脅到當(dāng)前食品安全的重要因素之一。盡管近年來(lái)由食源性致病菌引起食物中毒事件的報(bào)道數(shù)量有所減少,然而據(jù)美國(guó)C公布的檢測(cè)報(bào)告顯示，實(shí)驗(yàn)室檢出食源性菌如沙門(mén)氏菌的概率并沒(méi)有降低，因此食源性致病菌對(duì)公共健康的威脅仍不容小覷1。傳統(tǒng)檢測(cè)方法盡管是食源性致病菌檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但因其操作繁瑣,需要耗費(fèi)大量的人力、物力和時(shí)刻，專(zhuān)門(mén)難滿(mǎn)足基層日常檢測(cè)和執(zhí)法需求。特不在我國(guó),一方面食品需求數(shù)量巨大，另一方面食品的加工生產(chǎn)卻呈規(guī)模小、零散等特點(diǎn),因此要保

4、證我國(guó)民眾的食品安全，提高抽樣覆蓋率是十分必要的。假如使用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法,不管從時(shí)刻上依舊經(jīng)費(fèi)上都無(wú)法滿(mǎn)足食品抽檢的需求。因此，有必要研發(fā)和普及一些檢測(cè)速度快、費(fèi)用低、靈敏度高的快檢技術(shù)來(lái)更好地應(yīng)對(duì)和操縱食源性疾病的爆發(fā)。檢測(cè)技術(shù)目前,文獻(xiàn)報(bào)道的食源性致病菌快檢技術(shù)有專(zhuān)門(mén)多,例如:免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、代謝學(xué)檢測(cè)技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、生物傳感器檢測(cè)技術(shù)等。不同的檢測(cè)技術(shù)各有特點(diǎn)，然而能滿(mǎn)足檢測(cè)速度快、費(fèi)用低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),并適用于基層執(zhí)法和檢測(cè)需求的技術(shù)要緊為免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。其中，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有較好的特異性、靈敏性，檢測(cè)效率高、費(fèi)用低,對(duì)人員要求較低且不需要大

5、型儀器等特點(diǎn)，因此目前應(yīng)用得最為廣泛。然而免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)也具有一定的局限性:例如當(dāng)待測(cè)樣品中含有目標(biāo)物的競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)時(shí)，專(zhuān)門(mén)可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果；免疫學(xué)檢測(cè)對(duì)反應(yīng)體系環(huán)境要求較高，錯(cuò)誤的選用試劑會(huì)直接造成檢測(cè)失敗等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速進(jìn)展,目前差不多能夠?qū)崿F(xiàn)在分子水平上對(duì)食源性致病菌的鑒定。其中最為便捷、快速和適用廣泛的鑒定技術(shù)要數(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymrse hain eaction,PCR）。CR技術(shù)起源于20世紀(jì)0年代，由美國(guó)的Kay Mullis發(fā)明。PCR技術(shù)要緊是在體外合適條件下，以DNA(或R）為模板，以一對(duì)人工合成的寡核苷酸為引物在耐熱DNA聚合酶作用下特異性

6、擴(kuò)增目的DN片段的技術(shù)。整個(gè)反應(yīng)由20-45個(gè)循環(huán)組成,每個(gè)循環(huán)均包括高溫變性、低溫退火和適溫延伸3個(gè)步驟。近年來(lái),用CR技術(shù)檢測(cè)食品中食源性致病菌的方法有專(zhuān)門(mén)多種，如常規(guī)PCR、不對(duì)稱(chēng)PCR、免疫PC、套式PCR、熒光實(shí)時(shí)定量CR（qPCR）、多重PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR等。2005年,范宏英等2運(yùn)用多重R技術(shù)成功的將沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O15、綠膿桿菌和副溶血弧菌5種飲用水不得檢出的致病菌同時(shí)快速檢出。2010年,程曉燕等3建立的BR Gren I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)蝦白斑綜合征病毒的方法,取得了較好的實(shí)現(xiàn)效果。目前，基于Taqman探針的熒光實(shí)時(shí)定量PR檢測(cè)技術(shù)差不多被廣

7、泛應(yīng)用于食品性致病菌的檢測(cè)中，并制訂了相應(yīng)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。在2016年新公布的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮(凍）畜、禽產(chǎn)品（GB 277-016)等12項(xiàng)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，同樣涉及到了PCR及qC的檢測(cè)技術(shù)。因此,在前增菌和選擇性增菌后，應(yīng)用CR技術(shù)能夠?qū)悠分惺欠窈惺吃葱灾虏【M(jìn)行檢測(cè)，這種檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)效率高、特異性好以及靈敏度高等。標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)SN/T159.72010進(jìn)出口食品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 87-2007食品中致病菌檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法S/ 41-2010進(jìn)出口乳及乳制品中沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法GB 789.-01食品安全國(guó)家標(biāo)

8、準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)B48.2201食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)G 4789.4216食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)表1.基于PR技術(shù)進(jìn)行食品致病菌檢測(cè)的部分行標(biāo)和國(guó)標(biāo)伯樂(lè)解決方案美國(guó)伯樂(lè)（B-ad)公司作為生命科學(xué)領(lǐng)域的領(lǐng)先者,一直致力為眾多科學(xué)家解決實(shí)際科研應(yīng)用問(wèn)題,提供全套解決方案。所推出的i-Check全自動(dòng)病原微生物檢測(cè)系統(tǒng)，包括核酸提取及通過(guò)認(rèn)證的定量檢測(cè)試劑盒、自動(dòng)化工作站(可選）、定量PCR儀器和專(zhuān)業(yè)的分析軟件,僅需一步增菌,在8-24小時(shí)內(nèi)獲得結(jié)果，為致病菌快速、準(zhǔn)確檢測(cè)提供了最佳解決方案,其具體特點(diǎn)如下：

9、檢測(cè)項(xiàng)目:配套8種常見(jiàn)的致病菌檢測(cè)，包括：沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O57:7、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌、對(duì)O族的大腸桿菌進(jìn)行確認(rèn)和鑒定（檢測(cè)個(gè)要緊的血清型:O157：H7，O111，O26，O13,O145,O4，1)、單增李斯特氏菌、李斯特菌屬、彎曲菌、腸炎沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌、阪崎腸桿菌、軍團(tuán)菌、嗜肺軍團(tuán)菌和酒香酵母菌；其中軍團(tuán)菌、嗜肺軍團(tuán)菌和酒香酵母可進(jìn)行定性和定量檢測(cè);對(duì)市面上其他廠家各種致病菌檢測(cè)試劑盒兼容性好；檢測(cè)兼容性：多種致病菌和檢測(cè)項(xiàng)目可同時(shí)同機(jī)進(jìn)行;檢測(cè)性能：檢測(cè)中含內(nèi)標(biāo)質(zhì)控和陽(yáng)性對(duì)比,內(nèi)部質(zhì)控指示沒(méi)有假陰性反應(yīng),有效幸免檢測(cè)的假陰性,所有檢測(cè)項(xiàng)目都為qn探針;病原菌NA提取:專(zhuān)利

