2010藥典 核磁共振波譜法

1、 核磁共振波譜法核磁共振（NMR）波譜是一種基于特定原子核在外磁場中吸收了與其裂分能級間能量差相對應的射頻場能量而產生共振現(xiàn)象的分析方法。核磁共振波譜通過化學位移值、譜峰多重性、偶合常數(shù)值、譜峰相對強度和在各種二維譜及多維譜中呈現(xiàn)的相關峰，提供分子中原子的連接方式、空間的相對取向等定性的結構信息。核磁共振定量分析以結構分析為基礎，在進行定量分析之前，首先對化合物的分子結構進行鑒定，再利用分子特定基團的質子數(shù)與相應譜峰的峰面積之間的關系進行定量測定。帶正電荷的原子核在作自旋運動時，可產生磁場和角動量，其磁性用核磁矩p表示，角動量P的大小與自旋量子數(shù)I有關（核的質量數(shù)為奇數(shù)，I為半整數(shù)；核的質量數(shù)

2、為偶數(shù)，I為整數(shù)或0），其空間取向是量子化的；p也是一個矢量，方向與P的方向重合，空間取向也是量子化的，取決于磁量子數(shù)m的取值（m=I,I-1,-I，共有2I+1個數(shù)值）。對于iH、13C等I=1/2的核，只有兩種取向，對應于兩個不同的能量狀態(tài)，粒子通過吸收或發(fā)射相應的能量在兩個能級間躍遷。當自旋量子數(shù)10的磁核處于一個均勻的外磁場H。中時，磁核因受到磁場的作用力而圍繞著外磁場方向作旋轉運動，同時仍然保持本身的自旋。這種運動方式稱為拉摩進動。原子核的進動頻率由下式決定：其中Y為旋磁比，是原子核的基本屬性之一。不同原子核的Y值不同，其值越大，核的磁性越強，在核磁共振中越容易被檢測。如果提供一個射

3、頻場，其v滿足：Af=hv其中h為普朗克常數(shù)，貝U：即射頻場的頻率正好等于在磁場H0中的核進動頻率，那么核就能吸收這一射頻場的能量，導致在兩個能級間躍遷，產生核磁共振現(xiàn)象。核磁共振波譜是一專屬性較好但靈敏度較低的分析技術。低靈敏度的主要原因是基態(tài)和激發(fā)態(tài)的能量差非常小，通常每十萬個粒子中兩個能級間只差幾個粒子（當外磁場強度約為2T時）。核磁共振波譜儀常見的有兩類核磁共振波譜儀：經典的連續(xù)波（CW）波譜儀和現(xiàn)代的脈沖傅里葉變換（PFT）波譜儀，目前使用的絕大多數(shù)為后者。其組成主要包含超導磁體、射頻脈沖發(fā)射系統(tǒng)、核磁信號接收系統(tǒng)和用于數(shù)據(jù)采集、儲存、處理以及譜儀控制的計算機系統(tǒng)（見圖1）。圖1PF

4、T核磁共振波譜儀的主要組成在脈沖核磁共振波譜儀上，一個覆蓋所有共振核的射頻能量的脈沖將同時激發(fā)所有的核，當被激發(fā)的核回到低能態(tài)時產生一個自由感應衰減（FID）信號，它包含所有的時間域信息，經模數(shù)轉換后通過計算機進行傅里葉變換得到頻（率）譜。實驗中按照儀器操作規(guī)程設置譜儀參數(shù)，如脈沖傾倒角和與之對應的脈沖強度、脈沖間隔時間、數(shù)據(jù)采樣點（分辯率）、采樣時間等。采集足夠的FIDs,由計算機進行數(shù)據(jù)轉換，調整相位使盡可能得到純的吸收峰，用參照物校正化學位移值，用輸出設備輸出譜圖。核磁共振譜核磁共振信號（峰）可提供四個重要參數(shù)：化學位移值、譜峰多重性、偶合常數(shù)值和譜峰相對強度。處于不同分子環(huán)境中的同類原

