XXXX細胞工程教學(xué)提綱及補充思考題

1、細胞工程程教學(xué)提提綱、課后后思考題及及補充思考考題課程學(xué)時：36學(xué)時，學(xué)學(xué)分：2學(xué)學(xué)分教學(xué)基本要要求：1了解與與細胞工程程相關(guān)的重重要理論，背背景知識和和細胞工程程學(xué)的基礎(chǔ)礎(chǔ)知識。2了解和和掌握細胞胞工程各種種技術(shù)的基基本原理、技術(shù)和方方法。3了解和和掌握細胞胞工程的工工程與實驗驗技術(shù)。4了解細細胞工程重重要技術(shù)的的應(yīng)用途徑徑和范圍，存存在的問題題及缺點。5了解細細胞工程關(guān)關(guān)鍵技術(shù)的的最新進展展和發(fā)展前前景。 課程考核方方式：閉卷筆試綜綜合考查。平時考查查與期末考考試相結(jié)合合。1、平時出出勤、作業(yè)業(yè)成績占110%；2、期中考考試成績占占30%；3、期末考考試成績占占60%。第一章緒緒論第1節(jié)

2、生物物工程1.1定定義1.2發(fā)發(fā)展歷程1.3現(xiàn)現(xiàn)代生物工工程的特點點與組成一、定義1、利用生生物將原材材料轉(zhuǎn)化為為產(chǎn)品的技技術(shù)。（KKail Erekky，19177）2、應(yīng)用自自然科學(xué)及及工程學(xué)的的原理，依依靠微生物物、動物、植物體作作為反應(yīng)器器將材料進進行加工以以提供產(chǎn)品品為社會服服務(wù)的技術(shù)術(shù)。（國際際合作及發(fā)發(fā)展組織，1982）3、以現(xiàn)代代生命科學(xué)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)結(jié)合先進的的工程技術(shù)術(shù)手段和其其他基礎(chǔ)學(xué)學(xué)科的科學(xué)學(xué)原理，按按照預(yù)先的的設(shè)計改造造生物體或或加工生物物原料，為為人類生產(chǎn)產(chǎn)所需產(chǎn)品品或達到某某種目的的的技術(shù)。（國國家科委，1986）生物技術(shù)（biotechnology）以生命科學(xué)為

3、基礎(chǔ)，利用生物體系和工程學(xué)原理生產(chǎn)生物制品和創(chuàng)造新物種的一門綜合技術(shù)，也就是利用生物有機體或其組成部分如細胞、組織、器官等發(fā)展新工藝或制造新產(chǎn)品的技術(shù)。二、發(fā)展歷歷程1、第一代代生物工程程（微生物物發(fā)酵，如如酒精等）2、近代生生物工程（醫(yī)醫(yī)用抗生素素、氨基酸酸、酶）3、現(xiàn)代生生物工程（高高新技術(shù)）三、現(xiàn)代生生物工程的的特點與組組成1、發(fā)酵工工程2、酶工程程3、蛋白質(zhì)質(zhì)工程4、基因工工程5、生物化化學(xué)工程6、細胞工工程第2節(jié) 細胞胞工程2.1定定義2.2發(fā)發(fā)展歷史2.3主主要研究內(nèi)內(nèi)容2.4重重要應(yīng)用一、定義細胞工工程（ceell eenginneeriing）應(yīng)用細胞生生物學(xué)和分分子生物學(xué)學(xué)的

4、方法，通通過類似于于工程學(xué)的的步驟，在在細胞整體體水平或細細胞器水平平上，按照照人們的意意愿來改變變細胞內(nèi)的的遺傳物質(zhì)質(zhì)以獲得新型型生物或特特種細胞產(chǎn)產(chǎn)品的一門門綜合性科科學(xué)技術(shù)。二、發(fā)展歷歷史（略）三、主要研研究內(nèi)容1、動植物物細胞與組組織培養(yǎng)2、細胞融融合3、染色體體工程4、胚胎工工程5、細胞遺遺傳工程四、重要應(yīng)應(yīng)用1、優(yōu)質(zhì)植植物快速培培育與繁殖殖2、動物胚胚胎工程快快速繁殖優(yōu)優(yōu)良、瀕危危品種3、利用動動植物細胞胞培養(yǎng)生產(chǎn)產(chǎn)活性產(chǎn)物物、藥品4、新型動動植物品種種的培育5、供醫(yī)學(xué)學(xué)器官修復(fù)復(fù)或移植的的組織工程程6、轉(zhuǎn)基因因動植物的的生物反應(yīng)應(yīng)器工程7、珍稀動動植物資源源的保存與與保護8、應(yīng)用

5、于于遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)等等領(lǐng)域的理理論研究9、應(yīng)用于于能源開發(fā)發(fā)、環(huán)保等等第一章小結(jié)結(jié)：定義一、生物工程發(fā)展歷程現(xiàn)代生物工程的特點與組成定義二、細胞工程發(fā)展歷史主要研究內(nèi)容重要應(yīng)用第二章細細胞工程基基礎(chǔ)第1節(jié) 細胞胞生物學(xué)基基礎(chǔ)1.1細細胞1.2染染色質(zhì)與染染色體1.3細細胞周期1.4細細胞分裂1.5細細胞分化與與細胞全能能性細胞分化個體細細胞發(fā)育過過程中，后后代細胞在在形態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)和生理功能能上發(fā)生差異異的過程。持家基因細胞中中維持細胞胞生存所必必需的基因因。組織專一基基因在各種種細胞中專專一選擇表表達的基因因。發(fā)育潛能細胞分化能能力的強弱弱。高度分分化的植物物營養(yǎng)組織織具有全能能性，高等等動物細

6、胞胞發(fā)育潛能能變窄。細胞全能性性已經(jīng)分分化和尚未未分化的細細胞所具有有的表達生物體體基因組任任何一種基基因、分化出任何何一種類型型細胞、各種種組織直至發(fā)育成成完整個體體的潛能。多能性隨著胚胎胎的發(fā)育，細細胞具有分分化出各種種組織的潛潛能而失去發(fā)育育成完整個個體的潛能能，這種發(fā)發(fā)育潛能叫叫多能性。去分化在某些條條件下，分分化細胞不不穩(wěn)定，基基因活動模模式發(fā)生可可逆變化又又回到未分分化狀態(tài)的的過程，如如培養(yǎng)條件件下的植物物愈傷組織織。 一一個已分化化細胞，要要表現(xiàn)其全全能性，形形成完整個個體，首先先要經(jīng)歷脫分分化，然后后再經(jīng)歷再分化化過程。第2節(jié) 分子子生物學(xué)基基礎(chǔ)2.1基基因與基因因復(fù)制2.2轉(zhuǎn)

7、轉(zhuǎn)基因技術(shù)術(shù)第3節(jié) 普通通生物學(xué)基基礎(chǔ)3.1組組織、器官官3.2生生殖、發(fā)育育一、組織、器官分生組織織 植植物組織 成熟組組織 上皮組組織 動動物組織 結(jié)結(jié)締組織 肌肉組組織 神經(jīng)組組織分生組織按按在植物體體中的位置置分：（1）頂端端分生組織織（2）側(cè)生生分生組織織（3）居間間分生組織織二、生殖、發(fā)育1、高等植植物的生殖殖和發(fā)育：花粉粒的形形成和發(fā)育育胚囊的形成成和發(fā)育開花與傳傳粉花粉萌發(fā)發(fā)和雙受精精作用受精胚珠珠發(fā)育形成成種子（合合子發(fā)育成成胚，受精精極核發(fā)育育成胚乳）果實形成種子萌發(fā)與幼苗形成2、高等動動物的生殖殖和發(fā)育： 受受精卵卵裂球囊胚原腸胚形成中胚胚層胚層分化化幼體頂體反應(yīng)獲能的的