10、的提取流程至少提取100ul增菌液,無(wú)需離心，一步即可提取DN,提取時(shí)刻分至30分鐘。且可整合最新的FreDNA去除處理方案,有效去除食品中死菌DN干擾，尤其適合通過(guò)輻照、巴氏消毒處理或以噬菌體作為加工助劑等類(lèi)型的食品樣本;儀器開(kāi)放性：此檢測(cè)儀為開(kāi)放性操作平臺(tái)，廠家配備的檢測(cè)試劑盒在2-2小時(shí)檢測(cè)目標(biāo)菌;非廠家配備試劑檢測(cè)時(shí)刻可能會(huì)有所延長(zhǎng)；檢測(cè)靈敏度：檢測(cè)食品僅需一步增菌,檢出限1CU25g；檢測(cè)通量：94個(gè)樣本加上2個(gè)對(duì)比；定量PR儀特點(diǎn)：6通道檢測(cè)，配備觸控屏，可單機(jī)操作;定量PR儀溫度操縱:具有動(dòng)態(tài)溫度梯度功能，能夠同時(shí)運(yùn)行8個(gè)不同的溫度；定量PC儀溫控準(zhǔn)確度：0.2；溫度均一性:.4

11、;定量PR儀最高升降溫速率：2.5/秒;認(rèn)證認(rèn)可：軟件分析系統(tǒng)及試劑獲得AOC、AFNOR等國(guó)內(nèi)、國(guó)際認(rèn)證，結(jié)果自動(dòng)判讀：直接讀取“有”或“無(wú)”的結(jié)果；擴(kuò)展使用:除可用于致病菌檢測(cè)外,本系統(tǒng)還可應(yīng)用于核酸定量、基因表達(dá)水平分析、基因突變檢測(cè)、MO檢測(cè)及產(chǎn)物特異性分析、流行病學(xué)試驗(yàn)等多種檢測(cè)、研究領(lǐng)域；數(shù)據(jù)分析:能夠?qū)Σ≡⑸镞M(jìn)行定性和定量檢測(cè)，并可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，并有中文軟件及免費(fèi)升級(jí)；質(zhì)控功能:每份測(cè)試的試劑內(nèi)均自帶質(zhì)控功能,儀器能直接確認(rèn)每一份測(cè)試的試劑質(zhì)量 圖1. Bio-Rd iQ-he全自動(dòng)病原微生物檢測(cè)系統(tǒng) 圖2. iQ-Chec手動(dòng)及自動(dòng)病原微生物快速檢測(cè)流程erencea

12、kthvathsalm P,Rajendrn VK， Saran U, et a.Immunomgtic nanparcle bsd quantitative PCRor rapi dttinf Slonella .Micrchim Aca,213， 1：12411482 范宏英, 吳清, 吳若菁, 等. 飲用水中5 種致病菌多重P技術(shù)檢測(cè)研究J. 微生物學(xué)通報(bào), 205, 3（):102-07. 程曉燕, 劉慶慧, 黃捷. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)蝦白斑綜合征病毒方法的建立J 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 20, 38():1426-1426.、致病菌活菌定量檢測(cè)背景介紹從前面我們明白，食源性致病菌檢測(cè)關(guān)

13、于食品安全檢測(cè)的重要性，而關(guān)于食品中活菌的定量檢測(cè)才能真實(shí)反映出該樣品的污染水平,因此如何幸免一些通過(guò)輻照、巴氏消毒等處理后的樣品中死菌的干擾而僅定量檢測(cè)活菌含量就顯得至關(guān)重要。傳統(tǒng)方法如分離培養(yǎng)法等不能滿(mǎn)足快速檢測(cè)的目的，而現(xiàn)有的致病菌基因檢測(cè)方法如一般PC、等常常無(wú)法有效識(shí)不食品中的活菌和死菌,導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果。因此開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)活菌的方法專(zhuān)門(mén)有必要。檢測(cè)技術(shù)目前,研究者們利用活菌和死菌細(xì)胞膜完整性不同,開(kāi)發(fā)了EA-qPCR/PCR和PMA-qPCRPR法。其中，疊氮溴化乙錠（EMA)和疊氮溴化丙錠（PMA）是一種結(jié)合能和N共價(jià)交聯(lián)的光敏材料，光照能夠使E/PM的光敏基團(tuán)轉(zhuǎn)化為氮

14、賓自由基,其能夠和DNA發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，進(jìn)而阻斷DA分子的C擴(kuò)增,同時(shí)這種染料只能選擇性的滲透死菌的細(xì)胞膜,因此可被用于和PC技術(shù)相結(jié)合定量檢測(cè)活菌。然而有研究發(fā)覺(jué),EMA具有細(xì)胞毒性，可進(jìn)入部分活性細(xì)胞內(nèi)阻礙檢測(cè)結(jié)果，其應(yīng)用受到限制,因此目前研究中更多采納無(wú)細(xì)胞毒性的PMA染料結(jié)合PCR法定量檢測(cè)食品中的活菌含量1，2。除了qP技術(shù)外，數(shù)字PCR技術(shù)（digital lymeas cin reato,dPC)是近兩年來(lái)新興的生物分子檢測(cè)技術(shù)，以一種全新的方法進(jìn)行核酸分子的靈敏檢測(cè)和絕對(duì)定量,與傳統(tǒng)PCR、定量CR相比,其結(jié)果的精確度、準(zhǔn)確性和靈敏度均有大幅度提升，被稱(chēng)為“第三代PR”技術(shù),標(biāo)志

15、著PC技術(shù)以后進(jìn)展的方向。伯樂(lè)解決方案：結(jié)合PMA處理的微滴式數(shù)字PCR法美國(guó)伯樂(lè)公司作為數(shù)字CR技術(shù)的開(kāi)拓者和領(lǐng)導(dǎo)者,開(kāi)發(fā)和研制了最新型的QX200微滴式數(shù)字CR(dropet digita PCR,dCR）系統(tǒng),其技術(shù)原理是可將核酸模板、引物探針等組成的熒光PR反應(yīng)體系均一等分為近2萬(wàn)份納升級(jí)穩(wěn)定的“油包水”微滴(微反應(yīng)單元),等于將有限的目的模板進(jìn)行近似于無(wú)限的稀釋分開(kāi)，在通過(guò)PCR擴(kuò)增之后，含有模板的微滴會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)，其余微滴無(wú)陽(yáng)性信號(hào)。依據(jù)陽(yáng)性液滴與液滴總數(shù)的比值,可按泊松分布規(guī)律推算出反應(yīng)液中目的模板濃度,實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR技術(shù)以其準(zhǔn)確性好、靈敏度高、無(wú)需任何外

16、參校準(zhǔn)物質(zhì)、可對(duì)樣品核酸進(jìn)行絕對(duì)定量等優(yōu)勢(shì)，差不多在臨床診斷、單細(xì)胞基因表達(dá)、環(huán)境微生物檢測(cè)、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證和食品安全定量檢測(cè)等方面得到了廣泛的研究和應(yīng)用。圖1. - QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)商業(yè)化數(shù)字PCR儀的出現(xiàn),克服了研究者們各自研究工作中操作復(fù)雜、重復(fù)性差、通量低等困難，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化和高通量的應(yīng)用，從而進(jìn)一步的推動(dòng)和擴(kuò)大了數(shù)字PC技術(shù)的進(jìn)展和應(yīng)用范圍,在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域獲得了廣泛的關(guān)注、引起了極大的研究熱情并差不多取得了可喜的成果。董蓮華等3用dCR建立了大腸桿菌O57：H7的定量檢測(cè)方法，定量檢測(cè)限為4 cop/0ul，定性檢測(cè)限為3opis/20ul。Rthrok等4將dd