5、子核具有不同的共振頻率，這是由于作用于特定核的有效磁場由兩部分構成：由儀器提供的特定外磁場以及由核外電子云環(huán)流產生的磁場（后者一般與外磁場的方向相反，這種現(xiàn)象稱為“屏蔽”）。處于不同化學環(huán)境中的原子核，由于屏蔽作用不同而產生的共振條件差異很小，難以精確測定其絕對值，實際操作時采用一參照物作為基準，精確測定樣品和參照物的共振頻率差。在核磁共振波譜中，一個信號的位置可描述為它與另一參照物信號的偏離程度，稱為化學位移。共振頻率與外磁場強度H0成正比，磁場強度不同，同一化學環(huán)境中的核共振頻率不同。為了解決這個問題，采用位移常數(shù)6來表示化學位移：=+4%其中。為樣品中磁核的共振頻率，U為參照物中磁核的共

6、振頻率，U為儀器的輸出sro頻率（單位：MHz）0為參照物的化學位移值。因此也可用氘代溶劑中殘留的質子r信號作為化學位移參考值。常用的化學位移參照物是四甲基硅烷（TMS），其優(yōu)點是化學惰性；單峰；信號處在高場，與絕大部分樣品信號之間不會互相重疊干擾；沸點很低（270，容易去除，有利于樣品回收。而對于水溶性樣品，常用3-三甲基硅基丙酸鈉-d4（TSP）或2,2-二甲基-2-硅戊基-5-磺酸鈉（DSS），其化學位移值也非常接近于零。DSS的缺點是其三個亞甲基質子有時會干擾被測樣品信號，適于用作外參考。化學位移僅表示了磁核的電子環(huán)境，即核外電子云對核產生的屏蔽作用，但未涉及同一分子中磁核間的相互作用

7、。這種磁核間的相互作用很小，對化學位移沒有影響，但對譜峰的形狀有著重要影響。這種磁核之間的相互干擾稱為自旋自旋偶合，由自旋偶合產生的多重譜峰現(xiàn)象稱為自旋裂分，裂分間距（赫茲）稱為偶合常數(shù)J,偶合常數(shù)與外磁場強度無關。偶合也可發(fā)生在氫核與其他核（屛0）之間，如19F、13C和31P等。核磁共振信號的另一個特征是它的強度。在合適的實驗條件下（見“測定方法”），譜峰面積或強度正比于引起此信號的質子數(shù)，因此可用于測定同一樣品中不同質子或其他核的相對比例，以及在加入內標后進行核磁共振定量分析。測定方法在熟悉核磁共振理論的基礎上，應多了解樣品的性質，并嚴格遵守操作規(guī)程，正確操作儀器。不正確的樣品制備、譜儀

8、調整及參數(shù)設置會導致譜圖數(shù)據(jù)的分辨率和靈敏度降低，甚至給出假峰和錯誤數(shù)據(jù)。通常應用最多的是1H（質子）核磁共振波譜，其他還包括19F、31P、13c核磁共振波譜以及各種二維譜等。測定前，一般須先將供試品制成合適的溶液。溶劑選擇合適的溶劑除了對樣品有較好的溶解度外，其殘留的信號峰應不干擾所分析樣品的信號峰。氘代溶劑同時提供異核鎖信號。應盡可能使用高氘代度、高純度的溶劑，并注意氘原子會對其他原子信號產生裂分。常用的核磁共振波譜測定用氘代溶劑及其殘留質子信號的化學位移見表1。表1氫譜測定中常用的溶劑溶劑名稱分子式殘留質子信號S(ppm)可能殘留的水峰6(ppm)*氘代氯仿CDCl37.261.56氘

9、代甲醇CD3OD3.314.87氘代丙酮(CD3)2CO2.052.84氘代二甲亞砜DMSO-d,62.503.33氘代乙腈cd3cn1.942.13氘代苯C6D67.16/重水D2O/4.79氘代二氧六環(huán)二氧六環(huán)-d83.55/氘代乙酸cd3co2d2.05,8.5*/氘代三氟乙酸cf3co2d12.5*/氘代吡啶C5D5N7.1&7.55,8.704.80氘代N,N-二甲基甲酰胺DMF-d72.77,2.93,8.05/*：活潑質子的化學位移值是可變的，取決于溫度和溶質的變化適用于氫譜(1HNMR)的溶劑同樣也適用于氟譜(19FNMR),常見的有CDC13、CD3OD、D20、DMSO-d

