實驗方法總結(jié)

1、Trizol 法提取 RNA：操作步驟：（在液氮中碾磨組織至粉末狀，加入2ml Trizol,搖勻2min，分裝出1ml至A-2ml 管中，-80C保存）1、室溫靜置10min,若凍融樣品，則不需靜置。4C預冷離心機。取冰一盒。2、去脂肪：加 600p l 氯仿（CHC13），手動搖勻 2min，冰浴 5min； 13000rpm，4C,15min 離心。3、去DNA:取上清至B-2m1離心管，加500p 1 （一般與水等體積）酸性酚氯仿（取液時槍 頭插到水相液面以下），手動搖勻2min，冰浴5min； 4C,13000rpm，10min離心。4、取上清至C-1.5m1管，加入500p 1異丙

2、醇（一般1m1Trizo1加0.5ml異丙醇）；若RNA 量少加2p 1糖原。上下顛倒，至混勻。（-20C過夜）。5、4C,13000rpm，10min 離心；倒掉上清。6、去鹽：加500p 1 75%冰乙醇（-20C最上層中保存），洗滌（RNA量大則需反復吹打，量 少則不用吹打）7、4C,13000rpm，5min離心；棄上清，室溫干燥2-5min。8、100p 1 RNA-free 水溶解。反轉(zhuǎn)錄：操作步驟：1、測RNA濃度Crna2、計算需加水的體積：12-勿4睥RNA3、加卬 l Oligo（dT）； 70C， 5min （PCR 儀中，13p l 體系）；立即冰浴 5min or m

3、oreReverse-transcriptionStep1 Stage1 70.0 5:30Stage2 42.0 60:00Stage3 75.0 10:00Step2 16.04、冰上配制Mix:（配時反復吹打混勻） TOC o 1-5 h z Buffer5p ldNTP(2.5mM)5plRT1plRNaseln卬l每管加12p l Mix，混勻，離心以確保無氣泡5、PCR儀：體系調(diào)至25p l，run，溫度高于70C時，跳過第一步，溫度降至42C時快速放 入樣品。PCR產(chǎn)物回收（Axygen）操作步驟：1、加2V的Buffer DE-B （當回收片段400bp時，加3V異丙醇）2、上

4、柱，12000g 離心 1min3、加 500p l Buffer W1，12000g 離心 30s4、加 700p l Buffer W2，12000g 離心 30s5、加 700p l Buffer W2，12000g 離心 1min6、空甩離心，12000g，1min7、換1.5ml管，在柱子中央加30p l Eluent，室溫1min，12000g離心1min （Eluent加熱至65 C能提高洗脫效率）瓊脂糖凝膠電泳： （SYBR-Green 染色）操作步驟：1、配膠：1%左右（0.2g瓊脂糖+20ml TAE）2、5p l樣品+0.5p lSYBR-Green,常溫避光靜置染色15

5、min3、加 卬 l loading Buffer （6*），混勻4、上樣跑膠，記錄樣品的位置普通PCR：操作步驟：提前將除酶以外相應試劑放入4。冰箱解凍1、計算用量（詳見“PCR計算”表格）。在記錄本列好用量。取冰一盒。2、 從4C冰箱拿出相應試劑放入冰盒中（ddH2O, Buffer, cDNA, dNTP, Primer）,注意濃 度，Buffer和酶要匹配。3、打開PCR儀并設(shè)定。4、鑷子取PCR管于小冰盒，標記，按順序配Mix,震蕩混勻；分裝至各管，并對應加入Primer。5、震蕩混勻，離心去氣泡，上樣，檢查管蓋是否蓋嚴，run （注意修改體系）。pcr2stage1: x194C

6、2:00Stage2: x3594C 0:2060 C72C0:30 （做定量引物的PCR時可調(diào)為20s）0:50（可調(diào)：每 1000bp 需 1min）Stage3: of 1 72C 5min配藥：淤 S-Methopreme:p =0.913g/cm3=913ug/ul MW=310.530ug/ul=1ul Methopreme （4C保存，液粘，慢吸）+30ul Acetome（丙酮，分析純，常溫保存）步驟：（1）計算，找齊樣品，取一盒冰（均在冰上操作）；（2）配制，點震，離心，包錫箔紙，一次性手套裝冰，放冰中拿至蟲房;（3）頭頸間注射。淤Precocene:1ul母液+8.29ul

7、 acetone （一般配10ul母液對應的即可）母液：7-Ethoxy-6-methoxy-2,2-dimethylchromene 99%（C H O ）每次現(xiàn)配，一次配的最多使用兩天；用于處理剛羽化的蟲子（in 12h）LB溶液和LB平板的配制：1、LB 溶液+Amp+ TOC o 1-5 h z NaCl3gTryptone3gYeast extract1.5gddH2O300mlAmp（10ng/ul）1.5ml2、LB溶液（復蘇用）NaClTryptone Yeast extractddH2O3g3g 1.5g 300ml3、LB平板（每100ml可倒56個平板）NaClTrypt

8、oneYeast extractddH2O agar Amp3g3g1.5g300ml4.5g1.5ml (10ng/ul)4、配制Amp溶液：Stock solution： 0.2g+2ml ddH2O=100mg/mlWork solution:稀釋為 10mg/ml連接及轉(zhuǎn)化：（pGM-T克隆試劑盒）連接：1、取載體冰上融化，分裝，每管15ml，標記為“pGM-T”；2、取PCR小管：按下述配比加入（單位：ul）反應體系Control反應體系Control10X2X目的PCR片段x-x-10X T4 DNA Ligation Buffer11-2X T4 DNA Rapid Ligati

9、on Buffer-55對照插入片段（700bp，50ng/ul）-1-1pGM-T 載體(約 50ng/ul)1111T4 DNA Ligase (3U/ul)1111無菌去離子水補至10ul10X： 2226C水浴 12h 或 16C過夜2X Rapid： 2226C,510min （小于 15min）3、放冰上（一部分用于下步實驗，一部分用于冰上存）轉(zhuǎn)化：1、取部分（5ul）連接產(chǎn)物加到50ul100ul （50ul） TOP10感受態(tài)細胞中（不超過10%），轉(zhuǎn) 動混勻，冰浴30min。（準備42C的水浴）。2、42C水浴90s （嚴格），立即冰浴23min。3、加 250500ul （300ul） LB （Amp-）培養(yǎng)基，150rpm， 37C， 45min 培養(yǎng)。4、3600rpm，離心90s，棄部分上清，留100ul涂板。5、 板上涂IPTG （40mg/ul） 20ul，X-Gal （40mg/ul）