8、精子釋放放頂體酶，溶溶解卵細胞胞周圍的放放射冠和透透明帶的變變化。精子必必須穿過幾幾層物理性性的屏障才才能穿入卵卵內(nèi)。在哺哺乳動物中中，精子入入卵所面臨臨的第一層層屏障是一一層包埋在在黏性透明明質(zhì)酸中的的卵丘細胞胞。精子頭頭部表面的的透明質(zhì)酶酶活性有助助于精子穿穿過卵丘細細胞層。第第二層屏障障是在卵丘丘細胞層下下面包裹卵卵細胞的一一層透明帶帶。卵透明帶是是被覆于卵卵母細胞及及著床前受受精卵外的的一層基質(zhì)質(zhì)，由糖蛋蛋白組成。在受精過過程中及早早期孕卵發(fā)發(fā)育方面具具有重要的的作用。當一個獲能能的精子進進入一個次次級卵母細細胞的透明明帶時，受受精過程即即開始。到到卵原核和和精原核的的染色體融融合在一

9、起起時，則標標志著受精精過程的完完成。受精的過程程包括精子子與卵子接接觸、精子子穿過卵細細胞的放射射冠和透明明帶、次級級卵母細胞胞進行第二二次分裂及及兩性原核核的融合。 精子頭部通通過頂體反反應(yīng)釋放頂頂體小泡中中的內(nèi)容物物，有助于于精子穿過過透明帶。透明帶中中含有一種種特異性結(jié)結(jié)合的糖蛋蛋白受體ZZP3，而而精子頭部部含有一種種能夠和ZZP3結(jié)合合的黏附分分子1，4半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶酶。當精子子與ZP33結(jié)合后，頂頂體通過胞胞吐作用將將內(nèi)容物釋釋放。釋放放的內(nèi)容物物主要是一一些酶類，包包括N乙酰葡葡萄糖胺糖糖苷酶和頂頂體素，前前者用于降降解透明帶帶糖蛋白上上的寡糖鏈鏈，后者為為一種蛋白白酶。它們

10、們可以使精精子表面與與卵細胞質(zhì)質(zhì)膜結(jié)合的的蛋白暴露露出來。受受精素就是是其中的一一種，有兩兩個跨膜亞亞基組成，能能與卵細胞胞質(zhì)膜上的的整聯(lián)蛋白白受體結(jié)合合，從而引引發(fā)精子與與卵子融合合。胚層的分化化（1）外胚胚層 分分化成皮膚膚表皮和其其衍生物（比比如口腔、鼻腔、肛肛門的粘膜膜、毛發(fā)、指甲、爪爪等）、神神經(jīng)系統(tǒng)、感覺器官官、腎上腺腺髓質(zhì)等。（2）內(nèi)胚胚層 分分化形成消消化道、呼呼吸道及排排泄管道的的上皮、肝肝、胰、扁扁桃體、甲甲狀腺、胸胸腺等。（3）中胚胚層 分分化形成肌肌肉、骨骼骼、血管和和血液、淋淋巴系統(tǒng)、腎臟、生生殖腺、腸腸系膜等。 第二章小結(jié)結(jié)：一、細胞生生物學(xué)基礎(chǔ)礎(chǔ)（細胞、染色質(zhì)與與

11、染色體、細胞周期期、細胞分分裂、細胞胞分化與細細胞全能性性）二、分子生生物學(xué)基礎(chǔ)礎(chǔ)（基因與與基因復(fù)制制、轉(zhuǎn)基因因技術(shù)）三、普通生生物學(xué)基礎(chǔ)礎(chǔ)（組織與與器官、生生殖與發(fā)育育）第三章植植物組織與與細胞培養(yǎng)養(yǎng)第1節(jié) 植物物組織培養(yǎng)養(yǎng)與細胞培培養(yǎng)的區(qū)別別組織培養(yǎng)從生物物體內(nèi)取出出組織或細細胞，模擬擬機體內(nèi)生生理條件，在在體外進行行培養(yǎng)，使使之生存或或生長成組組織的技術(shù)術(shù)。植物組組織培養(yǎng)主主要是植物物無性脫毒毒快速繁殖殖技術(shù)。細胞培養(yǎng)使動植植物細胞在在體外條件件下存活或或生長的技技術(shù)，不再再形成組織織。植物細細胞培養(yǎng)主主要是以生生產(chǎn)植物次次生代謝產(chǎn)產(chǎn)物為目的的的大規(guī)模模細胞培養(yǎng)養(yǎng)技術(shù)。 第2節(jié) 發(fā)展歷歷

12、史（自學(xué)學(xué)）第3節(jié)節(jié)植物組組織與器官官培養(yǎng)3.1定定義與基本本原理3.2幾幾個重要概概念3.3細細胞分化和和形態(tài)建成成3.4植植物組培的的基本步驟驟3.5愈愈傷組織培培養(yǎng)3.6植植物器官培培養(yǎng)3.7植植物組培的的應(yīng)用3.8人人工種子3.9植植物組織與與器官的生生物反應(yīng)器器培養(yǎng)一、定義與與基本原理理 植植物組織培培養(yǎng)在無菌條件下下，將離體體的植物器官官、組織、細胞、胚胚胎、原生生質(zhì)體等培培養(yǎng)在人工工配置的培培養(yǎng)基上，給給予適當?shù)牡呐囵B(yǎng)條件件，誘發(fā)產(chǎn)生生愈傷組織織、潛伏芽芽，或者長長成新的完完整植株的的技術(shù)。理論依據(jù)：細胞全能能性科學(xué)研究表表明，處于于離體狀態(tài)的的植物活細細胞，在一一定的營養(yǎng)養(yǎng)物質(zhì)

13、、激素和其他外界界條件的作作用下，就就可能表現(xiàn)現(xiàn)出全能性性，發(fā)育成成完整的植植株。人工工條件下實實現(xiàn)的這一一過程，就就是植物組組織培養(yǎng)。 植物組組織培養(yǎng)技技術(shù)是一種種無性快速速繁殖技術(shù)術(shù)，與常規(guī)規(guī)營養(yǎng)繁殖殖方法相比比，只需少少量材料就就能獲得大大量植株，可可以節(jié)約大大量種子、肥料、耕耕地，而且且是在人工工無菌操作作和控制生生長環(huán)境條條件下進行行，可進行行工業(yè)化生生產(chǎn)，對保保質(zhì)、保純純和反季節(jié)節(jié)生產(chǎn)有著著特殊作用用，被認為為是農(nóng)業(yè)高高新技術(shù)中中最重要、最活躍的的領(lǐng)域之一一，不僅是是農(nóng)業(yè)繼續(xù)續(xù)發(fā)展的基基礎(chǔ)，而且且是生物技技術(shù)中應(yīng)用用最廣、最最具現(xiàn)實意意義的領(lǐng)域域，被譽為為農(nóng)業(yè)發(fā)展展史上的第第四次綠

14、色色革命，對對解決經(jīng)濟濟和社會發(fā)發(fā)展所面臨臨的人口增增長、農(nóng)業(yè)業(yè)資源貧乏乏、環(huán)境污污染等重大大問題具有有十分重要要的戰(zhàn)略意意義。二、幾個重重要概念1、全能細細胞 能能夠表達生物體體基因組的的任何一種種基因，并能能分化出該生生物體內(nèi)任任一類型細細胞，進而而發(fā)育為一一個完全相相同生物體體的細胞。如合子（受精精卵）、早早期胚胎細細胞、頂端分生生組織細胞胞、成熟器官官遺留的胚胚性細胞等等。2、愈傷組組織 由由外植體組組織增生的的細胞產(chǎn)生生的一團不不定型的疏散排列列的薄壁細胞胞，比較容容易分離，通通常在外植植體傷口處產(chǎn)生生。這些細細胞的大小小、形狀、液泡化程程度、胞質(zhì)質(zhì)含量、細細胞壁特性性等通常有有較大