17、PR與禽類(lèi)加工行業(yè)現(xiàn)有常規(guī)兩種檢測(cè)方法PCR和傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法進(jìn)行了比較，研究了在采納不同取樣時(shí)刻和取樣方法時(shí)這三種檢測(cè)方法得到的禽類(lèi)加工設(shè)備中要緊傳染性致病微生物檢測(cè)結(jié)果的差不。結(jié)果表明,PR能夠從更早的從樣本中，也能夠更多的從不同的生產(chǎn)加工設(shè)備中檢出病原菌的特異性基因,且定量檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)鑒定檢測(cè)方法一致。在食品致病菌活菌檢測(cè)中，威海及山東出入境檢驗(yàn)檢疫局的王靜等,首次將PMA與C技術(shù)相結(jié)合,開(kāi)發(fā)了高靈敏、高選擇性的檢測(cè)食源性致病菌的新方法。能夠在死菌存在的條件下定量檢測(cè)沙門(mén)氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活菌，消除了“假陽(yáng)性”結(jié)果的出現(xiàn)，利用脫氧膽酸鈉（S)對(duì)樣品預(yù)處理，使得更容

18、易穿過(guò)死菌細(xì)胞膜。D-PMAddR整個(gè)過(guò)程快速簡(jiǎn)便,成功檢測(cè)雞肉等樣品中沙門(mén)氏菌及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的含量(最低檢出限為 copies/20ul體系)。與基于qCR的方法相比,具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線等優(yōu)點(diǎn)。伯樂(lè)解決方案：iQ-heckFreeDA去除方案另外一種活菌檢測(cè)的解決方法確實(shí)是前面提到的iQCheck食源性致病菌檢測(cè)方案中采納的死菌Fee DA去除方案，其原理是試劑盒中有一種可選擇性識(shí)不游離N并將之降解的酶,只需在裂解細(xì)胞提取DNA前用此酶和相應(yīng)緩沖液于37處理樣品15-0分鐘即可極大消除死菌A干擾，隨后加入裂解液可失活此酶,不阻礙后續(xù)活菌D的提取。較之PMA處

19、理法，該方法能夠極大地簡(jiǎn)化操作,提高效率,且易于整合進(jìn)iQ-Chck病原微生物檢測(cè)流程中。采納此方法處理后平均可降低源自死菌游離DNA的2-3個(gè)數(shù)量級(jí)(約個(gè)Cq值)的結(jié)果干擾，極大地降低了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn),為食源性致病菌活菌檢測(cè)提供了便捷而有效的解決途徑。圖2. iQChecFree DA去除方案原理及流程表 比較不同含量李斯特死菌在經(jīng)Q-Chk Fr A去除處理前后的檢測(cè)結(jié)果差異Rern於穎,王文靜，陸曄. PMA-qPC定量檢測(cè)畜禽肉類(lèi)中沙門(mén)菌活菌的研究J. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),015， 30(5）: 500-06.2徐義剛,李淑云,鞠文東,等. PM結(jié)合定量P方法檢測(cè)食品中活性志賀菌的研究.黑龍江

20、畜牧獸醫(yī)，201， 07:2-28.3董蓮華， 張玲, 姜君,等. 大腸桿菌O157:H7微滴數(shù)字PR定量方法的建立J 分析化學(xué), 215, 43（3）： 319-324. 4 Rhroc M J,iett K , Kiepper B H, etal.antifiion o ZoonticBacterl athges wtin Cmmercil ultry Prcesing Water Sales Uing Drlet Digial J. Adncesin irobiology, 21,03(05):403-4115 王靜, 張慧敏, 魏瑋, 等 D-PAdPC檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的研究 J.

21、食品工業(yè)科技,206, 37(10): 67-.王靜, 劉玉敏, 李春喜, 等 M-PCR檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌J. 微生物學(xué)通報(bào), 201(1).3、致病菌溯源背景介紹由細(xì)菌、病毒、真菌等通過(guò)食物、環(huán)境接觸等方式傳播引起的感染性疾病，是食源性疾病中最重要的組成部分,每年在全世界爆發(fā)的食源性疾病中,由細(xì)菌等導(dǎo)致的感染占90%以上，嚴(yán)峻阻礙、危害公眾健康。同時(shí),隨著全球貿(mào)易往來(lái)、旅游等活動(dòng)日益頻繁，該種感染經(jīng)常呈現(xiàn)出跨國(guó)家、跨地域、跨省市的多地點(diǎn)、大范圍的爆發(fā),成為一種世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此,在快速確認(rèn)致病菌種類(lèi)的同時(shí)，及時(shí)對(duì)致病菌進(jìn)行溯源分析是一項(xiàng)特不迫切而重要的任務(wù)。只有找

22、到了致病菌的來(lái)源，相關(guān)部門(mén)才能在源頭上進(jìn)行部署和操縱，才能幸免感染或中毒事件的進(jìn)一步爆發(fā)和擴(kuò)散。針對(duì)上述問(wèn)題,美國(guó)CDC于199年開(kāi)始建立PusNt系統(tǒng)并成功應(yīng)用。該系統(tǒng)在暴發(fā)流行病的識(shí)不、分析、預(yù)警和改善加強(qiáng)操縱措施中發(fā)揮了重要作用。在200年美國(guó)毒菠菜事件中爆發(fā)的大規(guī)模O:7型致病病菌感染，確實(shí)是利用了PlsNe快速鑒定和溯源的。美國(guó)ulseet在28-2009年花生醬污染鼠傷寒沙門(mén)菌暴發(fā)疫情中,迅速查明傳染源，召回問(wèn)題食品,有效操縱疫情蔓延（1),PulseNet因此被列為21世紀(jì)公共衛(wèi)生領(lǐng)域最具阻礙力的創(chuàng)新之一,獲得美國(guó)科技創(chuàng)新獎(jiǎng)（2）。我國(guó)在20年9月正式啟動(dòng)了useNEChi。在2

23、00年C群流腦暴發(fā)處置和25年豬鏈球菌感染暴發(fā)處置的過(guò)程中,Plseet hia都起到了特不大的作用。技術(shù)原理與實(shí)驗(yàn)流程ulseNt系統(tǒng)利用標(biāo)準(zhǔn)化的PFE(Psed-Field l lerporsis脈沖場(chǎng)電泳)技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室即可得到某種菌株或其亞型的分子分型的圖譜,比如大腸桿菌O157、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、李斯特菌、彎曲桿菌和霍亂弧菌等,該圖譜能夠以圖片的形式上傳和分享，通過(guò)圖譜中顯示的差異條帶與特異條帶,就能夠與useNT數(shù)據(jù)庫(kù)中成千上萬(wàn)個(gè)類(lèi)似的圖譜進(jìn)行比對(duì)。通過(guò)分布在各地的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果，建立網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)及時(shí)交流和比對(duì)數(shù)據(jù),如此就能夠?qū)Σ煌瑫r(shí)刻、地點(diǎn)爆發(fā)的疫情中得到的不同的分離株同

