生物技術概論

1、.wd.wd.wd.一、生物技術的定義 生物技術biotechnology，有時也稱生物工程bioengineering，是指人們以現(xiàn)代生命科學為根基, 結(jié)合其他根基學科的科學原理，采用先進的工程技術手段，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或到達某種目的。因此，生物技術是一門新興的、綜合性的學科。 先進的工程技術手段是指基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程和蛋白質(zhì)工程等新技術。改造生物體是指獲得優(yōu)良品質(zhì)的動物、植物或微生物品系。生物原料那么指生物體的某一局部或生物生長過程所能利用的物質(zhì)，如淀粉、糖蜜、纖維素等有機物，也包括一些無機化學品，甚至某些礦石。為人類生產(chǎn)出所需

2、的產(chǎn)品包括糧食、醫(yī)藥、食品、化工原料、能源、金屬等各種產(chǎn)品。到達某種目的那么包括疾病的預防、診斷與治療、環(huán)境污染的檢測和治理等。 二、生物技術的研究內(nèi)容 根據(jù)生物技術操作的對象及操作技術的不同，生物技術主要包括以下5 項技術工程。 1基因工程 基因工程gene engineering是應用人工方法把生物的遺傳物質(zhì) DNA別離出來，在體外進展切割、拼接和重組。然后將重組了的DNA 導入某種宿主細胞或個體，從而改變它們的遺傳品性; 有時還使新的遺傳信息基因在新的宿主細胞或個體中大量表達，以獲得基因產(chǎn)物多肽或蛋白質(zhì)。這種創(chuàng)造新生物并給予新生物以特殊功能的過程就稱為基因工程，也稱為DNA 重組技術。

3、2細胞工程 細胞工程cell engineering是指以細胞為 基本單位，在體外條件下進展培養(yǎng)、繁殖，或人為地使細胞某些生物學特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而到達改良生物品種和創(chuàng)造新品種，加速繁育動、植物個體，或獲得某種有用的物質(zhì)的過程。細胞工程應包括動、植物細胞的體外培養(yǎng)技術、細胞融合技術也稱細胞雜交技術)、細胞器移植技術等。 3發(fā)酵工程 發(fā)酵工程fermentation engineering是利用微生物生長速度快、生長條件簡單以及代謝過程特殊等特點，在適宜條件下通過現(xiàn)代化工程技術手段，由微生物的某種特定功能生產(chǎn)出人類所需的產(chǎn)品稱為發(fā)酵工程,有時也稱微生物工程。 4酶工程 酶工程enzym

4、e engineering是利用酶、細胞器或細胞所具有的特異催化功能，或?qū)γ高M展修飾改造，并借助生物反響器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項技術。它包括酶的固定化技術、細胞的固定化技 術、酶的修飾改造技術及酶反響器的設計等技術。 5蛋白質(zhì)工程 蛋白質(zhì)工程protein engineering是指在基因工程的根基上，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)晶學、計算機輔助設計和蛋白質(zhì)化學等多學科的根基知識，通過對基因的人工定向改造等手段，從而到達對蛋白質(zhì)進展修飾、改造、拼接以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)。 一、改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、解決食品短缺 1提高農(nóng)作物產(chǎn)量及其品質(zhì) 1、培育抗逆的作物優(yōu)良品系 通過基因工程技術對生物進展基因

5、轉(zhuǎn)移，使生物體獲得新的優(yōu)良品性，稱之為轉(zhuǎn)基因技術。利用轉(zhuǎn)基因技術可以培育出具有抗寒、抗旱、抗鹽、抗病蟲害等抗逆特性及品質(zhì)優(yōu)良的作物新品系，如轉(zhuǎn)蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis，Bt毒蛋白基因的抗蟲棉花。 2、植物種苗的工廠化生產(chǎn) 利用細胞工程技術對優(yōu)良品種進展大量的快速無性繁殖，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，即植物微繁殖技術，又稱植物微繁殖技術。利用這種無性繁殖技術，可在短時間內(nèi)得到遺傳穩(wěn)定的、大量的小苗試管苗，并可實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。利用植物微繁殖技術還可培育出不帶病毒的脫毒苗。 植物的微繁殖技術已廣泛地應用于花卉、果樹、蔬菜、藥用植物和農(nóng)作物的快速繁殖。 3、提高糧食品質(zhì) 生物技術除

6、了可培育高產(chǎn)、抗逆、抗病蟲害的新品系外，還可培育品質(zhì)好、營養(yǎng)價值高的作物新品系。例如，科學家將水仙花和玉米合成-胡蘿卜素的基因?qū)胨九嘤龈?胡蘿卜素含量的水稻GoldenRice，黃金稻圖1-1。 圖1-1黃金稻 a：普通水稻；b：轉(zhuǎn)水仙花-胡蘿卜素合成基因水稻；c：轉(zhuǎn)玉米-胡蘿卜素合成基因水稻 4、生物固氮，減少化肥使用量 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)均以化學肥料，如尿素、硫酸銨作為氮肥的主要來源?；实氖褂貌豢煞乐沟貛砹送恋氐陌褰Y(jié)，肥力的下降；化肥的生產(chǎn)又將導致環(huán)境的污染。科學家們正努力將具有固氮能力的細菌的固氮基因轉(zhuǎn)移到作物根際周圍的微生物體內(nèi)，希望由這些微生物進展生物固氮，減少化肥的使用量。 5、生

7、物農(nóng)藥，生產(chǎn)綠色食品 近年來，人們越來越注意農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)開展及人與環(huán)境的協(xié)調(diào)，特別是由于化學農(nóng)藥的毒性作用及篩選新農(nóng)藥的困難，企業(yè)和研究人員開場把注意力轉(zhuǎn)向生物農(nóng)藥的研究開發(fā)與使用。因其不污染環(huán)境，對人和動植物安全，不傷害天敵，所以開展生物農(nóng)藥已成為保障人類安康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)開展的重要趨勢。 2開展畜牧業(yè)生產(chǎn) 1、動物的大量快速無性繁殖 1997年2月英國Roslin研究所的Wilmut等在?Nature?雜志上登載了用綿羊乳腺細胞培育出“多莉圖1-2。證明動物體細胞也具有全能性，同樣有可能進展動物的大量、快速無性繁殖。 圖1-2“多莉及其代孕母親蘇格蘭黑面綿羊 二、培育動物的優(yōu)良品系 利用

