三乙烯四胺對(duì)c-MYC啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用教學(xué)提綱

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。三乙烯四胺對(duì)c-MYC啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用-三乙烯四胺對(duì)c-MYC啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用鄧小紅劉建輝*鄭旭煦陳剛郭麗霞(重慶工商大學(xué)藥物化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)研究中心，重慶，400067)摘要目的探討三乙烯四胺(triethylenetetramine,TETA)對(duì)c-MYC啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用。方法構(gòu)建c-MYC啟動(dòng)子的熒光報(bào)告質(zhì)粒及其突變體，經(jīng)過(guò)序列測(cè)定后，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24h后，以終濃度為0mol/L,0.1mol/L,1.0mol/L,10mol/L,100mol/L的TETA處理，測(cè)定其啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，計(jì)

2、算TETA對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性抑制率。結(jié)果成功構(gòu)建c-MYC啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒PGL3-Basic/c-MYCNHEIII1promoter及其突變體pGL3-Basci/c-MYCNHEIII1promotermutant。將二者分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，TETA可以劑量依賴的抑制c-MYC啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，而對(duì)突變體的轉(zhuǎn)錄活性抑制作用明顯下降。結(jié)論TETA能通過(guò)c-MYC啟動(dòng)子上的超敏元件對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。關(guān)鍵詞：TETA；c-MYC啟動(dòng)子；G四鏈體；轉(zhuǎn)錄活性基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金(30600813,30701020)、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃（NCET-07-0913）以及重慶市科委重點(diǎn)基礎(chǔ)

3、項(xiàng)目（CSTC,2005BA5023）的資助。作者簡(jiǎn)介:鄧小紅，女，在讀博士*通訊作者:劉建輝，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師Tel:(023)62769652Email:jhliuTETAregulatesthetranscriptionofc-MYCpromoterbyenhancingthestabilityofG-quadruplexDENGXiao-hong,LIUJian-hui*,ZHENGXu-xu,CHENGang,GUOLi-xia(ResearchCenterofPharmaceuticalChemistry&ChemicalBiology,ChongqingTechnolog

4、yandBusinessUniversity,Chongqing,400067,China)ABSTRACT:OBJECTIVETostudytheeffectoftriethylenetetramine(TETA)onthetranscriptionofc-MYCpromoter.METHODSAfterthewildandmutantreportergeneplasmidscontainingthec-MYCNHEIII1sequencewereconstructed,thetwoplasmidweretransfectedintoHEK293cells.Thetransfectedcel

5、lswerereplatedinto96wellsplate,andtreatedwithdifferentconcentrationsofTETA(0.0mol/L,0.1mol/L,1mol/L,10mol/L,100mol/L)forabout6-8h,theluciferaseactivitywasdeterminedwithitssubstrateBrightGlo.TheinhibitingrateofTETAonthereportergenewerecalculatedbytheluciferaseactivity.RESULTSTheluciferasereportgenepl

6、asmidsincludingpGL3-Basic/c-MYCNHEIII1promoteranditsmutantwereconstructedsuccessfully.AndTETAcouldinhibitthetranscriptionactivityofwildreportergeneinadose-dependentmanner,butforthemutatedgene,theinhibitingratewasdecreasedsignificantly.CONCLUSIONTTETAhasnegativeregulatoryeffectonc-MYCpromoterthroughn

7、ucleasehypersensitiveelementIII1.Keywords:Triethylenetetramine；c-MYCpromoter；G-quadruplex；transcriptionc-MYC是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種生理功能，如在G1/S的過(guò)渡、G2/M的轉(zhuǎn)化中都有作用，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化密切相關(guān)。它同時(shí)也是一種重要的原癌基因，位于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多種信號(hào)通路的關(guān)鍵交匯點(diǎn)，其蛋白的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)1,2，過(guò)量表達(dá)將直接或間接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究表明，c-MYC基因的轉(zhuǎn)錄85-90是由其啟動(dòng)子區(qū)的核酸超敏元件III1(nucleasehype

8、rsensitiveelementIII1,NHEIII1)所控制3。該元件即為G4-DNA結(jié)構(gòu)，一段富含鳥(niǎo)嘌呤的重復(fù)序列，該序列在一定條件下可以形成四鏈螺旋結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)在端粒、免疫球蛋白開(kāi)關(guān)區(qū)、基因啟動(dòng)子區(qū)等許多具有重要生物學(xué)功能的基因組中出現(xiàn)。目前已有多種小分子化合物顯示出對(duì)G4-DNA的穩(wěn)定作用，其中包括酰胺蒽醌類(lèi)化合物4-7、卟啉類(lèi)化合物等8-10。TETA是一種小分子化合物，在中性溶液中帶正電，類(lèi)似于K，我們前期通過(guò)圓二色譜以及熱力曲線證明，TETA在體外能夠增強(qiáng)人端粒DNA和c-MYCNHEIII1啟動(dòng)子序列形成的G4-DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性11,15本文將研究TETA在細(xì)胞內(nèi)對(duì)c-M