15、差異異。繼代培養(yǎng)養(yǎng)器官發(fā)生生再生植株株單細胞細胞培養(yǎng)養(yǎng)原生質(zhì)體體3、外植體體 植植物組培中中用來進行行離體無菌菌培養(yǎng)的離體材料料，器官、組組織、細胞胞、原生質(zhì)質(zhì)體都可以以。4、繼代培培養(yǎng) 愈愈傷組織在在培養(yǎng)基上上生長一段段時間后，營營養(yǎng)物枯竭竭，水分散散失，并已已經(jīng)積累了了一些代謝謝產(chǎn)物，此此時將這些些組織轉(zhuǎn)移移到新的培培養(yǎng)基上的的培養(yǎng)方式式，也稱傳傳代培養(yǎng)。三、細胞分分化和形態(tài)態(tài)建成體細胞胚指離體體培養(yǎng)條件件下沒有經(jīng)經(jīng)過受精過過程而形成成的胚胎類類似物，又又叫胚狀體體。去分化在某些條條件下，分分化細胞不不穩(wěn)定，基基因活動模模式發(fā)生可可逆變化又又回到未分分化狀態(tài)的的過程，如如培養(yǎng)條件件下的植物

16、物愈傷組織織。 一一個已分化化細胞，要要表現(xiàn)其全全能性，形形成完整植植株，首先先要經(jīng)歷脫分分化，然后后再經(jīng)歷再分化化過程。組培研研究結(jié)果表表明：分化化細胞的脫脫分化關(guān)鍵鍵需要兩個個條件：創(chuàng)傷和外源激素素，如生長長素、細胞胞分裂素或或赤霉素。植物組織培培養(yǎng)常用儀儀器設(shè)備：電子天天平、高壓壓蒸汽滅菌菌鍋、電熱熱干燥箱、超凈臺、冰箱、人人工氣候培培養(yǎng)箱、人人工氣候室室、三重純純水蒸餾器器、超純水水儀、電爐爐、試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、劑量器皿皿（量筒、容量瓶、移液管、移液槍等等）、燒杯杯、試劑瓶瓶、鑷子、解剖剪、解剖刀等等。植物組織培培養(yǎng)培養(yǎng)基基成分：培養(yǎng)基基應(yīng)含有植植物生長所所必需的各各種營養(yǎng)成成分，

17、以滿滿足植物正正常生長發(fā)發(fā)育的需要要。在完整整的全培養(yǎng)養(yǎng)基中應(yīng)包包括無機鹽鹽類、碳源、有機氮源源、植物生長長激素、維生素等物物質(zhì)。這些些物質(zhì)主要要有四個方方面的生理理作用：一一、作為結(jié)結(jié)構(gòu)物質(zhì)參參與機體的的建構(gòu)，如如蔗糖提供供碳源，肌肌醇在糖類類的相互轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化中起作作用，是構(gòu)構(gòu)成細胞壁壁的材料，也也參與細胞胞膜的構(gòu)建建。氨基酸酸是很好的的有機氮源源，可直接接被細胞吸吸收利用；二、構(gòu)成成特殊的生生理活性物物質(zhì)，在代代謝中起調(diào)調(diào)節(jié)作用，如如維生素類類物質(zhì)在植植物細胞中中主要以各各種輔酶的的形式參與與多種代謝謝活動，對對生長有促促進作用；三、維持持離子濃度度的平衡、電荷荷平衡、膠膠體平衡等等，如瓊脂脂

18、作為培養(yǎng)養(yǎng)組織的支支撐物起支支持作用；四、影響響器官的形形態(tài)發(fā)生和和建成，如如鉀、鐵、鎂、鈣等等 。植物組織培培養(yǎng)培養(yǎng)基基成分：（1）無機機鹽類大量元元素：N、S、P、K、Ca、Mg等微量元元素：Fee、Mn、Cu、Zn、Cl、B、Mo等通常無無機鹽濃度度為25mmmol/L左右，硝硝酸鹽濃度度一般為22540mmmol/LL，其中必必須添加鉀鉀元素，濃濃度在200mmoll/L或更更高，磷、鎂、鈣、硫元素濃濃度在13mmool/L。（2）碳源源最常采采用的碳源源為蔗糖，用量量在2%3%范圍內(nèi)內(nèi)。 （3）有機機氮源通常采采用的有機機氮源有蛋蛋白質(zhì)水解解產(chǎn)物、谷氨酰胺胺或氨基酸酸混合物。（4）植

19、物物生長激素素（用量常常在0.111mg/L）生長素素能促進細細胞分裂，促促使根的形形成，最常常用的有吲吲哚乙酸（IAA），2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）。吲哚乙酸是一種吲哚類具有生長素活性的廣譜性植物生長調(diào)節(jié)劑，目前主要用于植物組織培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷組織形成、促進生根。吲哚丁酸主要應(yīng)用于促進插條生根。萘乙酸促進植物生長、插條生根。2，4-D用途隨濃度而異，效果不一，在較低濃度下是植物組織培養(yǎng)的成分之一，促進愈傷組織的形成。細胞分裂素素通常是腺腺嘌呤衍生生物：6-芐基嘌呤呤（BA）、玉玉米素（ZZT）、激激動素（KKT）。6-BBA是誘導(dǎo)導(dǎo)芽的分化化，促進

20、側(cè)側(cè)芽萌發(fā)生生長，促進進細胞分裂裂與擴大抑抑制根的分分化。 （5）維生生素維生素素作為植物物細胞分裂裂、分化的的生理活性性物質(zhì)，在在植物細胞胞內(nèi)主要以以各種輔酶酶的形式參參與多種代代謝活動。常用的維維生素有：鹽酸硫胺胺素（維生生素B1)、煙酸（維生生素B3）、鹽鹽酸吡哆素素（維生素素B6）、抗抗壞血酸（維生素C）。一般采用的維生素濃度為0.11mg/L。 （6）肌醇醇又叫環(huán)環(huán)已六醇，可可促進愈傷傷組織的生生長和胚狀狀體及芽的的形成。常常用濃度為為50100mmg/L。（7）復(fù)合合物通常為為細胞生長長調(diào)節(jié)劑，包包括酵母抽抽提液、麥麥芽抽提液液、椰子汁汁和水果汁汁等。一些些抽提液對對細胞有毒毒性，

21、現(xiàn)在在已被已知知成分的營營養(yǎng)物質(zhì)代代替。目前前仍廣泛使使用的是椰椰子汁。組培常常用基本培培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基基，另外還還有B5、N6、NT、AA等培養(yǎng)養(yǎng)基。調(diào)ppH5.555.8。培養(yǎng)基及器器械的消毒毒：玻璃培培養(yǎng)儀器及及無菌操作作所用的水水、濾紙、紗布、各各種器械如如解剖刀、解剖剪、解剖針、鑷子等通通常與培養(yǎng)養(yǎng)基一起事事先用高壓壓滅菌鍋滅滅菌備用。四、植物組組培的基本本步驟1、培養(yǎng)材材料的采集集2、材料消消毒3、制備外外植體4、接種和和培養(yǎng)5、誘導(dǎo)生生根6、煉苗、移栽1、培養(yǎng)材材料的采集集理論上上全能植物物細胞有3類：（1）受精精卵（2）根尖尖、莖尖、葉、花等等分生組織織細胞（3）雌雄雄配子及

22、單單倍體細胞胞，如花藥藥、花粉粒粒等在快速速繁殖應(yīng)用用中，通常常用莖尖，一般般切0.55cm左右右；如果想想要脫毒苗苗，通常只只切莖尖0.11mm以內(nèi)內(nèi)的部分，因因為莖尖分分生組織沒沒有分化出出維管組織織，病毒難難以感染到到這個部位位，但一般般說來，外外植體越小小，培養(yǎng)難難度越大。2、培養(yǎng)材材料的消毒毒材料先先用自來水水沖洗干凈凈用蒸餾水沖洗洗（以下在在超凈臺上進進行無菌操操作）無菌水沖洗洗無菌濾紙紙吸干水已消毒解解剖刀切成小塊70%酒精精浸泡30060s移入漂白粉粉飽和液或或0.011%升汞（HggCl2）消消毒10mmin左右右無菌水沖洗洗無菌濾紙紙吸干水常用消毒劑劑效果的比比較植物組織培