8、轉(zhuǎn)基因技術，將與動物優(yōu)良品質(zhì)有關的基因轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)，使動物獲得新的品質(zhì)。1983年美國學者將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈螳@得轉(zhuǎn)基因小鼠。除了小鼠外，科學家們已成功地培育了轉(zhuǎn)基因羊、轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬、轉(zhuǎn)基因魚等多種動物新品系。 2、提高生命質(zhì)量，延長人類壽命 1開發(fā)制造奇特而又貴重的新型藥品 1977年，美國首先采用大腸桿菌生產(chǎn)了人類第一個基因工程藥物人生長激素釋放抑制激素。利用基因工程生產(chǎn)的藥物，除了人生長激素釋放抑制激素外，還有人胰島素、人生長激素、人干擾素等。 2疾病的預防和診斷 傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)方法對某些疫苗的生產(chǎn)和使用，存在著免疫效果不夠理想、被免疫者有被感染的風險等缺乏。利用基因工程

9、生產(chǎn)重組疫苗可以到達安全、高效的目的。如已經(jīng)上市或已進入臨床試驗的病毒性肝炎疫苗；腸道傳染病疫苗包括霍亂、痢疾等等。 利用細胞工程技術可以生產(chǎn)單克隆抗體。單克隆抗體既可用于疾病治療，又可用于疾病的診斷。利用基因工程技術還可生產(chǎn)診斷用的DNA試劑。 3基因治療 導入正常的基因來治療由于基因缺陷而引起的疾病，一直是人們長期以來追求的目標。1990年，美國FDA批準了用ADA(腺苷脫氨酶基因)基因治療嚴重聯(lián)合型免疫缺陷病，并取得了較滿意的結(jié)果。 三、解決能源危機、治理環(huán)境污染 1解決能源危機 生物能源將是最有希望的新能源之一，而其中又以乙醇最有希望成為新的替代能源?？茖W家們希望找到一種可以利用大量的

10、農(nóng)業(yè)廢棄物如雜草、木屑、植物的秸桿等纖維素或木質(zhì)素類物質(zhì)或其他工業(yè)廢棄物作的微生物。通過微生物發(fā)酵或固定化酶技術，將農(nóng)業(yè)或工業(yè)的廢棄物變成沼氣或氫氣。 2環(huán)境保護 傳統(tǒng)的化學工業(yè)生產(chǎn)過程大多在高溫高壓下進展，是一個典型的耗能過程并帶來環(huán)境的嚴重惡化。如果改用生物技術方法來生產(chǎn)，不僅可以節(jié)約能源還可以防止環(huán)境污染。例如用化學方法生產(chǎn)農(nóng)藥，不僅耗能而且嚴重污染環(huán)境，如改用蘇云金桿菌生產(chǎn)毒性蛋白，即可節(jié)約能源而且該蛋白質(zhì)對人體無毒。 四、制造工業(yè)原料、生產(chǎn)貴重金屬 1制造工業(yè)原料 利用微生物在生長過程中積累的代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)食品工業(yè)原料，種類繁多。概括起來，主要有以下幾個大類：氨基酸類，主要有谷氨酸(

11、即味精)、賴氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、纈氨酸等；酸味劑，主要有檸檬酸、乳酸、蘋果酸、維生素C等；甜味劑，主要有高果糖漿、天冬甜精、氯化砂糖。 發(fā)酵技術還可用來生產(chǎn)化學工業(yè)原料。主要有傳統(tǒng)的通用型化工原料如乙醇、丙酮、丁醇等產(chǎn)品。 2生產(chǎn)貴重金屬 一、基因工程的定義 在漫長的生物進化過程中，基因重組從來沒有停頓過。在自然力量及人類干擾下，通過基因重組、基因突變和基因轉(zhuǎn)移等途徑，生物界無止境地進化,，不斷使物種趨向完善,出現(xiàn)了今天各具特性的繁多物種。有的能忍耐高溫，有的不怕嚴寒，有的能適應干旱的沙漠，有的可在高鹽度的海灘上或海水中生繁，有的能固定大氣中的氮素種種生物的特殊性狀成為今天定向改

12、造生物、創(chuàng)造新物種的豐富遺傳資源。但是沒有一種生物是完美無缺的，因此，有待科技工作者有目的地去進一步改造。按照人們的愿望，進展嚴密的設計，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)移等技術，有目的地改造生物特性，在較短的時間內(nèi)使現(xiàn)有物種的性能得到改善，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型，或者利用這種技術對人類疾病進展基因治療，這就是基因工程。 基因工程最突出的優(yōu)點是打破常規(guī)育種難以突破的物種之間的界限，可以使原核生物與真核生物之間，動物與植物之間，甚至人與其他生物之間的遺傳信息進展相互重組和轉(zhuǎn)移。在冶金工業(yè)方面，面對數(shù)量龐大的廢渣礦、貧礦、尾礦、廢礦，采用一般的采礦技術已無能為力，惟有利用細菌的浸礦技術才能對這類

13、礦石進展提煉。可浸提的金屬包括金、銀、銅、鈾、錳、鉬、鋅、鈷、鎳、鋇、鉈等10多種貴重金屬和稀有金屬。 1、基因工程研究的理論依據(jù) 1不同基因具有一樣的物質(zhì)根基 地球上幾乎所有的生物，從細菌到高等動物和植物直至人類，它們的基因都是一個具有遺傳信息的DNA片段。所有生物的DNA的組成和 基本構造都是一樣的。因此，不同生物的基因DNA片段原那么上是可以重組互換的。雖然有些病毒的基因是RNA，但這些病毒的RNA仍可以通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNAcomplementaryDNA，互補DNA，并不影響不同基因之間的重組。 2基因是可以切割的 基因直線排列在DNA上。除少數(shù)基因重疊排列外，大多數(shù)基因彼此之間存在

14、著間隔序列。因此，作為DNA分子上一個特定核苷酸序列的基因，允許從DNA分子上一個一個完整地切割下來。 3基因是可以轉(zhuǎn)移的 基因不僅是可以切割下來的，而且攜帶基因的DNA分子可以在不同生物之間轉(zhuǎn)移，或者在生物體內(nèi)的染色體上遷移，甚至可以在不同染色體間跳躍，插入到靶DNA分子中。由此說明，基因是可以轉(zhuǎn)移的，而且是可以重組的。轉(zhuǎn)移后的基因一般仍有功能。 4多肽與基因之間存在對應關系 普遍認為，一種多肽就有一個相對應的基因。因此，基因的轉(zhuǎn)移或重組最終可以根據(jù)其表達產(chǎn)物多肽的性質(zhì)來考察。 5遺傳密碼是通用的 所有生物從低等的病毒直至人類，蛋白質(zhì)合成都使用同一套遺傳密碼，只有少數(shù)例外，也就是說遺傳密碼是