24、時(shí)進(jìn)行分析,從而評(píng)估食源性傳染病發(fā)生的關(guān)聯(lián)以及調(diào)查和快速鑒定暴發(fā)的來(lái)源(圖1)。 圖1，致病菌溯源分析示意圖PFE技術(shù)是用于分離大分子量NA片段的一種電泳方法。儀器交替改變電場(chǎng)方向,大片段D在凝膠中不斷重新定向,DA分子越大，重排所需要的時(shí)刻越長(zhǎng),DNA分子越小，所需時(shí)刻越短，據(jù)此就能夠按其大小分開(kāi)(圖2)。圖2，脈沖場(chǎng)電泳原理示意圖利用限制性核酸內(nèi)切酶，將基因組N酶切成有限數(shù)目(12）的大分子量限制性片段之后，通過(guò)F使這些限制性片段彼此分離,形成電泳圖譜。由于不同菌株的電泳圖譜具有高度特異性,從而識(shí)不特異的菌株。PFE檢測(cè)技術(shù)具有敏感、特異、分辨率高等特點(diǎn),同時(shí)在實(shí)驗(yàn)操作中結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好

25、、已易于標(biāo)準(zhǔn)化,因此被稱(chēng)為細(xì)菌分子分型的金標(biāo)準(zhǔn),也是目前世界上最為成功推廣的技術(shù)。世界各國(guó)的疾控系統(tǒng)在建立和使用G技術(shù)的過(guò)程中,絕大部分差不多上使用BIO AD公司的脈沖場(chǎng)電泳設(shè)備和成像系統(tǒng)。CHEF MapeXA系統(tǒng)是市面上最先進(jìn)的脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)，能夠用在所有PE相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域中。它將CE、PACE、DR、FG和AFE多種技術(shù)結(jié)合在一起，還能夠提供“多矢量”功能和“二次脈沖”程序，使我們研究的所有片段大小范圍的DNA分子都能得到最佳分離。 FGE的實(shí)驗(yàn)流程如下(圖3）：菌株分離和接種。在實(shí)驗(yàn)前一天做好菌株的平板培養(yǎng)，備用。制備小膠塊Plug。挑取適量的菌體,用細(xì)胞懸浮液進(jìn)行懸浮,同提早配置

26、好的膠溶解在一起，利用模具進(jìn)行灌膠，待膠凝固后，取出小膠塊。細(xì)菌裂解。將小膠塊放入提早配置好的裂解液中，在搖床上進(jìn)行細(xì)菌的DA裂解過(guò)程。膠塊清洗。利用滅菌水將膠塊反復(fù)清洗。膠塊內(nèi)N的酶切。選取特定的內(nèi)切酶,對(duì)膠塊進(jìn)行酶切。電泳。先將小膠塊切成合適大小后貼在電泳梳底端邊緣，然后進(jìn)行灌膠，膠凝固后將梳子拔出即可。在電泳設(shè)備上設(shè)置好電泳的程序,將膠放入電泳槽,即可進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。圖像獵取。電泳結(jié)束后利用成像設(shè)備對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行拍照保存。利用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行膠圖的進(jìn)一步分析。圖3，脈沖場(chǎng)電泳實(shí)驗(yàn)流程電泳結(jié)束后，通過(guò)成像設(shè)備，我們能夠得到檢測(cè)樣本的膠圖(圖4左)，將該膠圖導(dǎo)入數(shù)據(jù)分析軟件之后，能夠同其他樣本

27、的膠圖進(jìn)行分析比對(duì),得到聚類(lèi)分析的結(jié)果(圖右)，進(jìn)行溯源分析,確認(rèn)該次致病菌的爆發(fā)源頭。圖4，脈沖場(chǎng)電泳實(shí)驗(yàn)流程案例(1)208年，黑龍江完達(dá)山藥業(yè)的刺五加注射液由于細(xì)菌污染,導(dǎo)致3人死亡，多人出現(xiàn)嚴(yán)峻不良反應(yīng),PFGE的方法在該起事件溯源調(diào)查中發(fā)揮了重要的作用。(2)201年,德國(guó)爆發(fā)了由腸出血性大腸桿菌O104:H4感染的 “毒黃瓜”事件,后蔓延至16個(gè)國(guó)家,5人死亡,400多人受感染，PFGE分型對(duì)該事件的溯源分析提供了最可靠的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。(3)2006年0月，美國(guó)爆發(fā)“毒菠菜”事件,共有26個(gè)州199人感染，其中102例(51%)住院,31例(16%）進(jìn)展為腎衰竭，3例死亡。通過(guò)GE的

28、方法最終確定“自然選擇”食品公司袋裝菠菜中的O15:7為此次大腸桿菌感染事件的元兇。Referenc()PeliL, ElsnR， Ltl C et l., nternaionaotbreaof Salmnelenftenerg in 00. Ero Srvell2007;12(4):pii=218.31 l 2008. (2)LetuchtA, Reaer M. asetro tudy f Slmonel partphi infection asociatd wirvel to nya, urkey: ue. urSrveil. 19;3(44):pi=137 Augut00 、動(dòng)物源性成分

29、分析背景介紹“動(dòng)物源性成分”的檢測(cè)一直以來(lái)差不多上檢驗(yàn)檢疫部門(mén)的重點(diǎn)檢測(cè)項(xiàng)目,直接關(guān)系到飼料安全、食品安全等公眾健康熱點(diǎn)問(wèn)題。動(dòng)物源性副產(chǎn)品因富含蛋白質(zhì)、鈣等營(yíng)養(yǎng)成分而被應(yīng)用于畜禽飼料中,但現(xiàn)有證據(jù)表明,在動(dòng)物飼料中添加未經(jīng)加熱處理牛源性飼料或感染過(guò)癢病因子的牛羊肉/肉骨粉后能夠引發(fā)和傳播瘋牛?。˙E）,我國(guó)差不多制定了多個(gè)關(guān)于動(dòng)物源性飼料生產(chǎn)治理的相關(guān)條例。另外，在食品領(lǐng)域，關(guān)于動(dòng)物源成分的檢測(cè)也是必不可少的。古有“掛羊頭賣(mài)狗肉”,而今,食品摻假、肉類(lèi)摻假等丑聞在世界范圍內(nèi)層出不窮，比如213年歐洲發(fā)生的“馬肉風(fēng)波”震驚全球，而在中國(guó)，各種肉類(lèi)造假的新聞更是不絕于耳，屢見(jiàn)不鮮,“牛肉膏”制造

30、假牛肉,鴨肉制成“涮羊肉和烤羊肉”，還有“假肉丸魚(yú)丸”,遍布大小集貿(mào)市場(chǎng)、餐飲飯館，乃至深受消費(fèi)者信賴(lài)的知名超市， “摻雜使假”可謂無(wú)孔不入。綜上所述,對(duì)動(dòng)物源性成分的檢測(cè)是關(guān)系到食品安全、民眾健康的重點(diǎn)檢測(cè)項(xiàng)目,必須嚴(yán)加執(zhí)行。依據(jù)當(dāng)前實(shí)施的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),利用PCR技術(shù)、電泳、成像系統(tǒng),以及熒光定量PCR系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)食品及飼料中多種常見(jiàn)動(dòng)物源性的快速檢測(cè)(如表1）。近些年,隨著技術(shù)的不斷更新,一些新的檢測(cè)方法如微滴式數(shù)字PCR技術(shù)也越來(lái)越多的被應(yīng)用于動(dòng)物源成分的檢測(cè)項(xiàng)目中來(lái)，其檢測(cè)結(jié)果及發(fā)表文獻(xiàn)受到了多方關(guān)注，正逐漸成為檢驗(yàn)檢疫部門(mén)的 “新寵”。動(dòng)物源性成分分析的經(jīng)典檢測(cè)方