9、YC啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用，為T(mén)ETA的抗腫瘤作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.實(shí)驗(yàn)材料藥品和試劑c-MYC啟動(dòng)子質(zhì)粒Pbv-Del1由美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院Dr.BertVogelstein惠贈(zèng)，限制性內(nèi)切酶NheI和EcoRV購(gòu)自于TaKaRa公司，c-MYC啟動(dòng)子突變體引物由上海生工合成，突變?cè)噭┖匈?gòu)自于Stratagene公司，Bright-GloTM熒光試劑購(gòu)自Promega公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。HEK293細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、胎牛血清均購(gòu)自Hyclone公司，TETA購(gòu)自于Aldrich公司。2.方法2.1c-

10、MYC啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建將Pbv-Del1和PGL3-Basic兩種質(zhì)粒分別都用NheI和EcoRV進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳后，切膠回收c-MYC啟動(dòng)子2500bp的片斷和酶切后的PGL3-Basic質(zhì)粒。將此兩種酶切后回收產(chǎn)物按1:5比例在4下連接過(guò)夜，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5中。37過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌，并提取其質(zhì)粒后，用NheI和EcoRV進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒命名為PGL3-Basic/c-MYCpromoter。2.2c-MYC啟動(dòng)子突變體的構(gòu)建根據(jù)GeneBank登錄號(hào)：HYPERLINK/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&val

11、=22539123AC103819gi:22539123中的c-MYC啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)突變引物為，上游:ATGGGGAGGGTGAGGAGGGTGGGGAAGGTGGGG，下游:TTCCCCACCCTCCTCACCCTCCCCATAAGCGCC。根據(jù)Stratagene的突變?cè)噭┖姓f(shuō)明，首先以PGL3-Basci/c-MYCpromoter質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將DpnI酶加入到擴(kuò)增產(chǎn)物中，37作用1h后直接轉(zhuǎn)化到XL-bule菌，涂板。37過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌，提取質(zhì)粒后，用NheI和EcoRV進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒送TaKaRa公司測(cè)序，將突變成功的質(zhì)粒命名為PGL3

12、-Basci/c-MYCpromotermutant。2.3TETA對(duì)c-MYC啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用腫瘤細(xì)胞HEK293以1105/mL接種于6孔板中，待其融合度達(dá)到6580時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。提取的PGL3-Basic/c-MYCpromoter和PGL3-Basic/c-MYCpromotermutant兩種質(zhì)粒分別調(diào)其濃度為0.5g/L。將此兩種質(zhì)粒分別與脂質(zhì)體Lipofectamine2000混合均勻后，轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞中，置37，5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，分別以1106/mL濃度接種于96孔板，100L/孔。待細(xì)胞貼壁后，約2h4h，加入稀釋的TETA，使其終濃度分別為：0mol/L,

13、0.1mol/L,1.0mol/L,10mol/L,100mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6-8h后，VeritasTURNERBIOSYSTEMS上測(cè)定細(xì)胞的熒光值。將TETA濃度為0的組設(shè)定為control(A)，同批測(cè)定其它組的值(X)計(jì)算抑制率(I），抑制率(I)(AX）/A100，統(tǒng)計(jì)分析，采用origin7.5軟件進(jìn)行。3.結(jié)果3.1c-MYC啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建從Pbv-Del1質(zhì)粒上酶切下了c-MYC啟動(dòng)子的全片斷，并將其與PGL3-Basic質(zhì)粒連接。經(jīng)過(guò)對(duì)單克隆菌株質(zhì)粒的酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)從PGL3-Basic酶切下大小為2500bp的DNA片斷，連接成功的質(zhì)粒總大小為7300bp左右

14、，從而構(gòu)建了c-MYC啟片動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒PGL3-Basic/c-MYCpromoter(Fig.1,Fig.2）。圖1.c-Myc基因結(jié)構(gòu)Fig1.Structureofc-MYCgene圖2.pGL3-Basic/c-mycpromoter的酶切鑒定Fig.2IdentifictionofpGL3-Basic/c-MycpromoterdigestedwithNheIandEcoRVLane1:DNAmarkerDL15000;Lane2:PGL3-Basic/c-mycpromoterplasmid;Lane3,4:PGL3-Basic/c-mycpromoterplasmiddige