15、通用的。重組的DNA分子不管導入什么樣的生物細胞中，只要具備轉(zhuǎn)錄翻譯的條件，其上面的遺傳密碼均能轉(zhuǎn)錄翻譯出相應的氨基酸。即使人工合成的DNA分子基因，其上面的遺傳密碼同樣可以轉(zhuǎn)錄翻譯出相應的氨基酸。 6基因可以通過復制把遺傳信息傳給下一代 經(jīng)重組的基因在適宜條件下是能傳代的，可以獲得相對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因生物。 3、基因工程操作的 基本技術路線 基因工程是一項比較復雜的技術，如果拋開細節(jié)問題，基因工程操作的 基本技術路線如圖2-1所示。 圖2-1基因工程的 基本技術路線 以上技術路線概括為4個步驟：獲得目的基因；構建克隆載體；目的基因與克隆載體重組后導入受體細胞；獲得克隆子；對克隆子中目的基因進展檢

16、測和鑒定。 一、DNA的組成與構造 1DNA的組成 DNA是一類由4種脫氧核苷酸按照一定的順序聚合而成的大分子。脫氧核苷酸分子由脫氧核糖、磷酸和堿基組成。脫氧核糖的第一位碳原子(1) 上連接一個堿基，第5 位碳原子(5) 上連接一個磷酸基團，組成一個脫氧核苷酸。一個脫氧核苷酸的脫氧核糖的5磷酸基團和另一個脫氧核苷酸的脫氧核糖的3羥基結(jié)合形成磷酸二酯鍵, 把兩個脫氧核苷酸連接在一起。多個脫氧核苷酸按此方式連接成多聚脫氧核苷酸, 其一端為游離的5磷酸基團5-P，稱為5端，而另一端為游離的3羥基3-OH，稱為3端圖2-1。如果連接成的多聚脫氧核苷酸是環(huán)狀的，那么無游離的端和3端。 圖2-1 DNA的

17、一段多聚脫氧核苷酸鏈 組成DNA的堿基有腺嘌呤A、鳥嘌呤G、胞嘧啶C、胸腺嘧啶T4種，分別含有這4種堿基的脫氧核苷酸依次稱為腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸和胸腺嘧啶脫氧核苷酸。多聚脫氧核苷酸鏈中，各種脫氧核苷酸的脫氧和糖和磷酸的構造和位置是一致的，不同的只是堿基，因此多聚脫氧核苷酸鏈DNA鏈中的脫氧核苷酸可以用堿基來表示。例如5端開場依次由脫氧鳥苷酸、脫氧胞苷酸、脫氧胞苷酸、脫氧腺苷酸、脫氧胸苷酸連接成的多聚脫氧核苷酸片段可用堿基5-GCCAT-3表示。 2DNA的構造 DNA通常以雙鏈形式存在。兩條脫氧核苷酸鏈總是按堿基A與T、G與C互補配對，通過氫鍵形成穩(wěn)定的雙螺旋構

18、造，稱為雙鏈DNA (圖2-2)。絕大局部生物細胞中的DNA都是雙鏈，只有少數(shù)病毒噬菌體中的DNA以單鏈形式存在。 圖2-2 DNA雙鏈示意圖 二、DNA的功能 1DNA分子能在細胞內(nèi)復制 DNA的功能之一是在細胞內(nèi)能夠進展半保存復制。復制后，新產(chǎn)生的雙鏈DNA分子中含有一條舊鏈和一條新鏈，使DNA攜帶的信息可以準確傳遞。 2攜帶遺傳信息 DNA是生物界遺傳信息的主要攜帶者，DNA上的局部核苷酸序列決定著RNA的核苷酸序列。通過轉(zhuǎn)錄，這些核苷酸序列分別指令轉(zhuǎn)錄出核糖體RNArRNA、轉(zhuǎn)移RNAtRNA) 和信使RNA(mRNA。rRNA是核糖體的一局部；tRNA在蛋白質(zhì)合成過程中轉(zhuǎn)運氨基酸；m

19、RNA上的核苷酸序列編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，經(jīng)過翻譯把遺傳信息進一步傳遞給蛋白質(zhì)多肽。 基因應包括轉(zhuǎn)錄啟動子的序列和轉(zhuǎn)錄區(qū)的序列。在轉(zhuǎn)錄過程中，構成啟動子的序列不轉(zhuǎn)錄出相應的RNA序列，只有轉(zhuǎn)錄區(qū)的序列才轉(zhuǎn)錄出相應的RNA序列。 一個基因或一個操縱子能否有效轉(zhuǎn)錄，首先取決于其上游是否存在有效的啟動子。啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點。轉(zhuǎn)錄區(qū)從轉(zhuǎn)錄的起始位點開場，包括基因編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子。 基因編碼區(qū)指轉(zhuǎn)錄mRNA上起始密碼AUG少數(shù)為GUG至終止密碼UAGUAA、UGA的各種遺傳密碼的核苷酸序列。原核生物的轉(zhuǎn)錄區(qū)有的是由2個或2個以上基因組成的操縱子。組成同一操縱子的所有基因共用一個啟動

20、子，但是每個基因的編碼區(qū)都含有起始密碼序列和終止子序列，兩個基因編碼區(qū)之間往往含有非編碼的間隔序列。真核生物的轉(zhuǎn)錄區(qū)，一個啟動子只控制轉(zhuǎn)錄一個基因的編碼區(qū)，但編碼區(qū)內(nèi)除了各種編碼序列以外，往往含有一個或幾個長度不同的非編碼間隔序列區(qū)，稱為內(nèi)含子intron。被內(nèi)含子分隔的編碼序列，稱為外顯子exon。 在基因編碼區(qū)下游有一段使轉(zhuǎn)錄終止的核苷酸序列，稱為轉(zhuǎn)錄終止子terminator。一個操縱子雖然由多個基因組成，但與啟動子一樣也只需要一個終止子。 一、限制性核內(nèi)切酸酶和DNA片段化 1限制性核內(nèi)切酸酶 限制性內(nèi)切核酸酶(restrictionendo-endonuclease)能識別雙鏈DNA

21、中特定核苷酸序列，并在適宜的反響條件下使每條鏈一定位點上的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具5-磷酸基-P基和3-羥基-OH的DNA片段的內(nèi)切脫氧核苷酸酶(endo-deoxyribonuclease)。至今發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶有型酶、型酶和型酶?；蚬こ滩僮髦姓嬲杏玫氖切兔浮Ｈ绻麤]有專門說明，通常所說的限制性內(nèi)切酶就是型酶。 2限制性核內(nèi)切酸酶的識別序列 限制性內(nèi)切核酸酶在雙鏈DNA分子上能識別的特定核苷酸序列 稱之識別序列。各種限制性內(nèi)切核酸酶都有相應的識別序列。如，限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI的識別序列為GAATTC。 有一些限制性內(nèi)切核酸酶雖來源不同，但有一樣的識別序列，這樣的限制性內(nèi)切核酸酶稱