23、培養(yǎng)中常遇遇到的問題題污染染污染連連同褐變、玻璃化被被稱為植物物組培三大大難題。1、污染的的原因（1）外植植體材料表表面消毒不不徹底或內(nèi)內(nèi)生菌隨材材料帶入；（2）培養(yǎng)養(yǎng)基和接種種工具消毒毒不徹底；（3）接種種室和超凈凈臺不符合合要求；（4）操作作人員不遵遵守操作規(guī)規(guī)程；（5）培養(yǎng)養(yǎng)過程中環(huán)環(huán)境空氣不不潔凈污染染等。2、污染的的控制（1）將材材料沖洗足足夠干凈，嚴嚴格消毒滅滅菌。可采采用多次滅滅菌法。（2）在培培養(yǎng)基中加加入一定量量的抗生素素，如青霉霉素、鏈霉霉素、新霉霉素、卡那那霉素等，但但抗生素對對培養(yǎng)物的的生長和分分化會產(chǎn)生生一定的抑抑制，應(yīng)避避免長期使使用。 （3）培養(yǎng)養(yǎng)基滅菌時時，要檢

24、查查高壓滅菌菌的溫度、壓力、時時間及操作作是否正常常等。（4）接種種室定期用用紫外燈照照射或酒精精噴霧或甲甲醛薰蒸等等。超凈臺臺接種前用用酒精擦拭拭后再開機機滅菌。（5）接種種前，接種種人員要嚴嚴格消毒，認認真洗手，酒酒精擦手；在接種時時規(guī)范操作作，常用酒酒精擦手。接種工具具常在酒精精燈火焰上上灼燒。接接種前后培培養(yǎng)器皿開開口需轉(zhuǎn)動動烘烤。3、制備外外植體用消毒毒工具將表表面消毒的的材料作些些處理（芽芽除鱗片、嫩枝除外外皮、種子子去種皮、去胚乳等等，葉片直直接切成00.20.5ccm小片，想想要脫毒苗苗切至莖尖尖0.1mmm內(nèi)部分分）。4、接種和和培養(yǎng)接種封口置培養(yǎng)室室培養(yǎng)（22528，濕濕度

25、7080%，光光照強度33000 40000lx，日日光燈光照照1016h）繼代培養(yǎng)養(yǎng)分化培養(yǎng)養(yǎng)（一般在在基本培養(yǎng)養(yǎng)基中加入入一定配比比生長素與與細胞分裂裂素，超凈凈臺上無菌菌操作）5、誘導(dǎo)生生根將生成成不定芽的的材料轉(zhuǎn)到到生根培養(yǎng)養(yǎng)基上誘導(dǎo)導(dǎo)生根（一一般在基本本培養(yǎng)基中中加入生長長素，超凈凈臺上進行行無菌操作作）。6、煉苗、移栽試管苗苗從一個無無菌、光溫溫恒定和基基本異養(yǎng)的的環(huán)境轉(zhuǎn)移移到有菌、光溫變動動和完全自自養(yǎng)的環(huán)境境，需要多多方面的調(diào)調(diào)整，適應(yīng)應(yīng)不好會影影響成活。幼苗根根長到一定定長度瓶口打開開，自然光光照3天移出幼苗苗自來水沖洗洗根上培養(yǎng)養(yǎng)基移入基質(zhì)質(zhì)（珍珠巖巖、蛭石等等）清水噴濕煉

26、煉苗1d移入大田田栽培七、植物組組培的應(yīng)用用1、無性系系快速繁殖殖（用材少少，不受季季節(jié)限制）2、獲得脫脫毒苗（莖莖尖生長點點、花器培培養(yǎng)）3、選育新新品種（1）突變變育種（2）原生生質(zhì)體融合合和細胞雜雜交（3）花藥藥、花粉培培養(yǎng)與單倍倍體植株4、有助于于遺傳、生生理生化、病理研究究5、保存種種質(zhì)資源6、產(chǎn)業(yè)化化生產(chǎn)八、人工種種子 將將植物組培培產(chǎn)生的胚胚狀體包裹裹上用有機機化合物和和營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)制作的人工工種皮，就就成了人工工種子。人工種子的的優(yōu)點：1、快速繁繁殖，便于于運輸、貯貯藏；2、可以加加入有益成成分配制，更更利于種子子生長；3、可以固固定雜種優(yōu)優(yōu)勢，加速速良種繁育育；4、可作為為植物

27、基因因工程和遺遺傳工程的的橋梁；5、可以保保存珍貴品品種。體細胞胚包包埋制作人人工種子的的流程： 選選取目標植植物從合適的的外植體誘誘導(dǎo)愈傷組組織形成愈傷組織織轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)養(yǎng)基愈傷組織織增生愈傷組織織轉(zhuǎn)到無激激素培養(yǎng)基基形成體細胞胞胚包裹人工工種皮溫室播種種獲得目標標植物影響體細胞胞胚發(fā)生：N源（Glyy、NH4CCl）C源（蔗糖糖、果糖）基本培養(yǎng)基基：MS或改良良MS培養(yǎng)基基人工胚乳及及人工種皮皮的理想包包埋材料應(yīng)應(yīng)具備下列列特性：1、無毒、無害，有有生物相容容性，能支支持胚狀體體；2、有一定定透氣性、保水性，既既不造成人人工種子在在貯藏保存存過程中喪喪失生活力力，又能保保證其將來來正常萌發(fā)

28、發(fā)生長；3、有一定定強度，能能維持種子子的完整性性，便于人人工種子貯貯藏、運輸輸和播種4、可容納納和傳遞胚胚胎發(fā)育所所需的營養(yǎng)養(yǎng)物質(zhì)、生生長和發(fā)育育的控制劑劑、以及為為延長貯藏藏壽命而添添加的防腐腐劑、殺菌菌劑等人工種子的的包埋劑：海藻酸鹽鹽、瓊脂、白明膠、角叉菜膠膠、槐豆膠膠等。海藻酸鹽是是一種由古古洛糖醛酸酸和甘露糖糖醛酸組成成的多糖，在在Ca2+等離子存存在時，糖糖中的羧基基和陽離子子之間形成成離子鍵，從從而形成膠膠體顆粒。具有成膠膠容易、操操作條件溫溫和、使用用方便、毒毒性極低、成本低廉廉、可防機機械碰傷等等優(yōu)點，不足是保水水性較差，表表面易結(jié)團團、營養(yǎng)成成分易流失失。如用磷磷酸、檸檬

29、檬酸、EDDTA等離子復(fù)復(fù)合劑處理理，膠體顆顆粒又會釋釋放出細胞胞。海藻酸鹽包包埋制作人人工種子具具體操作：先配置置一定濃度度的海藻酸酸鈉溶液，比比如2%，高溫溫高壓滅菌菌，將植物物細胞懸浮浮液與海藻藻酸鈉溶液液混合倒入入注射器中中，然后慢慢慢滴入含含有CaCCl2的培培養(yǎng)基中，不不斷攪拌就就會形成球球形顆粒，過過濾收集顆顆粒，用含含有的Caa2+培養(yǎng)養(yǎng)基清洗，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入搖瓶中中進行培養(yǎng)養(yǎng)。九、植物組組織與器官官的生物反反應(yīng)器培養(yǎng)養(yǎng) 氣氣升式生物物反應(yīng)器、自旋過濾濾式反應(yīng)器器十、植物組組織與器官官培養(yǎng)存在在的問題1、研究：理論研究究不夠深入入，且難培培養(yǎng)植物研研究不夠2、技術(shù)：技術(shù)不夠夠成熟，效效

30、率偏低，生生物反應(yīng)器器技術(shù)不成成熟，組培培工業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化尚尚未實現(xiàn)3、可應(yīng)用用性范圍：很多有價價值的植物物未培育成成功，應(yīng)用用范圍較小小第4節(jié) 植物物細胞培養(yǎng)養(yǎng)4.1定定義4.2植植物細胞培培養(yǎng)的方法法4.3植植物細胞培培養(yǎng)的培養(yǎng)養(yǎng)基4.4植植物單細胞胞培養(yǎng)4.5植植物細胞培培養(yǎng)的應(yīng)用用4.6植植物細胞的的生物反應(yīng)應(yīng)器大規(guī)模模培養(yǎng)4.7植植物細胞兩兩相培養(yǎng)技技術(shù)4.8植植物細胞的的生物反應(yīng)應(yīng)器固定化化培養(yǎng)4.9植植物細胞培培養(yǎng)存在問問題與發(fā)展展趨勢一、定義 在在離體條件下下，將愈傷傷組織或其其他易分散散的組織置置于液體培培養(yǎng)基中進進行振蕩培培養(yǎng)，得到到分散成游游離的懸浮浮細胞，通通過繼代培培養(yǎng)