15、stbyNheIandEcoRVLane5:DNAmarkerDL20003.2c-MYC啟動(dòng)子突變體的構(gòu)建以pGL3-Basic/c-MYCpromoter為模板進(jìn)行PCR定點(diǎn)突變，擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL-bulez菌，挑取到含有PGL3-Basic/c-MYCpromoter突變位點(diǎn)的質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)c-MYC啟動(dòng)子NHEIII1的G12A突變成功(Fig.3)，由此獲得了pGL3-Basci/c-MYCpromotermutant。AB圖3.PGL3-Basci/c-mycpromotermutant質(zhì)粒的酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果Fig3.IdentificationofPGL3-Basci/c

16、-MycpromotermutantdigestedwithNheIandEcoRV(A)andthesequencereport(B)3.3TETA對(duì)c-MYC啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用為了考察TETA對(duì)c-MYCNHEIII1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，我們分別用不同濃度的TETA處理轉(zhuǎn)染了野生型和突變型報(bào)告基因質(zhì)粒的293細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，加入TETA的細(xì)胞孔的熒光值明顯下降；100MTETA作用8小時(shí)對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄抑制率可以達(dá)到66.2%，即使TETA濃度低至nM水平，也有明顯的抑制作用，0.1MTETA作用8小時(shí)對(duì)報(bào)告基因的抑制率為30.4%。但是，當(dāng)我們對(duì)c-MYCNHEIII1啟動(dòng)

17、子形成G四鏈體的關(guān)鍵核苷酸突變之后，TETA的這種抑制作用明顯下降，0.1和100MTETA作用8小時(shí)的抑制率分別為4.3%和25.7%，表明TETA對(duì)c-MYCNHEIII1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用與其穩(wěn)定該序列形成的G四鏈體結(jié)構(gòu)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。圖4.TETA對(duì)c-MYC啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用Fig4.Triethylenetetramineinhibitsthetranscriptingactivityofc-MYCpromoterNHEIII1.AftertheHEK293cellsweretransfectedwithplasmidofwildandmutantedc-M

18、YCNHEIII1promoterfor24h,thecellswerereplatedin96wellplate,afterthecellsattached,indicatedconcentrationsofTETAwereadded,andcontinuetoincubatefor6-8h,afterthat,theluciferaseactivitiesweredetectedwithitssubstrate(Brightglo).AllthedataareshownasmeanSDfromthreeindependentexperiments.*，p0.01Vscontrol.4討論c

19、-MYC與腫瘤有著密切的聯(lián)系，其蛋白的過(guò)表達(dá)將直接或間接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而c-MYC蛋白的表達(dá)水平最主要取決于其啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性高低。c-MYC的啟動(dòng)子屬于內(nèi)啟動(dòng)，包含在外顯子1中。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，c-MYC啟動(dòng)子中存在一段富含鳥(niǎo)嘌呤的重復(fù)序列，即G4-DNA結(jié)構(gòu)，其主要控制著該蛋白的轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，K+離子存在時(shí)，NHEIII1區(qū)堿基能夠形成4種平行結(jié)構(gòu)的G4-DNA12,13。當(dāng)能夠提高G4-DNA穩(wěn)定的陽(yáng)離子卟啉化合物TMPyP4作用與腫瘤細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞中c-MYCmRNA及蛋白水平均被下調(diào)；與之相對(duì)應(yīng)當(dāng)NHEIII1區(qū)的DNA序列發(fā)生GA突變時(shí)，G4-DNA的穩(wěn)定性降低，c-MYC啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)

20、錄活性能提高3倍14。Lemarteleur等發(fā)現(xiàn)三嗪衍生物9944，陽(yáng)離子卟啉化合物TMPyP4等多種已報(bào)道的通過(guò)G4-DNA能夠有效的穩(wěn)定c-MYC啟動(dòng)子NHEIII1區(qū)形成G4-DNA結(jié)構(gòu)，并有可能在腫瘤細(xì)胞中抑制c-MYC基因的轉(zhuǎn)錄，從而有可能阻止腫瘤細(xì)胞周期的進(jìn)程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，TETA能穩(wěn)定人端粒DNA以及c-MYCNHEIII1形成的G四鏈體DNA結(jié)構(gòu),并能抑制c-MYC基因的表達(dá)15。但是，我們還沒(méi)有獲得TETA抑制c-MYC表達(dá)的直接證據(jù)。本文中，我們通過(guò)基因定點(diǎn)突變技術(shù)，利用報(bào)告基因法對(duì)TETA調(diào)節(jié)c-MYCNHEIII1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TET