22、為之同裂酶，如BamHI和BstI具有一樣的識別序列GGATCC。 3限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點 DNA在限制性內(nèi)切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二脂鍵斷開的位置被稱為酶切位點，用表示。限制性內(nèi)切核酸酶在DNA上的酶切位點一般是在識別序列內(nèi)部，如GGATCC。 DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶酶切產(chǎn)生的末端因所用的酶不同而不同。兩條多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵端開的位置如果是交織的，產(chǎn)生的DNA片段末端的一條鏈多出1至幾個核苷酸，這樣的末端稱為粘性末端。DNA片段末端5端比3端長的稱為5粘性末端,3端比5端長的稱為3粘性末端。如果兩條多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷裂后產(chǎn)生的DNA片段末端是平齊的,稱

23、為平末端。不管是粘性末端還是平末端,5端一定是-P基團，3端一定是OH基團。 有些限制性內(nèi)切核酸酶雖然識別序列不同，但酶切DNA分子產(chǎn)生的DNA片段具有一樣的粘性末端，這樣的一組限制性內(nèi)切核酸酶稱為同尾酶。 二、特異性DNA片段的PCR擴增 1983年體外擴增DNA片段的方法產(chǎn)生，即聚合酶鏈反響(polymerasechainreaction，PCR)。采用這種方法，在反響系統(tǒng)中只要有一個待擴增的DNA拷貝，在短時間內(nèi)就能擴增出大量拷貝數(shù)的待擴增DNA片段，可滿足用于常規(guī)方法的DNA檢測和DNA重組。 1PCR 基本原理 PCR是模仿細胞內(nèi)發(fā)生的DNA復制過程進展的，以DNA互補鏈聚合反響為根

24、基，通過靶DNA變性、引物與模板DNA(待擴增DNA)一側(cè)的互補序列復性、耐熱性DNA聚合酶催化引物延伸等過程的屢次循環(huán)，產(chǎn)生待擴增的特異性DNA片段。一般反響過程是：反響系統(tǒng)加熱至90-95，雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA變性，作為互補鏈聚合反響的模板；降溫至37-60，使兩種引物分別與模板DNA鏈鏈的3一側(cè)的互補序列雜交(復性或退火)；升溫至70-75，耐熱性DNA聚合酶催化引物按53方向延伸合成模板DNA鏈的互補鏈延伸。重復以上過程，經(jīng)過25-30次循環(huán)，就可以出現(xiàn)隨待擴增的特異性DNA片段(圖2-3)。 圖2-3PCR擴增特異性PCR片段過程 2耐熱性DNA聚合酶 耐熱性DNA聚合酶

25、的發(fā)現(xiàn)，使PCR擴增特異性DNA片段成為可能。由于這種酶在靶DNA變性的高溫下仍保持活性，因此在PCR擴增特異性DNA片段的全過程中，只需一次參加反響系統(tǒng)中，不必在每次高溫變性處理后再添加酶。目前用于PCR的耐熱性DNA聚合酶主要有：TaqDNA聚合、Pwo酶等。 3PCR引物 PCR引物是PCR過程中與模板DNA局部序列互補，并能引導模板DNA互補鏈合成的一種脫氧核苷酸寡聚體，其3端必須具有游離的-OH。引物按預先設計用化學方法合成，其長短與PCR過程的特異性上下密切相關。一般來說，引物越長，特異性越高。為擴增特異性高的DNA片段，一般設計的引物由20-30核苷酸組成。 三、DNA片段的化學

26、合成 1合成引物 除上述的PCR引物外，常用的還有核苷酸序列測序引物及合城cDNA的引物等。 2合成DNA寡聚核苷酸連桿 寡聚核苷酸連桿(linker)是一種按預先設計，化學合成的寡核苷酸片段。寡聚核苷酸連桿一般由8-12個核苷酸組成，以中線為軸兩側(cè)互補對稱。其上有一種或幾種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，使連接了寡聚核苷酸連桿的DNA片段經(jīng)過這些限制性內(nèi)切核酸酶酶切后，可以產(chǎn)生一定的粘性末端，便于與具有一樣粘性末端的另一DNA片段連接。如果連桿的兩端已具有一種或兩種限制性內(nèi)切核酸酶酶切產(chǎn)生的粘性末端，可直接使兩DNA片段連接，也稱為銜接頭或接頭adaptor。 3合成基因片段 根據(jù)某基因測定的核

27、苷酸序列，或者根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列推導的核苷酸序列，可以用DNA自動合成議化學合成相應的基因片段。 一、DNA連接酶 DNA連接酶DNAligase能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3-OH與5-P之間形成磷酸二酯鍵圖2-4。DNA連接酶主要有大腸桿菌E.coliDNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。E.coliDNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補粘性末端之間的鏈接；T4DNA連接酶既可以用于雙鏈DNA片段互補粘性末端之間的鏈接，也可催化雙鏈DNA片段平末端之間的鏈接，但平末端之間鏈接的效率比較低。 圖2-4DNA連接反響示意圖 二、DNA片段之間的鏈接 1互補粘性末端片段之間的鏈接 鏈接反響

28、一般可用E.coliDNA連接酶，也可以用T4DNA連接酶圖2-5。待連接的兩個DNA片段如果是同一限制性內(nèi)切核酸酶酶切的，連接后仍保存原限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。如果用兩種同尾酶酶切的，雖然產(chǎn)生一樣的互補粘性末端，可以進展有效的連接，但獲得的重組DNA分子往往缺少了原來用于酶切的那兩種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。 圖2-5互補粘性末端片段之間的鏈接 2平末端DNA片段之間的鏈接 鏈接反響需用T4DNA連接酶。只要兩個DNA片段是平齊的，不管是用限制性內(nèi)切核酸酶酶切產(chǎn)生的，還是其他方法產(chǎn)生的，都可以進展連接圖2-6。如果在兩種不同限制性內(nèi)切核酸酶酶切后產(chǎn)生的平齊末端DNA片段之間進展連接，連