31、法 要緊優(yōu)勢(shì)：1. 操作簡(jiǎn)便，簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可掌握2.日常使用成本較低3.開(kāi)放的平臺(tái)，兼容性高性能要求：1. 能一次處理1-96個(gè)樣品2. PCR每管反應(yīng)體積可達(dá)0.2mL3. 支持不同反應(yīng)條件同步進(jìn)行，可同時(shí)運(yùn)行8個(gè)不同溫度4. 20分鐘內(nèi)可完成單次PCR擴(kuò)增反應(yīng)5. 凝膠成像系統(tǒng)具備足夠的分辨能力，CCD分辨率達(dá)1360 1024定性PCR法平臺(tái)的要緊組成：熱循環(huán)擴(kuò)增儀電泳儀凝膠成像系統(tǒng) 定性PCR法用于源性成分的分析是目前最為常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)，在現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體系統(tǒng)中是各類(lèi)成分鑒定鑒不的要緊手段之一。該方法適用范圍廣，加上操作簡(jiǎn)便及成本較低的特點(diǎn)，使得其在各級(jí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中普遍使用。基于不同物種

32、成分具有各自獨(dú)特的核酸序列，一般PCR法能夠輕松實(shí)現(xiàn)各類(lèi)源性成分有無(wú)的定性分析，然而不能進(jìn)行定量分析。 要緊優(yōu)勢(shì)：1. 操作簡(jiǎn)便2.日常使用成本適中3.閉管設(shè)計(jì)，減少實(shí)驗(yàn)室污染的可能性能要求：1. 能一次處理1-96個(gè)樣品2. 開(kāi)放的平臺(tái)，兼容性強(qiáng)3. 多個(gè)通道，能夠滿(mǎn)足多組引物的同時(shí)檢測(cè)4. 40分鐘完成擴(kuò)增全過(guò)程 在過(guò)去的幾年中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)展迅速，在現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體系中，也陸續(xù)有相關(guān)的檢測(cè)方法出臺(tái)。該方法能夠直接定量分析，和常規(guī)的定性PCR法互為補(bǔ)充，共同滿(mǎn)足源性成分分析的檢測(cè)需求。 實(shí)時(shí)熒光PCR方法能夠在單臺(tái)儀器上完成從PCR擴(kuò)增到檢測(cè)結(jié)果分析的全過(guò)程，操作上更加簡(jiǎn)便。Bi

33、o-Rad 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 平臺(tái)，提供全中文操作軟件，在操作上更加符合國(guó)內(nèi)客戶(hù)的使用適應(yīng)。儀器采納觸摸屏設(shè)計(jì)，可在單機(jī)上完成各項(xiàng)操作而無(wú)需外置電腦。此外，該儀器性能穩(wěn)定，即使搬運(yùn)也無(wú)需額外的校準(zhǔn)，適用于各類(lèi)衛(wèi)生應(yīng)急事件的快速響應(yīng)。 微滴式數(shù)字PCR技術(shù)是近幾年興起的第三代PCR檢測(cè)技術(shù)。該平臺(tái)的原理是：將PCR反應(yīng)液進(jìn)行油包水的微滴化處理，形成約2萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，每個(gè)微滴里均可進(jìn)行一個(gè)PCR反應(yīng)，最后將所有微滴逐個(gè)通過(guò)檢測(cè)器進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，最后通過(guò)推斷微滴的陰陽(yáng)性來(lái)推斷樣本的濃度是多少拷貝。事實(shí)上驗(yàn)流程要緊包括反應(yīng)液配置、生成微滴、PCR、檢測(cè)微滴、數(shù)據(jù)分析這幾個(gè)步驟。 這種最新的技

34、術(shù)無(wú)需任何標(biāo)準(zhǔn)品就能夠直接對(duì)樣本進(jìn)行定量分析，軟件自動(dòng)顯示樣本中某種動(dòng)物源成分有多少個(gè)拷貝數(shù)，最低可檢測(cè)單拷貝，關(guān)于含量極低的樣本同樣能夠穩(wěn)定檢出，且該方法對(duì)對(duì)樣本質(zhì)量及擴(kuò)增效率要求不高。 性能要求：1. 能一次處理1-96個(gè)樣品2. PCR每管反應(yīng)體積可達(dá)0.2mL3. 支持不同反應(yīng)條件同步進(jìn)行，可同時(shí)運(yùn)行8個(gè)不同溫度4. 20分鐘內(nèi)可完成單次PCR擴(kuò)增反應(yīng)5. 凝膠成像系統(tǒng)具備足夠的分辨能力，CCD分辨率達(dá)1360 1024要緊優(yōu)勢(shì)：1.無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量2.實(shí)現(xiàn)超高靈敏度或高通量的樣品分析3.兼容 TaqMan 探針或 EvaGreen成功案例：德國(guó)根特大學(xué)的科學(xué)家Floren等

35、人將數(shù)字PCR技術(shù)用于動(dòng)物源性成分的定量檢測(cè)。研究結(jié)果顯示，將兩種不同動(dòng)物的基因組DNA按照不同比例進(jìn)行混合后，利用微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)，質(zhì)量百分比定量檢測(cè)限和定性檢測(cè)限分不能夠達(dá)到0.01%和0.001%。上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心潘良文主任實(shí)驗(yàn)室最近表的文章中，采納微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)建立了一種新的檢測(cè)方法，利用該方法能夠在肉制品的重量(mg)、DNA重量(ng)及特定目標(biāo)基因的拷貝數(shù)(copies/ul)之間建立良好的線性關(guān)系，進(jìn)而檢測(cè)肉類(lèi)樣品中豬肉和雞肉的準(zhǔn)確重量及含量，并利用上述方法對(duì)超市中買(mǎi)到的11種不同的肉制品其中雞肉和豬肉的比例進(jìn)行了實(shí)測(cè)，得到了專(zhuān)門(mén)好的結(jié)

36、果。標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)B/T2019206飼料中牛羊源性成分的定性檢測(cè) 定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（CR）法GB/T 2101-207動(dòng)物源性飼料中豬源性成分定性檢測(cè)方法 PR方法GB/T 2110-2007動(dòng)物源性飼料中兔源性成分定性檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PC方法B/T 21320動(dòng)物源性飼料中哺乳動(dòng)物源性成分定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR方法GB/T2104-07動(dòng)物源性飼料中反芻動(dòng)物源性成分(牛，羊，鹿)定性檢測(cè)方法 PR方法G/ 115-20動(dòng)物源性飼料中狗源性成分定性檢測(cè)方法 PCR方法G 21106207動(dòng)物源性飼料中鹿源性成分定性檢測(cè)方法 PCR方法G/T 21107-2007動(dòng)物源性飼料中馬、驢

37、源性成分定性檢測(cè)方法 PC方法G/ 2565-2010明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法N205208食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法_實(shí)時(shí)R法SN 2557-2010畜肉食品中牛成分定性檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 27-201動(dòng)物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測(cè)方法S/T 730.1-2013食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第1部分:貂成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 3730.2-2013食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第2部分:狗成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法N/ 3730.3-2013食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第部分:狐貍成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒

38、光PCR法SN/T37.-2013食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法第4部分:驢成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光CR法SN/T 7305-2013食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第5部分:馬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光CR法N/3730.6013食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第6部分:貓成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 730.72013食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法第7部分：水牛成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒PCR法SN/T 730.8-203食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法第8部分：豬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光C法SN/731.1-01食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法第部分:鶴鶉成分檢測(cè)R法ST3731-2013食