31、使細胞胞增殖，從從而獲得大大量細胞群群體的一種種技術(shù)。植物中含有有數(shù)量極為為可觀的次次生代謝物物質(zhì)，是各各種色素、藥物、香精、酶等天然產(chǎn)產(chǎn)物的主要要來源。植物細胞培培養(yǎng)具有以以下優(yōu)點：1、提高產(chǎn)產(chǎn)率2、縮短周周期3、提高產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量4、易于管管理，減輕輕勞動強度度因此主主要用于生生產(chǎn)色素、藥物、食品、酶、精細化工工產(chǎn)品等次次生代謝物物。紫杉醇是一一種二萜類類化合物，是是一種新發(fā)發(fā)現(xiàn)的細胞胞有絲分裂裂抑制劑，其其作用機理理在于阻止止微管正常常生理聚集集，抑制癌癌細胞的有有絲分裂和和紡錘體的的形成，從從而使癌細細胞的復(fù)制制受到阻斷斷而凋亡。廣泛用于于治療卵巢巢癌、乳腺腺癌、非小小細胞肺癌癌等十幾種種

32、癌癥，是是20世紀后后期最受人人們重視的的一種抗癌癌新藥，被被公認為是是最有開發(fā)發(fā)前途、最最有效的抗抗癌藥物，獲獲湯姆森科科技桂冠獎獎。二、方法 瓊脂培養(yǎng)養(yǎng) 固固體培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 固定化培培養(yǎng)（吸附附、包埋等等） 搖瓶懸懸浮培養(yǎng)（實實驗室） 液液體培養(yǎng) 分批培養(yǎng)養(yǎng) 反應(yīng)器器大 半連續(xù)培培養(yǎng) 規(guī)模培培養(yǎng) 恒化化培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)養(yǎng) 恒濁濁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)養(yǎng)：將細胞胞固定在載載體上，使使活細胞固固定在一定定的空間范范圍內(nèi)進行行生命活動動的技術(shù)。這種方法法保持了細胞胞的生命活動能能力，可以以反復(fù)或連連續(xù)進行培養(yǎng)，有利利于提高生生產(chǎn)能力和和產(chǎn)物的分分離純化，并并且省去了含酶酶細胞的處處理過程，所所需的酶系系完

33、整，方法簡單單，成本低。固定化化技術(shù)有吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法等，通常采采用包埋法法，將細胞胞包埋在海海藻酸鹽或或卡拉膠中中。反應(yīng)器大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)：1、分批培培養(yǎng)：一次次性添加培培養(yǎng)液培養(yǎng)養(yǎng)，期間不不更換培養(yǎng)養(yǎng)液。2、半連續(xù)續(xù)培養(yǎng)：在在培養(yǎng)過程程中每隔一一定時間更更換一部分分培養(yǎng)液或或添加某種種營養(yǎng)成分分。又稱流流加培養(yǎng)。3、連續(xù)培培養(yǎng)：連續(xù)續(xù)地以一定定速度添加加培養(yǎng)液或或營養(yǎng)鹽，同同時排出舊舊培養(yǎng)液，總總培養(yǎng)液體體積不變。連續(xù)培養(yǎng)：1、恒化培培養(yǎng)2、恒濁培培養(yǎng)相關(guān)項目恒化培養(yǎng)恒濁培養(yǎng)裝置恒化器恒濁器控制對象培養(yǎng)液流速速培養(yǎng)液密度度生長限制因因子有無培養(yǎng)液流速速恒定不恒定生長速度低于最高最

34、高產(chǎn)物不同生長速速度細胞大量細胞或或與細胞生生長平衡的的代謝產(chǎn)物物應(yīng)用范圍實驗室為主主生產(chǎn)為主三、培養(yǎng)基基 常常用MS培養(yǎng)基基，另外還還有B5、N6、NT、AA、KM8pp等培養(yǎng)基基四、單細胞胞培養(yǎng)1、制備方方法（1）機械械法（機械械磨碎、切切割）（2）酶解解法（目前前最有效的的獲得單細細胞方法）（3）愈傷傷組織誘導(dǎo)導(dǎo)法（高頻頻振動愈傷傷組織）2、培養(yǎng)方方法（1）平板板法（似微微生物平板板培養(yǎng)）（2）看護護培養(yǎng)與飼飼養(yǎng)層培養(yǎng)養(yǎng)法 看看護培養(yǎng)：將單個細細胞接種到到濾紙上再再置于愈傷傷組織之上上進行培養(yǎng)養(yǎng)。 飼飼養(yǎng)層培養(yǎng)養(yǎng)：用處理理過（如XX射線）的的無活性的的或分裂很很慢、不具具分裂能力力的細胞

35、來來飼養(yǎng)細胞胞。（3）液體體淺層靜置置培養(yǎng)法：將一定密密度的懸浮浮細胞在培培養(yǎng)皿中形形成淺薄層層，封口靜靜止培養(yǎng)。（4）懸浮浮法：將細細胞接種到到液體培養(yǎng)養(yǎng)基中，在在搖床或生生物反應(yīng)器器中培養(yǎng)。目前多采采用這種方方法進行植植物細胞大大規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)。成功的細胞胞懸浮培養(yǎng)養(yǎng)體系應(yīng)當當滿足3個基本條條件：1、懸浮細細胞分散性性良好，細細胞團較小小；2、細胞均均一性好，在在倒置顯微微鏡下觀察察，細胞形形狀和細胞胞團大小大大致相同；3、細胞生生長迅速，一一般23天甚至更更短時間可可增加一倍倍。影響懸浮細細胞生長的的因素：1、 起始始愈傷組織織的質(zhì)量2、 接種種細胞密度度3、培養(yǎng)條條件：方式式、溫度、4、

36、繼代代周期愈傷組織要要求：松散性性好，增殖殖快，再生生能力強。其外觀一一般是鮮艷艷的乳白或或淡黃色，呈呈細小顆粒粒狀，松散散易碎。如何獲得符符合要求的的愈傷組織織？1、選擇適適宜的外植植體：胚、胚軸、子子葉是最常常用的外植植體，特別別是幼胚。2、選擇適適宜的培養(yǎng)養(yǎng)基：生長長素濃度很很重要,配合一定定濃度的細細胞分裂素素等。3、愈傷組組織要進行行繼代選擇擇：選擇疏疏松性好、生長狀態(tài)態(tài)好的細胞胞不斷繼代代培養(yǎng)?；镜膽腋「∨囵B(yǎng)體系系均是將細細胞分散在在一定容積積的培養(yǎng)液液中進行，在在一個培養(yǎng)養(yǎng)周期不添添加培養(yǎng)基基。這種培培養(yǎng)體系基基本是處于于封閉狀態(tài)態(tài)。當一種種營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)耗盡時，細細胞即停止止生長

37、。在在這種懸浮浮培養(yǎng)體系系中，細胞胞擴增生長長成S形曲線。3、懸浮培培養(yǎng)同步化化方法（1）物理理法冷處理理、體積選選擇（2）化學(xué)學(xué)法饑餓加尿苷苷抑制細胞胞分裂加秋水水仙素抑制制細胞有絲絲分裂細胞同步化化：同一懸懸浮培養(yǎng)體體系的所有有細胞都同同時通過細細胞周期的的某一特定定時期。植植物細胞在在懸浮培養(yǎng)養(yǎng)中的游離離性較差，容容易團聚進進入不同程程度的分化化狀態(tài)，因因此要達到到完全同步步化相當困困難。低溫法：冷處理可可提高培養(yǎng)養(yǎng)體系中細細胞同步化化程度。分選法：通過細胞胞體積大小小分級，直直接將處于于相同周期期的細胞進進行分選，然然后將同一一狀態(tài)的細細胞繼代培培養(yǎng)于同一一培養(yǎng)體系系中。饑餓法：在一個