29、接后的DNA分子失去了那兩種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。如果兩個DNA片段的末端是用同一限制性內(nèi)切核酸酶酶切產(chǎn)生的，連接后的DNA分子仍保存那種酶的識別序列，有的還出現(xiàn)另一種新的限制性內(nèi)切酶的識別序列。 圖2-5平齊末端片段之間的鏈接 三、DNA片段修飾后的鏈接 待連接的兩個DNA片段經(jīng)過不同限制性內(nèi)切核酸酶酶切后，產(chǎn)生的末端不是互補的粘性末端，或者一個是粘性末端另一個是平末端。在這種情況下，鏈接之前必須對兩個末端或一個末端進展修飾。修飾的方式主要是采用外切核酸酶將粘性末端修飾成平末端；采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶簡稱末端轉(zhuǎn)移酶將平末端修飾成互補粘性末端；采用DNA聚合酶將粘性末端修飾成平末端。有

30、時為了防止待連接的兩個DNA片段自行連接成環(huán)形DNA，或自行連接成二聚體，可采用堿性磷酸酶使其中一個DNA片段5端-P修飾成-OH，即去磷酸化。 4、DNA片段加連桿或接頭后連接 如果要連接既不具互補粘性末端又不具平末端的兩種DNA片段，除了用修飾一種或兩種DNA片段末端后進展連接的方法外，還可以采用人工合成連桿或接頭。先將連桿連接到待連接的一種或兩種DNA片段末端，然后用適宜的限制性內(nèi)切酶酶切連桿，使待連接的兩種DNA片段具互補粘性末端，最后在DNA連接酶崔化下使兩種DNA片段連接，產(chǎn)生重組DNA分子。假設在DNA片段末端加的是接頭，不需利用限制性內(nèi)切酶酶切。 一、克隆載體 在轉(zhuǎn)基因研究中，

31、單獨一個包括啟動子、編碼區(qū)和終止子的基因，或者組成基因的某個元件，一般不容易進入受體細胞，即使采用理化方法進入細胞后，也不容易在受體內(nèi)穩(wěn)定維持。把能夠承載外源基因，并將其帶入受體細胞得以穩(wěn)定維持的DNA分子稱為基因克隆載體(genecloningvector)。 作為基因克隆載體一般應該具備以下條件：在克隆載體適宜的位置必須含有外源DNA片段組入的多克隆位點multiplecloningsite，對于某種克隆位點來說，在載體上一般只有一個。一般能在攜帶外源DNA基因進入受體細胞后，或停留在細胞質(zhì)中進展自我復制；或整合到染色體DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA，隨這些DNA的復制而同步復制；或自

32、成染色體同其他染色體一樣自行復制。必須含有供選擇轉(zhuǎn)化子的標記基因或報告基因。必須是安全的，不含有對受體細胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除選定的受體細胞以外的其他生物細胞，尤其是人的細胞。 基因克隆載體示意圖 二、基因工程常用質(zhì)粒載體 質(zhì)粒plasmid是一種存在于宿主細胞中染色體外的裸露DNA分子，一個質(zhì)粒就是一個DNA分子。質(zhì)粒含有復制起始位點，能在宿主細胞內(nèi)進展自主復制，但不會像某些病毒那樣進展無限制的復制，導致宿主細胞的崩潰。每個質(zhì)粒在相應的宿主細胞內(nèi)保持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù)，少數(shù)幾個，多者上百。質(zhì)粒DNA分子小的缺乏2kb,大的可達100kb以上，多數(shù)10個kb左右。 1大腸桿菌質(zhì)粒載體

33、大腸桿菌質(zhì)粒載體是一類應用廣泛的克隆載體，含有大腸桿菌源質(zhì)粒的復制起始位點，能夠在轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中進展復制。 1pBR322質(zhì)粒載體 pBR322是一種典型的常用質(zhì)粒載體。pBR322由大腸桿菌源質(zhì)粒ColE1衍生的質(zhì)粒pMB1為根基構建而成，含有ColE1的復制起始位點Col-ori,能在大腸桿菌細胞中進展高拷貝復制。含有選擇標記基因Ampr和Tetr。Ampr基因區(qū)的Pst和Pvu的識別位點，Tetr基因區(qū)的Cla、Hind、BamH和Sal等的識別位點是常用的克隆位點。pBR322分子大小為4363bp，可以克隆10kb以下的外源DNA片段。 質(zhì)粒載體pBR322 2pUC18/19質(zhì)粒

34、載體 pUC18/19質(zhì)粒載體具有pBR322的復制起始位點，含有選擇標記基因Ampr和lacZ,并在lacZ區(qū)組裝了多克隆位點(MCS)連桿,外源DNA片段插入MCS的任一克隆位點后，導致lacZ基因失活，可提供菌落藍/白選擇標記，并且插入MCS的外源基因可以在lac啟動子調(diào)控下進展表達。pUC18與pUC19的差異只是MCS連桿上的克隆位點以相反的方向排列。 pUC18/19質(zhì)粒載體 2農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體 根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當農(nóng)桿菌同植物接觸時會引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤冠癭瘤，因次稱此質(zhì)粒為Ti質(zhì)粒tumorinducingplasmid。 根癌農(nóng)桿菌引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤 Ti質(zhì)粒是一種雙鏈

35、環(huán)狀DNA分子，其大小為200kb，但是能進入植物細胞的只是一小局部，約25kb，稱為T-DNAtransferDNA。T-DNA左右兩邊界(LB，RB)各有一個選擇標記基因25bp的正向重復序列(LTS和RTS)，對T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合是不可缺少的，并且己證實T-DNA只要保存兩端邊界序列，即使中間的序列不同程度被任何一個外源DNA片段所替換，進入植物細胞后仍可整合到植物基因組中。根據(jù)Ti質(zhì)粒的這個性質(zhì)，近年來構建成含LB和RB的質(zhì)粒載體，已被廣泛地用于植物的基因轉(zhuǎn)移。 Ti質(zhì)?？寺≥d體示意圖 3T克隆載體 很多DNA聚合酶在進展PCR擴增時會在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3端加上一個突出

36、的堿基A。T克隆載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的3端帶有一個突出的T。T克隆載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進展正確的AT配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到T克隆載體中，形成含有目的片斷的重組載體。 pBM19-T克隆載體示意圖 病毒主要由DNA(或RNA)和外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為病毒顆粒。通過感染，病毒顆粒進入宿主細胞，利用宿主細胞的DNA(或RNA)復制系統(tǒng)和蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)進展DNA(或RNA)的復制和外殼蛋白的合，實現(xiàn)病毒顆粒的增殖。 一、噬菌體載體 1噬菌體載體 噬菌體由DNA(DNA)和外殼蛋白組成圖a，對大腸桿菌具有很高的感染能力。DNA在噬菌體中以線狀