10、6、DMF-d7、酸和堿等，通常不含氟的溶劑均可使用。同時3267應注意含氟樣品中氟原子對其他核的J-偶合。樣品制備按各品種項下的要求。樣品的濃度取決于實驗的要求及儀器的類型，測定非主要成分時需要更高的濃度。供試液的體積取決于樣品管的大小及儀器的要求，通常樣品溶液的高度應達到線圈高度的2倍以上。選用符合定量要求的核磁管，常用外徑為5或10mm,長度為15或20cm的核磁管。當樣品量較少時可選用微量核磁管。測定將樣品管放入譜儀中，先進行樣品和譜儀的調諧，再仔細對譜儀勻場，使譜儀達到最佳工作狀態(tài)。設置合適的實驗參數(shù)，采樣，完成后再進行圖譜處理，并分段積分。同一個實驗通?？赏瑫r得到定性和定量數(shù)據(jù)。對

11、于核磁共振定量分析，實驗參數(shù)的正確設置非常重要，以保證每個峰的積分面積與質子數(shù)成正比。必須保證有足夠長的馳豫時間，以使所有激發(fā)核都能完全馳豫，因而定量分析通常需要更長的實驗時間。定性和定量分析核磁共振波譜分析可廣泛應用于結構確證，熱力學、動力學和反應機理的研究，以及用于定量分析。定性分析核磁共振波譜是一個非常有用的結構解析工具，化學位移提供原子核環(huán)境信息，譜峰多重性提供相鄰基團情況以及立體化學信息，偶合常數(shù)值大小可用于確定基團的取代情況，譜峰強度（或積分面積）可確定基團中質子的個數(shù)等。一些特定技術，如雙共振實驗、化學交換、使用位移試劑、各種二維譜等，可用于簡化復雜圖譜、確定特征基團以及確定偶合

12、關系等。對于結構簡單的樣品可直接通過氫譜的化學位移值、偶合情況（偶合裂分的峰數(shù)及偶合常數(shù)）及每組信號的質子數(shù)來確定，或通過與文獻值（圖譜）比較確定樣品的結構，以及是否存在雜質等。與文獻值（圖譜）比較時，需要注意一些重要的實驗條件，如溶劑種類、樣品濃度、化學位移參照物、測定溫度等的影響。對于結構復雜或結構未知的樣品，通常需要結合其他分析手段，如質譜等方能確定其結構。定量分析與其他核相比,1H核磁共振波譜更適用于定量分析。在合適的實驗條件下，兩個信號的積分面積（或強度）正比于產生這些信號的質子數(shù)：其中舛、A2為相應信號的積分面積（或強度）；叫、N2為相應信號的總質子數(shù)。如果兩個信號來源于同一分子中

13、不同的官能團，上式可簡化為其中叫、n2分別為相應官能團中的質子數(shù)。如果兩個信號來源于不同的化合物，則A=如加】=如叭/Mln2nt2nWi/M2其中mm2分別為化合物1和化合物2的分子個數(shù)；W、W2分別為其質量；M、M2分別為其分子量。由式（2）和（3）可知，核磁共振波譜定量分析可采用絕對定量和相對定量兩種模式。在絕對定量模式下，將已精密稱定重量的樣品和內標混合配制溶液，測定，通過比較樣品特征峰的峰面積與內標峰的峰面積計算樣品的含量（純度）。合適的內標應滿足如下要求：有合適的特征參考峰，最好是適宜寬度的單峰；內標物的特征參考峰與樣品峰分離；能溶于分析溶劑中；其質子是等權重的；內標物的分子量與特

14、征參考峰質子數(shù)之比合理；不與待測樣品相互作用等。常用的內標物有：1,2,4,5-四氯苯、1,4-二硝基苯、對苯二酚、對苯二酸、苯甲酸芐酯、順丁烯二酸等。內標的選擇依據(jù)樣品性質而定。相對定量模式主要用于測定樣品中雜質的相對含量（或混合物中各成分相對含量），由式（3）來計算。絕對定量模式：溶劑、內標和化學位移參照物：按各品種項下的規(guī)定。供試品溶液制備：分別取供試品和內標適量（按各品種項下的規(guī)定），精密稱定，置同一具塞玻璃離心管中，精密加入溶劑適量，振搖使完全溶解，加化學位移參照物適量，振搖使溶解，搖勻，即得。測定方法：將供試品溶液適量轉移至核磁管中，正確設置儀器參數(shù)，調整核磁管轉速使旋轉邊峰不干擾待測信號，記錄圖譜。用積分法分別測定各品種項下規(guī)定的特征峰峰面積及內標峰峰面積，重復測定不少于5次，取平均值，由下式計算供試品的量Ws：Ws=WrX（As/Ar）X（Es/Er）其中Wr為內