乙肝病毒DNA的實(shí)驗室檢測精選課件

1、乙肝病毒DNA的實(shí)驗室檢測精選乙肝病毒DNA的實(shí)驗室檢測精選熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶（TaqDNA聚合酶）的作用，經(jīng)過高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個步驟在3個小時內(nèi)反復(fù)循環(huán)25-30次，把特定的DNA片段擴(kuò)增1000萬倍。 每個PCR體系含4種主要成分：含有待擴(kuò)增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）熒光定量PCR技術(shù)Polymerase chain reac 實(shí)時熒

2、光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號積累實(shí)時檢測整個PCR過程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。熒光定量PCR技術(shù) 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)PCR 反應(yīng)過程5533d.NTPsTaq 酶Primers5353535353535353反應(yīng)組分變 性535353535353PCR 反應(yīng)過程5533d.NTPsTaq 酶Pri延 伸53535353353TaqTaq55重 復(fù)退 火延 伸535353533535353535355335353循環(huán)24個拷貝循

3、環(huán)38個拷貝53535353535353535353533553535353535353535533535熒光定量PCR原理插入染料法 SYBR Green I雜交探針法(最常用) TaqMan熒光定量PCR原理插入染料法TaqMan探針5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反應(yīng)體系變 性535353535353Taql53RQProbe53RQTaqMan探針5533d.NTPsTaq酶Prim535353RQ退 火531. 鏈取代Taq3QR5533QTaqR52. 水 解3. 聚 合53QTaqR354. 檢測熒光533QTaqR5l535353RQ退

4、 火531. 鏈取代T乙肝病毒的感染乙肝病毒的感染乙肝病毒的感染 （一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志HBsAb：保護(hù)性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，一般不存在于血循環(huán)中HBcAb: 非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBeAg：HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo)HBeAb：有一定的保護(hù)作用，預(yù)后良好乙肝病毒的感染 （一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及乙肝病毒的感染（二） HBV-DNA與“兩對半”1. “兩對半” ：機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；2. “攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學(xué)指標(biāo)不能 反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。FQ-PCR：檢測的是HBV

5、本身的遺傳物質(zhì)DNA，是 病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。HBsAg()HBV-DNA() HBeAg ()HBV-DNA()3. 血清學(xué)指標(biāo)()不能排除HBV感染。乙肝病毒的感染（二） HBV-DNA與“兩對半”1. “乙肝病毒的感染5.HBeAg陽性標(biāo)本HBV DNA檢出率90左右 HBeAg與HBV DNA有著良好的相關(guān)性4. 也可能出現(xiàn)HBsAg()，HBV-DNA()。乙肝病毒的感染5.HBeAg陽性標(biāo)本HBV DNA檢出率90乙肝病毒的感染HBV DNAHBV DNA貫穿感染者的終生，是評價病毒復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)ALT正常增高或者波動正常增高或者波動免疫耐受期免疫清除期非活動或低（

6、非）復(fù)制期再活動期肝組織學(xué)無明顯異常, 或輕度炎癥纖維化中度或嚴(yán)重炎癥、纖維化快速進(jìn)展無炎癥或僅有輕度炎癥中度或嚴(yán)重炎癥、肝纖維化臨床診斷慢性HBV攜帶者HBeAg陽性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化非活動性HBsAg攜帶者HBeAg陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化乙肝病毒的感染HBV DNAALT正常增高或者波動正常增高或乙肝病毒的感染慢性HBV感染分期及相關(guān)實(shí)驗室檢測指標(biāo) 魯鳳民，莊輝，乙型肝炎實(shí)驗室診斷研究進(jìn)展 2009 乙肝病毒的感染慢性HBV感染分期及相關(guān)實(shí)驗室檢測指標(biāo) 魯鳳民HBV-DNA與臨床HBV-DNA與臨床HBV DNA檢測的臨床意義HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBV D

7、NA是HBV復(fù)制的標(biāo)志HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBV DNA對乙肝兩對半起補(bǔ)充作用HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)HBV DNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎HBV DNA檢測的臨床意義HBV DNA是HBV存在最直接PCR檢測“窗口期”核酸檢測縮短的“窗口期”的天數(shù)HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷提供直接證據(jù)縮短“窗口期”HBV DNA檢測的臨床意義PCR檢測“窗口期”核酸檢測縮短的“窗口期”的天數(shù)HBV5 調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽”的

8、病人HBV都無復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過檢測HBV DNA來決定。HBV DNA檢測的臨床意義 調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復(fù)制期，乙肝病毒DNA的實(shí)驗室檢測精選乙肝病毒DNA的實(shí)驗室檢測精選HBV DNA檢測的臨床意義HBsAg和HBeAg均陽性而HBV DNA陰性？干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制。PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對結(jié)合。病毒DNA整合于宿主肝細(xì)胞染色體而血中游離HBV DNA很少或缺乏。HBV DNA檢測的臨床意義HBsAg和HBeAg均陽性而H 目前尚無一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，最好的抗病毒藥物療效也僅能達(dá)到50左右。目前國際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類： 干擾素：重組人-1b干擾素、- 2a、 -2b干擾素等。 核苷類似物：拉米夫定