37、雙鏈DNA分子存在，全長48502bp。其左右兩端各有12個核苷酸組成的5突出粘性末端(cohesiveend)圖b，而且兩者核苷酸序列互補，進入宿主細胞后，粘性末端連接成為環(huán)狀DNA分子，將此末端稱為cos位點(cohesiveendsite)。噬菌體能包裝DNA原長75%-105%的DNA片段，36.4-51kb，并且DNA上約有20kb時區(qū)域?qū)κ删w的生長不是絕對需要的，可以缺失或被外源DNA片段取代。 噬菌體示意圖 構建入噬菌體克隆載體的策略是：用適宜的限制性內(nèi)切核酸酶切去DNA上的局部或全部非必需區(qū)，相應保存這種酶的1個或2個識別序列和切割位點作為克隆位點，并用點突變或甲基化酶處理等

38、方法使必需區(qū)內(nèi)的這種酶的識別序列失效，防止外源DNA片段插入必需區(qū)。假設有必要可在非必需區(qū)組入選擇標記基因。構建的DNA載體不應小于36.4kb。由此構建成噬菌體載體。 構建噬菌體載體的示意圖 2cosmid載體 由于噬菌體載體本身必須大于36.4kb，限制了允許克隆的外源DNA片段。研究發(fā)現(xiàn)只要保存DNA兩端各不少于280bp的片段，并且該片段內(nèi)含有cos位點及與包裝相關的核苷酸序列；當插入外DNA片段后總長大于36.4kb，小于51kb；這樣的重組DNA分子就能進展有效包裝和轉(zhuǎn)導受體細胞。根據(jù)這一性質(zhì)構建了cosmid載體。cosmd載體是一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，由質(zhì)粒DNA和局部DNA組

39、成。 cosmid載體示意圖 質(zhì)粒局部含有大腸桿菌源質(zhì)粒復制起始位點、克隆位點和選擇標記基因等 基本構件，可以像質(zhì)粒載體一樣承載外源DNA片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細胞，并在其中自行復制和增殖。DNA局部允許重組DNA分子進展有效包裝和轉(zhuǎn)導受體細胞。但是由于cosmid載體不具噬菌體溶菌生長途徑，因此不產(chǎn)生子代噬菌體。 cosmid載體一般在10kb以下，能承載比較大40kb左右的外源DNA片段，被廣泛地用于構建基因組文庫。 二、植物病毒克隆載體 植物病毒種類繁多，已用于構建植物載體的有雙鏈DNA病毒花椰菜花斑病毒CaMV，單鏈DNA病毒番茄金黃花葉病毒(TGMV)、非洲木木薯花葉病毒(ACMV)

40、、玉米線條病毒(MSV)、小麥矮縮病毒(WDV)，以及大麥條紋花葉病毒(BSMV)、番茄叢矮病毒(TBSV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、煙草花葉病毒(TMV)等。 構建植物病毒克隆載體的 基本策略是對病毒DNA(包括RNA反轉(zhuǎn)錄的DNA)進展加工，消除其對植物的致病性，保存其通過轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染能迸入植物細胞的特性，使其攜帶的目的基因能導入植物細胞。由于植物病毒克隆載體的應用局限性比較大，因此植物病毒載體應用并不普遍。 利用CaMV感染植物后能啟動35SRNA轉(zhuǎn)錄的強啟動子，構建含35S啟動子的高效表達載體圖2-16，能啟動目的基因在植物細胞中進展高效的表達。 35S啟動子示意圖 三、動物病毒克隆載體

41、 由于動物轉(zhuǎn)基因不能應用質(zhì)粒克隆載體，因此動物病毒克隆載體在動物轉(zhuǎn)基因研究中起著更重要的作用。目前，用于構建克隆載體的動物病毒有痘苗病毒(poxvirus),腺病毒(adenovirus)、桿狀病毒(bacuovrus)、猿猴空泡病毒(simianvacuolatingvirus)和反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)等。 一、人工染色體載體 質(zhì)粒載體、病毒 (噬菌體) 克隆載體各具優(yōu)點，但它們能承載的外源DNA片段大小一般不超過50kb。顯然這些載體限制了對具有龐大和復雜功能的人和高等動植物基因組的研究。因此，伴隨構造基因組學和功能基因組學研究的開展，以及實施人類基因組方案和動植物基因組方案的

42、需要，能承載大片段DNA的人工染色體載體應運而生，并且開展迅速。人工染色體是指能在宿主細胞中穩(wěn)定地復制并準確傳遞給子細胞的人工構建的染色體。由于人工染色體能承載100kb以上的DNA大片段，因此又稱為大DNA片段克隆載體。目前已構建的人工染色體從其構造來分可分為兩類，即線形的人工染色體和環(huán)形的人工染色體。 線形的人工染色體如同真核生物的染色體一樣，必須含有染色體的構造元件端粒 (telomere)、著絲粒(centromere)和復制起始區(qū)(origin of replication) 。端粒對染色體DNA兩個末端起封口和保護作用。著絲粒負責染色體向子細胞的傳遞。復制起始區(qū)的功能是負責啟動染色

43、體的復制，使構建的人工染色體能在宿主細胞中穩(wěn)定地復制并準確傳遞給子細胞。屬于這一類的人工染色體有酵母菌人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC)、植物人工染色體plant artificial chromosome, PAC、人類人工染色體(human artificial chromosome, HAC) 和哺乳動物人工染色體(mammal artificial chromosome, MAC)等。 環(huán)形的人工染色體那么不需要端粒和著絲粒，但必須含有適宜的復制起始區(qū)，使構建的環(huán)形人工染色體能在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定地復制，并在細胞分裂過程中分配到子細胞中。屬于這一

44、類的人工染色體有細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)、源于噬菌體P1的人工染色體(P1 derived artificial chromosome, PAC)、雙元細菌人工染色體binary BAC, BI-BAC)、可轉(zhuǎn)化人工染色體(transformation competent artificial chromosome, TAC)。 不管是哪一類人工染色體，作為DNA片段克隆載體，還必須具備適宜的克隆位點和選擇標記基因等克隆載體必備的元件。 2、基因表達載體 作為基因表達載體，在構建的載體中除了一般克隆載體必備的構件外，在插入目的基