21、A可能通過(guò)c-MYC啟動(dòng)子的G4-DNA結(jié)構(gòu)對(duì)其啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性具有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了c-MYC全長(zhǎng)啟動(dòng)子的熒光報(bào)告質(zhì)粒PGL3-Basic/c-MYCNHEIII1promoter，其中包含其P1和P2啟動(dòng)子(圖1)。以此質(zhì)粒為模板，在其啟動(dòng)子的G4-DNA區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)一突變位點(diǎn)，將G12突變?yōu)锳，以破壞其結(jié)構(gòu)，從而改變啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。由于該突變位點(diǎn)位于富含GC區(qū)，因此采用QuikChangeXLSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene)試劑盒進(jìn)行突變，以保證突變成功。經(jīng)過(guò)生物公司測(cè)序，我們成功獲得突變體質(zhì)粒PGL3-Basci/c-MYCpromot

22、ermutant。將此兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入TETA作用后，野生型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降，且呈劑量依賴關(guān)系，但對(duì)突變體，這種抑制作用明顯下降，提示TETA抑制c-MYC基因表達(dá)可能與其在體內(nèi)能與c-MYC啟動(dòng)子的超敏元件相互作用，增加G4-DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。大量的研究結(jié)果證實(shí)，c-MYCNHEIII1形成的G4-DNA在不同條件下有不同的結(jié)構(gòu)(圖5)，主要包括籃式結(jié)構(gòu)和椅式結(jié)構(gòu)16。該突變位點(diǎn)為G12，處于形成G四鏈體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位置，當(dāng)其被突變以后，造成其G四鏈體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，使得G4-DNA松散，從而可能增加了啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作用的機(jī)會(huì)或增加了轉(zhuǎn)錄酶通過(guò)

23、該區(qū)域的機(jī)會(huì)，從而增加了其轉(zhuǎn)錄活性。我們也同時(shí)發(fā)現(xiàn)，高濃度的TETA對(duì)突變型的c-MYCNHEIII1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性仍有一定的抑制作用，這可能是由于其單一位突變不能完全破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)，仍能在一定程度上形成G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu)。圖5.突變位點(diǎn)在G4-DNA結(jié)構(gòu)的示意(AbstractfromPNAS,2002；99(18):1159311598)致謝本項(xiàng)目得到國(guó)家自然基金(30600813,30701020)、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃（NCET-07-0913）以及重慶市科委重點(diǎn)基礎(chǔ)項(xiàng)目（CSTC,2005BA5023）的資助。參考文獻(xiàn)RAMIROAR,JANKOVICM,CALLENE,et

24、al.Roleofgenomicinstabilityandp53inAID-inducedc-MYC-IghtranslocationsJ.Nature,2006,440(7080):105-109.HEMANNMT,BRICA,TERUYA-FELDSTEIN,etal.Evasionofthep53tumoursurveillancenetworkbytumor-derivedMYCmutantsJ.Nature,2005,11;436(7052):807-811.GRANDCL,HAPH,MUNOZRM,etal.ThecationicporphyrinTMPyP4down-regul

25、atesc-MYCandhumantelomerasereversetranscriptaseexpressionandinhibitstumorgrowthinvivoJ.MolCancerTher,2002,1:565-573.HAQI,LADBURYJE,CHOWDHRYBZ,etal.MolecularanchoringofduplexandtriplexDNAbydisubstitutedanthracene-9,10-diones:calorimetric,UVmelting,andcompetitiondialysisstudiesJ.JAmChemSoc,1996,18:106

26、93-10701.PERRYPJ,GOWANSM,RESZKAAP,etal.1,4-and2,6-Disubstitutedamidoanthracene-9,10-dionederivativesasinhibitorsofhumantelomeraseJ.JMedChem1998,41:3253-3260.PERRYPJ,RESZKAAP,WOODAA,etal.Humantelomeraseinhibitionbyregion-isomericdisubstitudedamidoanthracene-9,10-dionesJ.JMedChem,1998,41:4873-4884.NEI

27、LDLES,READMA,G-quadruplexesastherapeutictargetsJ.Biopolymers,2001,56:195-208.WheelhouseRT,SunD,HanH,HanFX,andHurleyLH.WHEELHOUSERT,SUND,HANH,etal.Cationicporphyriesastelomeraseinhibitors:theinteractionoftetra-(N-methyl-4-pyridyl)porphinewithquadruplexDNAJ.JAmChemSoc,1998,120:3261-3262.ALEXANDRINEM,SONIAF,CORINEV,etal.Porphyrin-aminoquinolineconjugatesastelomeraseinhibitorsJ.OrgBiomolChem,2003,1:921-927.IZBICKAE,WHEELHOUSE