38、培培養(yǎng)體系中中，如果細細胞生長的的基本成分分喪失，則則導(dǎo)致細胞胞因饑餓而而分裂受阻阻，從而停停留在某一一分裂時期期。抑制劑法法：通過一一些DNAA合成抑制制劑處理細細胞，如尿尿苷等，使使細胞滯留留在DNAA合成前期期，當解除除抑制后，即即可獲得處處于同一細細胞周期G1期的的同步化細細胞。4、保存（1）繼代代培養(yǎng)（高高等植物、海藻等）（2）低溫溫（ 5 10）（3）冷凍凍（ -220 或液氮）植物細胞冷冷凍保存方方法：在冰浴浴條件下加加入預(yù)冷的的冰凍保護護劑，密封封，繼續(xù)冰冰浴15mmin，在在-40停停留2h后投入入-1966液氮罐罐中保存。植物細胞冷冷凍保護劑劑組成：7.5%二二甲基亞砜砜（

39、DMSSO）0.55molL山梨醇5%甘油5%蔗糖五、植物細細胞培養(yǎng)的的應(yīng)用1、生產(chǎn)藥藥用植物代代謝產(chǎn)物（紫紫杉醇、苷苷類等）2、生產(chǎn)天天然食品、食品添加加劑（可可可堿等）3、生產(chǎn)殺殺蟲劑、殺殺菌劑（魚魚藤酮、除除蟲菊脂） 4、生產(chǎn)飼飼料、精細細化工產(chǎn)品品（桑葉、橡膠等）六、植物細細胞的生物物反應(yīng)器大大規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)1、培養(yǎng)特特性（1）細胞胞本身特性性（生長慢慢、易結(jié)團團、易損傷傷、易污染染）（2）培養(yǎng)養(yǎng)液流變特特性（黏度度增高）（3）氣體體傳遞與影影響（O22與CO2需平平衡）（4）泡沫沫與器壁表表面黏附性性（氣泡增增多、黏度度大、易黏黏附，可用用硅油、脂脂肪酸酰胺胺等消除）（5）懸浮浮細胞生長

40、長與增殖（靜靜止期前繼繼代）2、培養(yǎng)過過程（1）細胞胞的馴化、篩選與細細胞株的建建立愈傷組組織誘導(dǎo)與與培養(yǎng)單細胞分分離細胞無性性系分離細胞株篩篩選（2）擴大大培養(yǎng)采用逐逐級增加體體積的容器器將優(yōu)良的的細胞株經(jīng)經(jīng)過多次擴擴大繁殖得得到大量細細胞，用作作生物反應(yīng)應(yīng)器培養(yǎng)的的種子細胞胞。（3）生物物反應(yīng)器培培養(yǎng)3、植物細細胞大規(guī)模模生物反應(yīng)應(yīng)器培養(yǎng) 攪攪拌式、鼓鼓泡式、氣氣升循環(huán)式式4、植物細細胞的生物物反應(yīng)器高高密度培養(yǎng)養(yǎng)例：培培養(yǎng)紫草細細胞、水母母雪蓮細胞胞5、植物細細胞生物反反應(yīng)器培養(yǎng)養(yǎng)存在的主主要問題生長緩慢；次級代謝謝物含量低低；培養(yǎng)細細胞不穩(wěn)定定等；多數(shù)數(shù)產(chǎn)物積累累于胞內(nèi)；不耐受剪剪切力

41、。必須首先解解決的重要要問題：細細胞生長及及代謝途徑徑基礎(chǔ)研究究、反應(yīng)器器結(jié)構(gòu)與工工藝優(yōu)化七、植物細細胞兩相培培養(yǎng)技術(shù) 兩兩相培養(yǎng)技技術(shù)在培養(yǎng)養(yǎng)體系中加加入水溶性性或脂溶性性的有機物物或者具有有吸附作用用的多聚化化合物，使使培養(yǎng)體系系形成上、下兩相，細胞在水相中生長，合成的次生代謝產(chǎn)物分泌出來后轉(zhuǎn)移到有機相中的技術(shù)。其優(yōu)點是：不僅減少了產(chǎn)物的反饋抑制作用，提高產(chǎn)物含量，而且通過有機相的回收循環(huán)使用實現(xiàn)了連續(xù)培養(yǎng)。這種技術(shù)最初是應(yīng)用于蛋白質(zhì)提取、乙醇發(fā)酵及微生物培養(yǎng)上的。兩相培養(yǎng)系系統(tǒng)滿足條條件：1、添加的的有機物或或多聚化合合物對植物物細胞無毒毒，不會影影響細胞生生長。2、產(chǎn)物能能比較容易易被

42、有機物物吸附或溶溶解于有機機相中。3、兩相容容易分離 4、有機物物或多聚化化合物不能能吸收培養(yǎng)養(yǎng)基中的有有效成分。八、植物細細胞的生物物反應(yīng)器固固定化培養(yǎng)養(yǎng) 細細胞固定化化將游離離的細胞包包埋在多糖糖或多聚化化合物制備備成的網(wǎng)狀狀支持物中中，培養(yǎng)液液呈流動狀狀態(tài)進行無無菌培養(yǎng)的的一門技術(shù)術(shù)。 常常用的固定定化方法：吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法等等。常采用用包埋法，可可以采用海海藻酸鹽、卡拉膠、瓊脂、瓊瓊脂糖、角角叉藻膠、白明膠等等作為包埋埋劑。九、植物細細胞培養(yǎng)存存在的問題題與發(fā)展趨趨勢1、存在問問題（1）技術(shù)術(shù)問題生物反反應(yīng)器設(shè)計計缺陷多細胞易易聚集分層層、易變異異放大培培養(yǎng)不足（2）經(jīng)濟

43、濟方面 成成本高、工工業(yè)化經(jīng)濟濟效益低2、發(fā)展趨趨勢（1）高效效細胞系的的篩選（2）發(fā)展展大規(guī)模細細胞培養(yǎng)所所用的培養(yǎng)養(yǎng)基，降低低成本（3）開發(fā)發(fā)出適合植植物細胞大大規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)的生物反反應(yīng)器系統(tǒng)統(tǒng)（4）兩相相培養(yǎng)、固固定化培養(yǎng)養(yǎng)技術(shù)是極極具發(fā)展前前景的技術(shù)術(shù)（5）對細細胞分化、次生代謝謝產(chǎn)物和培培養(yǎng)條件之之間的關(guān)系系進行基礎(chǔ)礎(chǔ)研究第5節(jié) 植物物原生質(zhì)體體培養(yǎng)5.1定定義、特點點及用途5.2原原生質(zhì)體的的制備5.3原原生質(zhì)體的的培養(yǎng)5.4原原生質(zhì)體的的發(fā)育和植植株再生一、原生質(zhì)質(zhì)體1、定義 在在植物細胞胞中除細胞胞壁以外的的成分就稱稱為原生質(zhì)質(zhì)體，植物物原生質(zhì)體體實際上就就是除去細細胞壁的裸裸露

44、球形細細胞。2、特點及及用途 含含有核、質(zhì)質(zhì)、膜及各各種細胞器器，只是沒沒有細胞壁壁。方便進進行各種遺遺傳操作，并并能攝取外源源基因、細細胞器、染染色體、質(zhì)質(zhì)粒、病毒毒、細菌等等外源物質(zhì)質(zhì)，是植物物細胞工程程進行遺傳傳操作、基因轉(zhuǎn)移移的良好實實驗材料。也可以進進行細胞生生理生化研研究，并且且原生質(zhì)體體具有細胞胞全能性，能能夠再生出出細胞壁并并生長發(fā)育育成完整植植株，也可可研究細胞胞壁的形成成。另外也也容易克服服不同種細細胞間的不不親和障礙礙，容易實實現(xiàn)細胞融融合和細胞胞雜交，培培育新品種種。二、原生質(zhì)質(zhì)體的制備備1、來源 植植物體的細細嫩部分是是制備原生生質(zhì)體的理理想材料，比比如雙子葉葉植物的