45、因的克隆位點上、下游，還應有供目的基因轉(zhuǎn)錄mRNA必備的啟動子和終止子，與目的基因在受體細胞內(nèi)的表達強弱密切相關。其中啟動子尤為重要，在構建表達載體時常用的啟動子有誘導啟動子和組織特異性啟動子，構建的載體相應稱為誘導型表達載體和組織特異性表達載體。 1誘導型表達載體 誘導型表達載體指載體中的啟動子必須在特殊的誘導條件下才有轉(zhuǎn)錄活性或較高轉(zhuǎn)錄活性的表達載體。外源基因處于這樣的啟動子下，必須在適宜的誘導條件下才能表達。采用這種表達載體獲得的轉(zhuǎn)基因生物便于人工控制，即使進入自然環(huán)境中，由于不存在適宜的誘導條件，不能表達外源基因產(chǎn)物，因此不易導致環(huán)境污染和影響生態(tài)系統(tǒng)的平衡。可以認為這是一類較安全酌基

46、因表達載體。并且鑒于誘導表達載體能人為地控制基因時空的表達，將為基因治療的臨床應用及根基研究提供良好的手段。目前用作誘導型的啟動子有二價金屬離子誘導啟動子、紅光誘導啟動子、熱誘導啟動子和干旱誘導啟動子，等等。 2組織特異性表達載體 在較高等的真核生物中，有一類特殊的啟動子只有在一定的組織中才能調(diào)控其下游的基因進展有效的表達。選用這樣的啟動子可以構建一系列組織特異性表達載體，為研究動植物發(fā)育和人類基因治療等提供有效的手段。目前，已構建的組織特異性表達載體有乳腺組織特異性表達載體、腫瘤細胞特異性表達載體、花藥特異性表達載體和種子特異性表達載體。 在基因工程設計和操作中，被用于基因重組、改變受體細胞

47、性狀和獲得預期表達產(chǎn)物的基因稱為目的基因。目的基因一般是構造基因，也就是能轉(zhuǎn)錄和翻譯出多肽 蛋白質(zhì)的基因。 一、目的基因的來源 目的基因主要來源于各種生物。真核生物染色體基因組，是獲得目的基因的主要來源。原核生物的染色體基因組也是目的基因來源的候選者。線粒體基因組、葉綠體基因組，以及質(zhì)?；蚪M和病毒 (噬菌體)基因組也可從中獲得有特殊需要的目的基因。此外，化學合成的DNA也是目的基因的來源之一。 二、別離目的基因的途徑 根據(jù)實驗需要，待別離的目的基因可能是一個基因編碼區(qū)，或者包含啟動子和終止子的功能基因；可能是一個完整的操縱子或由幾個功能基因、幾個操縱子聚集在一起的基因簇；也可能只是一個基因的

48、編碼序列，甚至是啟動子或終止子等元件。常采用的方法主要有酶切直接別離法、PCR擴增法、構建基因組文庫或cDNA文庫別離法、化學合成法等。 1利用限制性內(nèi)切核酸酶酶切法直接別離月的基因 為了獲得己克隆在載體中的目的基因，只要根據(jù)目的基因兩側(cè)的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶酶切，一次就可獲得目的基因，如圖2-17所示，用Bam HI和EcoRI酶切此質(zhì)粒，就可獲得目的基因。 圖2-17 用限制性內(nèi)切核酸酶法獲得目的基因示意圖 2利用PCR直接擴增目的基因 PCR擴增技術己廣泛地用于別離目的基因。如果知道目的基因的全序列或其兩側(cè)序列，可以通過合成一對與模板DNA互補的引物，十分有

49、效地擴增出含目的基因的DNA片段圖2-18。 圖2-18 PCR擴增目的基因示意圖 3通過構建基因組文庫和cDNA文庫別離目的基因 1基因組文庫 把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體儲存在一個受體菌克隆子群體中，這個群體即為這種生物的基因組文庫 (圖2-19)。假設這個群體中只儲存某種生物基因組的局部遺傳信息，那么稱為局部基因組文庫。 用于構建基因組文庫的克隆載體有噬菌體克隆載體、cosmid克隆載體、BAC克隆載體、BIBAC克隆載體、PAC克隆載體和YAC克隆載體等。 圖2-19 基因組文庫構建意圖 2cDNA文庫 某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與

50、克隆載體重組，儲存在一種受體菌克隆子群體之中，這樣的群體稱為cDNA文庫(圖2-20)。如果此群體中只儲存該基因組的局部cDNA，那么稱為局部cDNA文庫。cDNA文庫的一個克隆子包含一個基因的全部編碼序列，不含內(nèi)含子，也不含轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子的核苷酸序列。因此從cDNA文庫中獲得的目的基因在其兩側(cè)必須組裝上轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子等元件。用于構建cDNA文庫的載體有質(zhì)粒載體和噬菌體克隆載體。 圖2-20 cDNA文庫構建意義圖 3從基因組文庫或cDNA文庫中獲得目的基因 構建了某生物的基因組文庫或cDNA文庫，但是并不等于完成了目的基因的別離，因為文庫中終究哪一個克隆子含有需要的目的基因尚不得而知

51、。因此必須用適宜的方法從文庫中篩選別離出含有目的基因的特定克隆子。 根據(jù)目的基因核苷酸序列進展篩選別離 這是別離目的基因最直接的方法，根據(jù)目的基因的核苷酸序列制備核酸探針，對基因組文庫或cDNA文庫的一系列克隆子的DNA分子進展雜交，能雜交的克隆子就含有目的基因 (陽性克隆子)圖2-21。進一步對陽性克隆子重組DNA進展測序，與基因的核苷酸序列進展比較和鑒定，確定是否是待別離的目的基因。應用這種方法可以比較方便地獲得目的基因，但是獲得的基因一般不是新的基因。 圖2-21 利用核酸雜交鑒定目的基因 根據(jù)目的基因特異性表達進展別離 有的基因只有在某生物的一定的生長發(fā)育階段或一定的器官中才能表達，這

52、樣的基因可用此方法獲得。例如，待別離的目的基因只有在植物的根中才能有效表達，而在其他器官中如植物的葉不能表達，因此用根構建的cDNA文庫中含有攜帶目的基因cDNA的克隆子。根據(jù)這一性質(zhì)以根和葉的總mRNA (或它們的cDNA)為探針，分別對根構建的cDNA文庫進展雜交比較。用根的總mRNA (或它們的cDNA)制備的探針對cDNA文庫進展雜交時，所有克隆子都呈陽性反響；而用葉的總mRNA (或它們的cDNA) 制備的探針進展雜交時，根cDNA文庫中的某些克隆子呈陰性反響。最后比較2份雜交結(jié)果，便可以在根cDNA文庫轉(zhuǎn)膜的大量菌落中挑選出含目的基因的菌落圖2-22。將這種別離目的基因的方法稱為差