39、品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法第2部分：鵝成分檢測(cè)P法SN/T 3313-21食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法第3部分:鴿子成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PC法SN/T 3731.401食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法第4部分：火雞成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法S/T3731.-213食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法 第5部分:鴨成分檢測(cè) PC法SNT 373.6-21食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法第6部分:鷓鴣成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PC法表1，動(dòng)物源成分檢測(cè)的部分標(biāo)準(zhǔn)和方法eferenceCFloren,iedemnn，B.Breg eal.， siesidentificionand quntific

40、tinin atand meat proucts usidoplet diitalPCR（ddPCR);Food Chemtr173(25)14-10.Ca, ，.v et al., Quanitativ Analis of ork d Ccen routsbyrple DigiP；ioMed Rserh teatinal olum 04. 5、肉類(lèi)及肉類(lèi)制品中的成分摻假和虛標(biāo)背景介紹當(dāng)前，關(guān)于研究者、消費(fèi)者、食品工業(yè)和政策制定者而言,食品安全差不多上一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題，尤其是肉類(lèi)摻假和成分虛標(biāo)的問(wèn)題。23年“歐洲馬肉事件”和“沃爾瑪狐貍?cè)馐录钡纫幌盗械娜忸?lèi)摻假事件為肉類(lèi)安全敲響了警鐘,成分虛標(biāo)更

41、是存在于高達(dá)20%的食品檢測(cè)案例中(Balli et al., 09)。食品安全是食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心的一項(xiàng)重中之重的工作，因此如何快速有效的檢測(cè)肉類(lèi)摻假及成分虛標(biāo)是需要解決的首要任務(wù)。檢測(cè)平臺(tái)與技術(shù)路線目前，對(duì)肉類(lèi)樣品進(jìn)行分子檢測(cè)的技術(shù)分為兩大類(lèi):DN分析和蛋白質(zhì)分析。蛋白質(zhì)分析要緊有EIA、C等方法，然而由于靈敏度不高、操作復(fù)雜等特點(diǎn)其推廣應(yīng)用受到了專(zhuān)門(mén)大的限制；DNA分析要緊有瓊脂糖凝膠電泳分析(定性分析）、熒光定量PC（qPC）以及近幾年受到廣泛關(guān)注的數(shù)字CR技術(shù)(PCR)。本部分旨在通過(guò)介紹以LIA、qPCR以及dPCR為基礎(chǔ)搭建的檢測(cè)平臺(tái),為檢測(cè)工作提供更多簡(jiǎn)便靈敏的可選方案。EL

42、IA檢測(cè)平臺(tái)（適用于所有的肉類(lèi)制品)檢測(cè)背景:肉類(lèi)成分鑒定的方法較多,其中EISA的靈敏度相對(duì)較高,特異性好,而且操作相對(duì)簡(jiǎn)單，易于推廣。本文旨在建立通用的ELISA檢測(cè)平臺(tái)以進(jìn)行肉類(lèi)成分鑒定。 檢測(cè)平臺(tái)：Coed Meapcis dentiicatinKt (ELIS-TEK, Gainevlle,FL)及鑒定物種相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體。檢測(cè)流程：將100種生鮮肉類(lèi)和熟食樣品稱(chēng)取25在水中攪碎并進(jìn)行攪拌，直到無(wú)塊狀物；將混合物100加熱5 in，濾出不溶物后用kt和單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果：檢測(cè)試劑盒的OD為1。LISA方法能夠特異性的鑒定各種肉類(lèi)摻假成分。Bi-R解決方案：Bio-ad提供

43、xMARK、iMARK等不同系列的酶標(biāo)儀產(chǎn)品，體型小巧，操作簡(jiǎn)單，同時(shí)具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析能力，能夠?yàn)槿粘５腖ISA工作提供更多的關(guān)心。另外,io-ad同時(shí)提供WesternBlotg全套的3解決方案，為蛋白質(zhì)印跡研究提供簡(jiǎn)潔便利、定量精確的工作平臺(tái)。qPR檢測(cè)平臺(tái)（以牛肉和豬肉為例）檢測(cè)背景：常規(guī)的檢測(cè)肉類(lèi)成分的手段包括LIA、PAGE和PAGIF等蛋白質(zhì)分析技術(shù),但由于肉類(lèi)樣品加熱后蛋白質(zhì)變性而難以檢測(cè)出細(xì)微的成分區(qū)不；本研究試圖建立高效、靈敏的R檢測(cè)平臺(tái)，以作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)手段。檢測(cè)平臺(tái):qR平臺(tái)。牛肉檢測(cè)以磷酸二酯酶基因(osPE）為檢測(cè)位點(diǎn),擴(kuò)增子長(zhǎng)度為04bp,豬肉檢測(cè)以ranoi

44、n gene中的108b的片段（suR)為檢測(cè)位點(diǎn)。檢測(cè)流程:待檢測(cè)樣品用改良的CAB方法和蛋白酶K進(jìn)行處理,最后溶解于0l的TEBuffr中。分不以M標(biāo)記susRY和bosE,進(jìn)行qPCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果:兩種檢測(cè)體系的LOD均達(dá)到了0.1%(/),超過(guò)絕大部分的蛋白質(zhì)分析法;當(dāng)檢測(cè)豬肉時(shí),假如制品里含有超過(guò)1(w)的土雞肉時(shí),會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，但其他情況特異性均特不行,因此能夠作為肉類(lèi)成分的常規(guī)檢測(cè)手段。io-Rad解決方案:FX o系列熒光定量PCR儀具有精確、快速、靈活三大優(yōu)勢(shì)，切實(shí)解決日常工作中核酸定量的繁瑣操作、性能不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。精確：長(zhǎng)壽命LED光源和一體化檢測(cè)器,壽命長(zhǎng)，性能穩(wěn)

45、定，掃描模式無(wú)光程差。快速:快速升降溫,支持fas CR;即插即用,無(wú)需校正;溫度梯度功能,快速優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件；真正5通道(450-70nm)檢測(cè)。 靈活:可實(shí)現(xiàn)多臺(tái)儀器連接;真正單機(jī)運(yùn)行，實(shí)時(shí)顯示,可儲(chǔ)存00個(gè)結(jié)果。ddPCR檢測(cè)平臺(tái) 檢測(cè)背景：現(xiàn)有熒光定量PC方法用來(lái)做絕對(duì)定量,然而因?yàn)镈NA擴(kuò)增效率和擴(kuò)增質(zhì)量在對(duì)比和檢測(cè)樣品間存在差異，因此其應(yīng)用受到專(zhuān)門(mén)大限制。檢測(cè)平臺(tái)：本文獻(xiàn)報(bào)道的ddPCR以g的2基因?yàn)闃?biāo)記,采納拷貝數(shù)百分比的方法評(píng)估肉類(lèi)及制品中的物種成份。檢測(cè)流程:待測(cè)樣品采納改良的CAB方法及加熱方法進(jìn)行N提取，后續(xù)采納ddPC對(duì)線粒體CY基因和基因組中的F2基因分不進(jìn)行dCR檢測(cè)