45、幼幼葉、子葉葉、根、下下胚軸的切切段、花粉粉等。葉片片由于取材材容易而廣廣泛采用，但但單子葉植植物特別是是禾本科植植物葉片表表面常含有有硅質(zhì)不易易被酶液降降解，不適適宜用來制制備原生質(zhì)質(zhì)體，通常常用其組培培產(chǎn)生的愈愈傷組織或或懸浮培養(yǎng)養(yǎng)的細胞。2、分離（1）機械械法（最初初方法）先將材材料放在高高滲蔗糖溶溶液中使細細胞發(fā)生質(zhì)質(zhì)壁分離，最最后原生質(zhì)質(zhì)體收縮成成球形完全全與細胞壁壁脫離，此此時用剪刀刀剪碎組織、切破細胞胞壁，使原原生質(zhì)體釋釋放出來。這種方法法操作難度度大，產(chǎn)量量低，費時時費力，且且無法從分分生組織中中分離得到到原生質(zhì)體體。（2）酶解解法（常用用方法）這是19660年英國國諾丁漢大大

46、學(xué)的科金金創(chuàng)立的分分離制備大大量植物原原生質(zhì)體的的方法。利利用從漆斑斑霉提取的的纖維素酶酶粗制劑，從從番茄幼苗苗根尖分離離出大量原原生質(zhì)體。這種方法法條件溫和和、原生質(zhì)質(zhì)體完整性性好、活力力高、得率率高。制備備原生質(zhì)體體常用的酶酶有：纖維維素酶、果果膠酶、半半纖維素酶酶、瓊脂酶酶、蝸牛酶酶等。例：科金分分離制備番番茄根尖原原生質(zhì)體方方法步驟：（1）取材材消毒：將鮮嫩嫩植物組織織水洗后用用70%酒精精浸泡1mmin，再再用8%次氯酸酸鈉浸泡11min表表面消毒，無無菌水洗334次。（2）酶解解制備超凈臺臺上2528恒溫溫水浴60090miin。（3）原生生質(zhì)體收集集用3000400目不不銹鋼網(wǎng)過

47、過濾酶解材材料，棄去去殘渣，6600r/min離離心10mmin，棄棄上清，沉沉淀懸浮在在0.166mol/LCaCCl222H2O溶溶液中，緩緩緩注入220%蔗糖糖溶液，同同速離心110minn，收集兩兩液面間原原生質(zhì)體帶帶備用。3、純化（1）過濾濾-離心法40100m網(wǎng)篩低低速離心數(shù)數(shù)次（2）漂浮浮法25%蔗糖溶液液中漂浮吸管（3）沉降降法與漂浮浮法結(jié)合低速離離心211%蔗糖懸懸浮離心洗滌液離離心（2次以上）4、鑒定（1）低滲滲爆破（低低滲吸水膨膨脹）吸水脹破后后不成形真原生質(zhì)質(zhì)體吸水脹破后后保持一定定形狀帶帶有部分細細胞壁（2）熒光光染色（00.05%0.1%熒光增白白劑）發(fā)紅光真真原生

48、質(zhì)體體發(fā)綠光細細胞壁未分分解完全5、活力測測定（1）染色色法（FDDA、酚藏藏花紅、伊伊文思藍）FDA（熒熒光素雙醋醋酸鹽）法法：本沒有有熒光，能能透過原生生質(zhì)膜，并并在內(nèi)酯酶酶作用下水水解為不能能排出、積積累在質(zhì)膜膜內(nèi)的熒光光素。發(fā)綠光光活不發(fā)熒光光死酚藏花紅紅染料法：不著色活紅色色死伊文思藍藍染色法：不著色活藍色色死（2）胞質(zhì)質(zhì)環(huán)流法（3）滲透透壓變化：吸水、失失水活，不不變死（4）氧電電極法：OO2活，不變變死三、原生質(zhì)質(zhì)體培養(yǎng)（1）液體體培養(yǎng)法（2）固體體平板法（3）雙層層培養(yǎng)法四、原生質(zhì)質(zhì)體的發(fā)育育和植株再再生（1）細胞胞壁再生（2）細胞胞分裂（3）愈傷傷組織或胚胚狀體的形形成（4）

49、植株株再生（愈愈傷組織誘誘導(dǎo)、誘導(dǎo)導(dǎo)胚狀體）所采用技術(shù)的理論基礎(chǔ) 植物細胞工程通常采用的技術(shù)手段 植物組織培養(yǎng) 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交植物細胞的全能性植物細胞培養(yǎng) 第三章小結(jié)結(jié)：一、植物組組織培養(yǎng)（概概念、原理理、培養(yǎng)條條件、常用用儀器、步步驟、應(yīng)用用、人工種種子等）二、植物細細胞培養(yǎng)（概概念、理論論基礎(chǔ)、方方法分類、培養(yǎng)條件件、常用儀儀器、制備備方法、培培養(yǎng)方法、保存方法法、應(yīng)用、固定化培培養(yǎng)及方法法等）三、兩相培培養(yǎng)技術(shù)（概概念、優(yōu)點點、條件）四、植物原原生質(zhì)體培培養(yǎng)（概念念、用途、制備、培培養(yǎng)、再生生植株方法法及技術(shù)路路線等）思考題：1、什么是是植物組織織培養(yǎng)和細細胞培養(yǎng)？有怎樣的

50、的區(qū)別？2、舉例說說明植物組組織培養(yǎng)的的快速繁殖殖技術(shù)的步步驟和方法法。3、植物組組織培養(yǎng)的的主要意義義有哪些？最新進展展如何？4、植物細細胞培養(yǎng)最最主要的用用途體現(xiàn)在在哪里？舉舉例說明。5、植物細細胞培養(yǎng)的的營養(yǎng)成分分主要包括括哪些？6、什么是是兩相培養(yǎng)養(yǎng)技術(shù)？有有什么優(yōu)點點？7、簡述原原生質(zhì)體培培養(yǎng)再生完完整植株的的技術(shù)路線線。補充思考題題：1、為什么么莖尖分生生組織培養(yǎng)養(yǎng)能夠獲得得脫病毒植植株？2、培養(yǎng)基基、外植體體、玻璃器器皿、金屬屬用具等一一般選擇怎怎樣的滅菌菌方法？3、目前用用作原生質(zhì)質(zhì)體分離的的材料有哪哪些？4、哪些類類型的外植植體適宜用用作建立懸懸浮細胞系系起始培養(yǎng)養(yǎng)物？5、一

51、個好好的植物懸懸浮細胞系系有哪些特特征？6、人工種種子利用有有何優(yōu)點？第四章動動物細胞與與組織培養(yǎng)養(yǎng)一、動物細細胞的特點點二、動物細細胞與組織織培養(yǎng)的定定義三、動物細細胞的體外外培養(yǎng)生長長特性四、動物細細胞、組織織培養(yǎng)的基基本技術(shù)五、組織工工程六、器官培培養(yǎng)七、干細胞胞第1節(jié) 動物物細胞的特特點動物細胞與與微生物細細胞相比，有有以下特點點：1、比微生生物細胞大大，沒有細細胞壁；2、動物細細胞間主要要以聚集體體形式存在在；3、生長慢慢，周期長長，易受污污染；4、原代細細胞一般繁繁殖50代左右右就退化死死亡；5、需O22少，對剪剪切力敏感感。第2節(jié)動動物細胞與與組織培養(yǎng)養(yǎng)的定義動物細胞與與組織培養(yǎng)

52、養(yǎng)從動物物體內(nèi)取出出細胞或組組織，模擬擬體內(nèi)的生生理環(huán)境，在在無菌、適適溫和豐富富的營養(yǎng)條條件下，使使離體細胞胞或組織生生存、生長長并維持結(jié)結(jié)構(gòu)和功能能的一門技技術(shù)。原代培養(yǎng)將機體體取出的細細胞或組織織進行實效效培養(yǎng)的過過程。實效效培養(yǎng)的細細胞大約增增殖10代左右右，稱原代代細胞。傳代培養(yǎng)從原代代培養(yǎng)的細細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的的過程。第3節(jié) 發(fā)展歷歷史（自學(xué)學(xué)）第4節(jié)節(jié)動物細細胞體外培培養(yǎng)的生長長特性一、貼附型型細胞 貼貼附生長的的細胞。也也就是細胞胞與細胞之之間接觸、與細胞外外基質(zhì)結(jié)合合生長。大大多數(shù)哺乳乳動物細胞胞屬于此類類型。1、成纖維維細胞型細細胞（如人人胚肺細胞胞、小鼠成成纖維細胞胞等