53、異雜交篩選法，這種方法也可用于別離受生長因子調(diào)節(jié)的基因及特殊處理誘導表達的基因。 圖2-22 差異雜交篩選示意圖 細胞。無論是原核生物細胞還是真核生物細胞都可作為受體細胞，但不是所有的細胞都可以作為受體細胞。選用受體細胞時應考慮以下幾點：便于外源DNA分子的導入，并在其內(nèi)能穩(wěn)定維持。便于克隆子轉(zhuǎn)化子的篩選。遺傳性穩(wěn)定，對遺傳密碼的應用上沒有明顯對遺傳密碼的應用上無明顯偏倚性，適于外源基因的高效表達、表達產(chǎn)物的分泌或積累；對于真核生物目的基因的高效表達，還應具有較好的翻譯后加工機制。易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長，具有較高的生產(chǎn)應用價值和理論研究價值。安全性高，不會對外界環(huán)境造成生物污染。 一、原核生物

54、細胞 原核生物細胞是較為理想的受體細胞圖2-5-1，其原因是：大局部原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的導入。沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，便于外源DNA與裸露的染色體DNA重組?；蚪M小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和葉綠體基因組，便于對引入的外源基因進展遺傳分析。原核生物多數(shù)為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。因此原核生物細胞普遍作為受體細胞用來構建基因組文庫和cDNA文庫，或者作為克隆載體的宿主菌，或者用來建設生產(chǎn)某種目的基因產(chǎn)物的工程菌。但是，以原核生物細胞來表達真核生物基因也存在一定的缺陷，很多未經(jīng)

55、修飾的真核生物基因往往不能在原核生物細胞內(nèi)表達出具有生物活性的功能蛋白。但是通過對真核生物基因進展適當?shù)男揎棧蛘卟捎胏DNA克隆等措施，原核生物細胞仍可用作表達真核生物基因的受體細胞。至今被用作受體細胞的原核生物主要是大腸桿菌Escherichiacoli。此外，乳酸菌(lacticacidbacterium)、枯草桿菌Bacillussubtilis、棒狀桿菌(corynebacterium)和藍細菌(cyanobacterium)等也被用作受體細胞。 圖2-5-1原核生物細胞模式圖 二、真核生物細胞 真核生物細胞具備真核生物基因表達調(diào)控和表達產(chǎn)物加工的機制，因此作為受體細胞表達真核生物基

56、因優(yōu)于原核生物細胞。真菌、植物和動物的細胞都被用作基因工程的受體細胞。 酵母菌屬于單細胞真菌，是外源真核生物基因理想的表達系統(tǒng)。酵母菌作為基因工程受體細胞，除了真核生物細胞共有的特性外，還具有以下優(yōu)點：基因構造相比照擬簡單，對其基因表達調(diào)控機制研究得比較清楚，便于基因工程操作。培養(yǎng)簡單，適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。外源基因表達產(chǎn)物能分泌到培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工。不產(chǎn)生毒素，是安全的受體細胞。 植物細胞作為基因工程受體細胞圖2-5-2，除了真核生物細胞共有的特性外，最突出的優(yōu)點就是其全能性，即一個別離的活細胞在適宜的培養(yǎng)條件下，比較容易再分化成植株，這意味著一個獲得外源基因的體細胞可以

57、培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株。缺乏之處是植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組DNA分子。但是采用農(nóng)桿菌介導法或用基因槍、電激儀處理等方法，同樣可使外源DNA進入植物細胞?，F(xiàn)在用作基因工程受體的植物有水稻、小麥、玉米、大豆、馬鈴薯、棉花、煙草和擬南芥等。 圖2-5-2植物細胞模式圖 動物細胞作為受體細胞圖2-5-3，同樣便于表達具有生物活性的外源真核生物基因產(chǎn)物。不過早期由于對動物的體細胞全能性的研究不夠深入，因此多采用生殖細胞、受精卵細胞或胚細胞作為基因工程的受體細胞，獲得了一些轉(zhuǎn)基因動物。近年來，由于對干細胞的深入研究和多種克隆動物的獲得，說明動物的體細胞同樣可以用作轉(zhuǎn)基因的受體細

58、胞。目前用作基因工程受體的動物有豬、羊、牛、魚、鼠、猴等。 圖2-5-3動物細胞模式圖 目前用于重組DNA分子導入受體細胞的方法很多，具體采用那一種方法，應根據(jù)選用的載體系統(tǒng)和受體細胞類型而定。 一、外源DNA轉(zhuǎn)化方法 通過生物學、物理學和化學等方法使外源裸露DNA分子引入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。如果引入受體細胞的是經(jīng)包裝處理帶有外源DNA分子的病毒或噬菌體顆粒，此過程稱為轉(zhuǎn)染(transfection)。下面介紹幾種比較常用的轉(zhuǎn)化方法。 1化合物誘導轉(zhuǎn)化法 用二價陽離子如Mg2+、Ca2+、Mn2+處理某些受體細胞可以使其成為感受

59、態(tài)細胞，即處于能攝取外源DNA分子的生理狀態(tài)的細胞。當外源DNA分子溶液同感受態(tài)細胞混合時，DNA分子便可進入細胞，到達轉(zhuǎn)化的目的。 有的動物細胞能捕獲粘附在細胞外表的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細胞。根據(jù)這一特性，先將待轉(zhuǎn)化的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，在強烈振蕩下緩慢參加緩沖液，形成DNA-磷酸鈣共沉淀復合物，然后用吸管將沉淀復合物參加到哺乳動物單層培養(yǎng)細胞的外表上，保溫幾小時后，可使外源DNA進入細胞。 外源DNA與某些多聚物和二價陽離子混合，再與受體細胞或原生質(zhì)體混合，也可使外源DNA進入細胞。常用的多聚物有聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等，

60、尤以PEG應用最廣，可用于原核生物細胞、動物細胞和植物原生質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)化。 2根癌農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 含有Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌與一些植物的細胞接觸后，Ti質(zhì)粒的一局部(T-DNA)導入植物細胞，整合到植物基因組DNA，隨基因組DNA的復制而復制圖2-5-4。根據(jù)這一特性構建了一系列Ti質(zhì)粒載體，與含目的基因的DNA片段重組，導人根癌農(nóng)桿菌，再采用葉盤轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體共墻養(yǎng)法和懸浮細胞共培養(yǎng)法，通過根癌農(nóng)桿菌介導進入植物細胞。用根癌農(nóng)桿菌介導法己獲得了一些轉(zhuǎn)基因植物，但是通過此方法轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因單子葉植物比較困難。 圖2-5-4 根癌農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化 3微彈轟擊轉(zhuǎn)化法 微