46、。檢測(cè)結(jié)果:相比現(xiàn)有的qPC手段,ddPCR的檢測(cè)下限和定量下限分不達(dá)到0.00%和.0%的水平；之前的物種鑒定方法通常以線粒體NA上CYT基因?yàn)闃?biāo)記，然而假如要定量分析物種成份,以線粒體為靶標(biāo)往往會(huì)得出過(guò)高或過(guò)低的結(jié)果（偏低7至偏高60）,這是因?yàn)椴煌M織細(xì)胞中線粒體拷貝數(shù)差異極大，而F2基因是更合適的檢測(cè)靶點(diǎn)。檢測(cè)背景:肉類(lèi)檢測(cè)中，qPR由于其依靠于擴(kuò)增效率及標(biāo)準(zhǔn)曲線的特點(diǎn)應(yīng)用受到了極大的限制,本文獻(xiàn)致力于進(jìn)展利用數(shù)字PCR建立完整的檢測(cè)平臺(tái)，以揭示dPCR結(jié)果與成分含量之間的關(guān)系。檢測(cè)平臺(tái):ddCR檢測(cè)平臺(tái)。豬肉檢測(cè)是以 So beta-ai (ACT) gee(VIC）作為檢測(cè)靶點(diǎn),雞

47、肉檢測(cè)是以allus gausrasforming gow factor bea-3(GFB3) ee(FAM）作為檢測(cè)位點(diǎn)。檢測(cè)流程:所有的用于驗(yàn)證檢測(cè)方法靈敏度和特異性的樣品按照酚氯仿方法抽提DA,通過(guò)蛋白酶K消化后處理得到NA。直接進(jìn)行dP檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果：最終得到dP結(jié)果得到的拷貝數(shù)濃度建立的DNA拷貝數(shù)DNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線和DNA質(zhì)量/食品干重標(biāo)準(zhǔn)曲線兩條曲線,以這兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線代入樣品dPR結(jié)果得到的兩種基因拷貝數(shù)計(jì)算食品中不同成分的質(zhì)量和比例。B-Rd解決方案：X20微滴式數(shù)字PR系統(tǒng)以其無(wú)與倫比的準(zhǔn)確性和精確性為日常的核酸定量工作提供了極大的關(guān)心。真正的絕對(duì)定量,無(wú)需外參標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)

48、曲線，數(shù)據(jù)重復(fù)性更好更高的準(zhǔn)確性，不再依靠CR效率,抑制劑耐受度高,模板適用度廣更高的分辨率，可識(shí)不倍濃度差異,適合GMO等類(lèi)型實(shí)驗(yàn)更高的靈敏度,最低可檢測(cè)到1個(gè)opy的argeReferee 1 Baln N Z,ogesen F K, Karsson A H.Speceeminaon - Cwe detect andquantify meat adulterai？J. Mea Science, 2，83(2)：165-176、轉(zhuǎn)基因成分定性、定量檢測(cè)檢測(cè)背景隨著轉(zhuǎn)基因作物的全球性栽培和商業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因食品、食品配料和添加劑等進(jìn)入市場(chǎng)和餐桌，而轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食用安全、環(huán)境

49、安全風(fēng)險(xiǎn)及倫理等問(wèn)題越來(lái)越受到社會(huì)的關(guān)注和重視。截至204年，全球28個(gè)國(guó)家的180萬(wàn)農(nóng)民種植了1.81億公頃的轉(zhuǎn)基因作物。全球60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)制定了相關(guān)的法律和法規(guī)，要求對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品(包括食品和飼料)進(jìn)行標(biāo)識(shí)治理。Fig.1 GlobalMap ofBiotechCrp Countries and g-Countres 01目前，國(guó)際上關(guān)于轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)治理要緊分為4類(lèi):一是自愿標(biāo)識(shí)，如美國(guó)、加拿大、阿根廷等；二是定量全面強(qiáng)制標(biāo)識(shí)，即對(duì)所有產(chǎn)品只要其轉(zhuǎn)基因成分含量超過(guò)閾值就必須標(biāo)識(shí)，如歐盟規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分超過(guò)09%、巴西規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分超過(guò)1%必須標(biāo)識(shí);三是定量部分強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)，即對(duì)特定類(lèi)不

50、產(chǎn)品只要其轉(zhuǎn)基因成分含量超過(guò)閾值就必須標(biāo)識(shí),如日本規(guī)定對(duì)豆腐、玉米小食品、納豆等24種由大豆或玉米制成的食品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí),設(shè)定閾值為5%；四是定性按目錄強(qiáng)制標(biāo)識(shí),即凡是列入目錄的產(chǎn)品,只要含有轉(zhuǎn)基因成分或者是由轉(zhuǎn)基因作物加工而成的，必須標(biāo)識(shí)。目前，我國(guó)是唯一采納定性按目錄強(qiáng)制標(biāo)識(shí)方法的國(guó)家,也是對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)最多的國(guó)家。截至201年,我國(guó)差不多批準(zhǔn)5個(gè)轉(zhuǎn)基因作物事件,包括批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因棉花、玉米、大豆,油菜等。關(guān)于這些轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)，轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)及標(biāo)識(shí)治理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我國(guó)已組建了國(guó)家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會(huì)、全國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全治理標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)

51、委員會(huì)等機(jī)構(gòu)公布轉(zhuǎn)基因生物安全標(biāo)準(zhǔn),并認(rèn)定了40多個(gè)國(guó)家級(jí)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試機(jī)構(gòu)，承擔(dān)農(nóng)業(yè)部或申請(qǐng)人托付的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物定性定量檢測(cè)、鑒定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)工作。轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法是對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行確定、生產(chǎn)和治理的必要手段,需要準(zhǔn)確有效的檢測(cè)技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因作物的特點(diǎn)確實(shí)是在其宿主基因組中導(dǎo)入一段外源NA序列，這段序列進(jìn)行翻譯而表達(dá)出新的蛋白質(zhì),從而使宿主獲得新的性狀，如對(duì)某些昆蟲(chóng)的抗性或?qū)Τ輨┑哪托?。因此，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè),實(shí)質(zhì)確實(shí)是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中是否存在外源DN序列或重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的特征是含有外源基因和表現(xiàn)出導(dǎo)入基因的性狀,因此，目前對(duì)轉(zhuǎn)

52、基因產(chǎn)品的檢測(cè)采納的技術(shù)路線有兩條，檢測(cè)外源NA序列或檢測(cè)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)。對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)常用的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Ezy-LemunoSrbet Asa,EISA）、蛋白質(zhì)印跡法（WesterBlt）等;對(duì)外源DN序列的檢測(cè)要緊是基于聚合酶鏈反應(yīng)(PomeaseChn Rection,C)的方法，如定性PCR、實(shí)時(shí)熒光CR法以及數(shù)字PR方法等。這些方法不僅能確定樣品中是否存在轉(zhuǎn)基因物質(zhì)，還能夠通過(guò)對(duì)一系列的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測(cè)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的含量提供相對(duì)定量或絕對(duì)定量的檢測(cè)結(jié)果。Fig.2 EvltonofGMO etectin mthds an assci

53、atdreerce mil1999年,Vaitilngom等首次利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了定量檢測(cè)，目前實(shí)時(shí)熒光PCR方法差不多成為食品中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)最常用的方法。實(shí)時(shí)熒光PC是一種通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量分析的方法,該技術(shù)能夠?qū)D(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量分析，同時(shí)還具有靈敏度高、特異性和可靠性強(qiáng)、實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光PC方法要實(shí)現(xiàn)D的定量分析，需要一系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分不構(gòu)建參照基因和目標(biāo)外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并最終通過(guò)計(jì)算外源基因序列與參照基因序列的量的比值實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)。然而,該方法由于阻礙因素較多，如標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品的背景不