53、）2、上皮型型細胞（如如表皮細胞胞、宮頸癌癌細胞等）3、游走型型細胞（如如淋巴細胞胞、巨噬細細胞等）4、多形型型細胞（如如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)質(zhì)細胞等）二、非貼附附型細胞（懸懸浮生長，如如血液白細細胞、淋巴組織織細胞）第5節(jié) 動物物細胞、組組織培養(yǎng)的的基本技術(shù)術(shù)5.1培培養(yǎng)工具5.2培培養(yǎng)條件5.3動動物細胞培培養(yǎng)的傳統(tǒng)統(tǒng)方法5.4原原代培養(yǎng)與與傳代培養(yǎng)養(yǎng)技術(shù)5.5貼貼壁培養(yǎng)技技術(shù)5.6動動物細胞大大規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)技術(shù)5.7動動物細胞生生物反應(yīng)器器大規(guī)模培培養(yǎng)5.8細細胞冷凍保保存技術(shù)5.9動動物細胞體體外培養(yǎng)舉舉例5.10動物細胞胞體外培養(yǎng)養(yǎng)現(xiàn)狀與展展望一、培養(yǎng)工工具 培養(yǎng)器器皿（玻璃璃、塑料）、空

54、心纖維維、微珠二、培養(yǎng)條條件1、溫度（337）2、pH值值（pH77.27.4）3、氣體（OO2、CO2）4、營養(yǎng)（氨氨基酸、維維生素、輔輔酶、核酸酸、嘌呤、嘧啶、激激素、生長長因子、葡葡萄糖、無無機鹽等，其其中多種成成分可由血血清提供）（1）天然然培養(yǎng)基（血血清、雞胚胚汁等）（2）合成成培養(yǎng)基（MEM、DMEM、DME等）（3）無血血清培養(yǎng)基基（SFRRE1999-1等）此外還有一一種微囊法法，是美國國Damoon Biiotecch公司發(fā)發(fā)明的方法法。具體是是：將細胞胞懸浮于海海藻酸鈉溶溶液中，迫迫使其通過過一種成滴滴裝置后滴滴入溶液，即即形成半透透膜微囊，把把細胞包在在內(nèi)，培養(yǎng)養(yǎng)時廢物可

55、可通過半透透膜排出，所所需要的大大分子產(chǎn)物物如抗體則則被阻留積積累在囊內(nèi)內(nèi)，最后只只需離心收收集微囊并并打開囊膜膜，就可分分離獲得高高濃度的未未經(jīng)培養(yǎng)液液血清污染染的大分子子產(chǎn)物。（1）天然然培養(yǎng)基直接采采用動物體體液或從組組織中提取取的成分作作為培養(yǎng)液液，主要有有血清、組組織提取液液、雞胚汁汁等，其中中血清是最最常用最有有效的，已已知血清中中含有：蛋白質(zhì)（白白蛋白、球球蛋白、鐵鐵蛋白等）氨基酸葡萄糖激素（胰胰島素、生生長激素等等）金屬離子子促貼附物物質(zhì)（纖粘粘蛋白、冷冷析球蛋白白、膠原等等）生長因子子（EGFF、FGF、MSA、IGF等）維持細胞胞生長繁殖殖及保持生生物學(xué)性狀狀不明成分分血清

56、常用牛牛血清和馬血清（HS,hhorsee serrum），牛牛血清又分分為胎牛血血清（FBS,fetaal boovinee serrum）和和犢牛血清清（CS,ccalf seruum）。血血清質(zhì)量好好壞是實驗驗成敗的關(guān)關(guān)鍵。優(yōu)質(zhì)血清的的標準：透透明，淡黃黃色，無沉沉淀物，無無細菌、支支原體、病病毒污染血清的消毒毒：過濾除除菌優(yōu)點：營養(yǎng)養(yǎng)成分豐富富，培養(yǎng)效效果好。缺點：來源源有限；成成分復(fù)雜，影影響對某些些實驗產(chǎn)物物的提取和和實驗結(jié)果果的分析；易發(fā)生支支原體污染染；影響后后期分離、純化細胞胞產(chǎn)物；成成本高。（2）合成成培養(yǎng)基根據(jù)細細胞生存所所需物質(zhì)的的種類和數(shù)數(shù)量，用人人工方法模模擬合成的

57、的培養(yǎng)基，如如MEM、DMEMM、DME、M1999、F12、RPMII16400等培養(yǎng)基基，需加入入520%血清清，最常用100%小牛血血清。優(yōu)點：成分分已知，便便于對實驗驗條件控制制，能進行行標準化生生產(chǎn)，成本本低。缺點：不能能完全取代代天然培養(yǎng)養(yǎng)基的成分分，需加入入血清，具具血清的缺缺陷。（3）無血血清培養(yǎng)基基一般由由基礎(chǔ)培養(yǎng)養(yǎng)基、生長因子子和激素、基質(zhì)組成，主主要以各種種激素、生生長因子、維生素、載體蛋白白、微量元元素、乙醇醇胺以及貼貼壁與展開開因子取代代含血清培培養(yǎng)基中的的血清部分分。常用培培養(yǎng)基有DME、F12、RPMII16400等，其中中又以11的DME和F12混合合培養(yǎng)基最最

58、為常用。專用無血血清培養(yǎng)基基如SFRRE19991、NCTCC135等等。常用基基質(zhì)有纖黏黏素、血清清鋪展因子子、胎球蛋蛋白、膠原原等。優(yōu)點：排除除了血清的的干擾，保保證了實驗驗結(jié)果的準準確性、可可重復(fù)性和和穩(wěn)定性，減減少了細胞胞污染，簡簡化了提純純和鑒定各各種細胞產(chǎn)產(chǎn)物的程序序。缺點：不同同細胞株添添加因子不不同；處于于研究階段段，難以推推廣。（4）培養(yǎng)養(yǎng)必需的溶溶液BSS（Hankks、Earlle等）pH調(diào)整整液（NaaHCO33、HEPEES等）細胞消化化液（胰蛋蛋白酶、EEDTA等等）抗生素溶溶液（青霉霉素、鏈霉霉素、卡那那霉素、制制霉菌素等等）BSS（Hankks、Earlle等）

59、由生理理鹽水和葡葡萄糖配成成，用于維維持細胞的的滲透壓、維持pHH和細胞正正常的代謝謝等。葡萄糖糖在培養(yǎng)液液中的含量量一般為11g/L（低低糖）或44.5g/L（高糖糖）。 Haanks 平衡鹽溶溶液(HBBSS) 和 Earlle平衡鹽鹽溶液(EEBSS)的主要差差別在于碳碳酸氫鈉的的水平，在在Earlle(2.2g/LL)中比在在Hankks (00.35gg/L) 中高。 Hankks 液緩緩沖能力較較弱，Earlle液緩沖沖能力較強強。碳酸氫氫鈉需用高高水平的CCO2平衡衡，以維持持溶液的ppH值。Earrle液在在空氣水平平的CO22 中會變變堿，Haanks液液在CO22培養(yǎng)箱中中

60、會變酸。Hankks 液要要在空氣中中使用，不不需要COO2培養(yǎng)箱箱。如果希希望在COO2培養(yǎng)箱箱中保存組組織，需要要用Earrle液。如果僅僅僅是清洗洗將要在細細胞培養(yǎng)基基中儲存的的組織，用用Hankks液就可以了了。 pH調(diào)整整液（NaaHCO33、HEPEES等）常用的的有3.77%、5.6%、7.4%NaHCCO3、HEPEES液（二二羥乙基哌哌嗪乙烷磺磺酸）等。培養(yǎng)基基中NaHHCO3 的含量將將決定細胞胞培養(yǎng)時應(yīng)應(yīng)使用的CCO2 濃濃度。當培培養(yǎng)基中NNaHCOO3 含量量為3.77 g/LL 時，細胞胞培養(yǎng)時應(yīng)應(yīng)使用100 % CCO2；當當培養(yǎng)基中中NaHCCO3 為為1.5