54、同、不同基因擴(kuò)增效率的不同、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍（分析樣品必須落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上下限范圍內(nèi))、低拷貝DNA擴(kuò)增的重復(fù)性差等，均會(huì)造成定量結(jié)果的準(zhǔn)確性差;而且，目前轉(zhuǎn)基因品系的有效標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)難以得到制備和標(biāo)準(zhǔn)化,將導(dǎo)致大量的轉(zhuǎn)基因品系無(wú)法通過(guò)該方法進(jìn)行定量檢測(cè)。數(shù)字 PCR(gal PCR）是近年來(lái)在實(shí)時(shí)熒光 C 基礎(chǔ)上進(jìn)展起來(lái)的新一代DNA定量檢測(cè)技術(shù)。PR 是將 PCR 體系分配到大量的小的獨(dú)立反應(yīng)單元中，實(shí)現(xiàn)微反應(yīng)單元的單個(gè)DA分子的 PCR 擴(kuò)增,結(jié)合熒光的終點(diǎn)檢測(cè)及泊松分布原理、依照陽(yáng)性微滴與陰性微滴數(shù)的比例計(jì)算目標(biāo)N的拷貝數(shù),實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。dPCR方法降低了標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率對(duì)檢測(cè)結(jié)果的阻

55、礙，擺脫了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的依靠，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)A分子的絕對(duì)定量;同時(shí)提高了低拷貝DNA擴(kuò)增的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。相比實(shí)時(shí)熒光PC,dPC具有更高的檢測(cè)靈敏度、精確性和重復(fù)性,同時(shí)無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),是轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的新方法。ig. 數(shù)字PCR的差不多原理轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái)及檢測(cè)流程定性PCR法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Pymease ch reaction，PCR）又稱(chēng)為PCR技術(shù),是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法。通過(guò)聚合酶的作用,在體外快速特異的擴(kuò)增目的序列,使微量、特定的目的基因片段在短期內(nèi)呈數(shù)量級(jí)的復(fù)制,擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖電泳和染色后再凝膠成像系統(tǒng)中直接觀看。通過(guò)對(duì)外源基因序列的特異性擴(kuò)增檢測(cè),

56、定性PCR在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,是一種快速、靈敏的核酸檢測(cè)方法。該方法常常利用檢測(cè)轉(zhuǎn)基因操作的通用序列（如3S啟動(dòng)子、OS終止子等）或?qū)氲耐庠椿虻奶禺愋孕蛄衼?lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè),因此用該方法需要依照標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)序列特異性的引物對(duì)。要緊檢測(cè)流程為:1）樣本制備；）DN抽提;）PR擴(kuò)增及電泳;4）成像及結(jié)果分析；5）結(jié)果及推斷。美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rd）公司作為生命科學(xué)領(lǐng)域的領(lǐng)先者，一直致力為眾多科學(xué)家解決實(shí)際科研應(yīng)用問(wèn)題，提供全套檢測(cè)平臺(tái)。C1000Touh PR儀性能優(yōu)良,彩色大觸摸屏便于輕松編程,適用所有CR反應(yīng);io-Ra提供完整系列的電泳儀,輕便、編程簡(jiǎn)單，并經(jīng)最嚴(yán)格的國(guó)

57、際安全標(biāo)準(zhǔn)IEC001認(rèn)證,是人員與環(huán)境的最高安全保證;全能型成像分析系統(tǒng)ChemiDoc能夠進(jìn)行一般成像、化學(xué)發(fā)光成像、多通道熒光成像，同時(shí)提供出色的靈敏度和廣泛的適應(yīng)性,是一個(gè)高端實(shí)驗(yàn)室的明智之選。定性PR的方法具有操作簡(jiǎn)單、快速，靈敏度較高，無(wú)需專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備（僅需一般PCR及凝膠電泳、成像系統(tǒng)）,實(shí)驗(yàn)成本較低等特點(diǎn),且該方法能夠通過(guò)成像后目的基因的有無(wú)推斷轉(zhuǎn)基因成分的有無(wú)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光CR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用R擴(kuò)增期間熒光信號(hào)的累積、通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析的方法,已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研

58、究的各個(gè)領(lǐng)域。依照所使用的熒光信號(hào)來(lái)源的不同，實(shí)時(shí)熒光PR技術(shù)要緊分為基于SR Green I的染料法和基于序列特異性熒光探針的探針?lè)ā?shí)時(shí)熒光CR技術(shù)需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定量分析檢測(cè)。在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)領(lǐng)域,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通常是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測(cè)目的外源基因序列的重組質(zhì)粒分子，在定性檢測(cè)中作為陽(yáng)性對(duì)比,在定量檢測(cè)中用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，是相對(duì)定量和絕對(duì)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分含量的基礎(chǔ)。目前構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要緊集中在比較重要的、世界范圍內(nèi)種植比較廣的玉米、大豆和棉花轉(zhuǎn)基因品系，其他還有許多轉(zhuǎn)基因品系的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還難以得到，還需要進(jìn)一步的完善相關(guān)的測(cè)試和標(biāo)準(zhǔn)化鑒定。除此之外，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品不同

59、的背景來(lái)源、參照基因與目的基因的擴(kuò)增效率的差異，以及低拷貝外源基因的檢測(cè)靈敏度等因素差不多上制約實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)應(yīng)用的阻礙因素。盡管如此,實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)仍是目前最為常用的轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)方法。Fi. 實(shí)時(shí)熒光PCR法定量檢測(cè)原理實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分的操作流程要緊為:樣本制備、D提取、實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)備及擴(kuò)增、結(jié)果分析及檢測(cè)報(bào)告。具體如下：實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)流程示意圖實(shí)時(shí)熒光PC技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度較高、特異性好等特點(diǎn),建立實(shí)時(shí)熒光C技術(shù)平臺(tái)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)，需要熒光定量PC儀及配套的熒光PC反應(yīng)試劑耗材。BoRa公司X6 Tuch六通道

60、的實(shí)時(shí)PR系統(tǒng)包括了先進(jìn)的光學(xué)系統(tǒng)和精確的溫控系統(tǒng),安裝簡(jiǎn)單且無(wú)需校準(zhǔn),可提供高靈敏、可信賴(lài)的檢測(cè)結(jié)果，在轉(zhuǎn)基因的定量檢測(cè)領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用。Bio-Rad FX6 toch數(shù)字PR技術(shù)數(shù)字R技術(shù)是指將加入了熒光基因的 PR 反應(yīng)體系分配到大量的、小的獨(dú)立反應(yīng)單元中,實(shí)現(xiàn)微反應(yīng)單元的單個(gè)NA分子的 PCR 擴(kuò)增，結(jié)合熒光的終點(diǎn)檢測(cè)及泊松分布原理、依照陽(yáng)性微滴與陰性微滴數(shù)的比例計(jì)算目標(biāo)A的拷貝數(shù),實(shí)現(xiàn)A分子絕對(duì)定量的一種方法。dPCR技術(shù)已應(yīng)用于基因表達(dá)差異研究、基因組學(xué)研究、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、微生物檢測(cè)及轉(zhuǎn)基因食品或成分的檢測(cè)等,在轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)領(lǐng)域已有大量的應(yīng)用文獻(xiàn)的發(fā)表及支持。dPCR絕對(duì)定