現(xiàn)代生物技術第七章基因克隆策略與轉基因技術

1、現(xiàn)代生物技術第七章基因克隆策略與轉基因技術第七章 基因克隆策略與轉基因技術一 基因克隆策略二 轉基因技術基因克隆和轉化技術是基因工程操作的主要組成部分，沒有克隆就無法開展基因工程，沒有簡單有效的轉化技術就難以實現(xiàn)外源基因的遺傳重組。隨著分子生物學技術和相關學科的發(fā)展，基因克隆和轉化的新技術、新方法不斷涌現(xiàn)。因此，有必要進一步了解這些技術方法的原理、操作和優(yōu)缺點及其對因材選法，提高基因克隆和轉基因效率的意義。 第一節(jié) 基因克隆策略一、一般克隆法(一)化學合成法一般方法是先將寡核苷酸激活，帶上5磷酸基團，然后再與相應的互補的寡核苷酸片段退火，形成帶有黏性末端的雙鏈寡核苷酸片段。把這些雙鏈寡核苷酸片

2、段混合在一個試管中，加上T4DNA連接酶，使它們彼此連接組裝成一個完整的基因或基因的一個片段。這些組裝的產(chǎn)物被插入到適當?shù)妮d體上，并轉化大腸桿菌寄主細胞。最后DNA序列分析所組裝的基因。應用這種基因組裝法，已經(jīng)克隆出了多種基因，其中包括分子量較大的干擾素和組織纖溶酶原激活因子(tpA)等多個基因。 (一)化學合成法化學合成法關鍵是：最好在基因兩個末端設有不同酶切位點，以便與載體進行有方向性的連接。合成的片段應該經(jīng)過適當純化，一般以PAGE或HPLC純化較好，因為合成過程中有些片段不完整，必須除去。片段5端不宜過長，因為越長，成本越高，產(chǎn)量越低，而且出現(xiàn)錯誤的幾率越大。連接時，應每四個兩兩互補片

3、斷一同連接，然后每兩組相連，最后和載體連接。轉化克隆后，必須分析序列，予以確證。（二）DNA基因文庫 1原理 通過一系列的酶促反應，使總Ploy(A)mRNA轉變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當?shù)妮d體分子，然后再轉化到大腸桿菌寄主菌株的細胞內(nèi)，如此便構成了包含著所有基因編碼序列的cDNA基因文庫(complement DNA gene library)。廣泛使用的一種方法是，先用逆轉錄酶合成一條cDNA鏈，經(jīng)堿降解作用，再用大腸桿菌DNA聚合酶I合成第二條鏈，最后用單鏈特性S1核酸酶消化掉cDNA單鏈部分，形成雙鏈的cDNA，與載體連接后，轉化宿主細胞，產(chǎn)生千萬個克隆，即為cDNA文庫。2不同

4、豐度mRNA的cDNA克隆 在許多組織和細胞中，各種mRNA的含量都是極不相同的。其中，有些類型的mRNA含量十分豐富，每個細胞可擁有數(shù)干個拷貝，而有些類型的mRNA每個細胞只有少數(shù)幾個拷貝。 對于稀少mRNA，可以通過蔗糖梯度離心及變性條件下的凝膠電泳，分離以后富集。也可以根據(jù)已知核酸序列，合成互補的核苷酸序列，在Ploy(A)RNA的逆轉錄反應中，這些寡核苷酸序列可以作為引物，合成cDNA并建成文庫。如果合成的寡核苷酸有足夠的長度(1440個核苷酸)，還可直接作為探針，從cDNA基因文庫中篩選含有目的基因序列的克隆。 3cDNA克隆特點cDNA克隆以mRNA為起始材料，這對于有些RNA病毒

5、，例如流感病毒，cDNA克隆就成為一種惟一可行的方法。cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行，一個完全的cDNA基因所含的克隆數(shù)，要比一個完全的基因組文庫所含的克隆數(shù)少得多。理論所必需的最低克隆數(shù)，約為1.7105個克隆。如果某一特定的基因克隆，目的在于獲得一種特殊的真核蛋白質產(chǎn)物，涉及它的蛋白質的檢測，則必須用cDNA庫法。在已知基因組DNA序列酌情況下，通過同cDNA序列的比較，還可以確定出內(nèi)含子和外顯子之間的界線。另外，cDNA片段小，序列分析方便。在發(fā)育過程中時間調節(jié)基因表達特征的分析，以及組織特異性基因表達特性的分析，都要使用cDNA克隆。鑒定出在某種類型細胞中存在，而在同種類型細胞不同

6、處理中又不存在的mDNA分子的cDNA克隆，如差異顯示等。用cDNA文庫制成表達芯片很容易進行基因表達分析。 (三)基因組文庫基因組文庫是指由來自染色體DNA的全部DNA片段組成的基因文庫。理論上，在一個完整的基因組文庫中，生物體的每一個基因都有一個克隆。 構建基因組文庫的第一步是，從目的生物體中制備基因組DNA，根據(jù)建庫所用載體容量大小制備適宜的DNA片段。應注意的是，分離的DNA片段最小應為載體容量的2倍以上。構建基因組文庫的第二步是，在體外將這些DNA片段同適當?shù)妮d體連接，形成重組體分子，轉化大腸桿菌細胞，經(jīng)過生長擴增之后，組成了一個重組體克隆庫，此即是基因組文庫。一個構建理想的文庫，應

7、該對任何一個已知基因均可從文庫中篩選出來。關于基因組文庫的幾個要點：使用任何一種擴增的基因文庫時，同一重組體群體中所有的成員都不是等速地增殖。插入的外源DNA在大小及序列上的差異，將影響到重組載體的復制速率。這樣，當一個基因文庫經(jīng)過了擴增之后，某些特定的重組體的比例就可能增加，而有些重組體的比例則可能下降，甚至會丟失。用已知探針篩選出陽性克隆，并不一定是單一的完整的目的基因。由于DNA片段是隨機的，可能酶切到基因的一部分；或者基因很大，載體容量不夠，很可能被漏掉；或者靶基因兩端有一些其他序列，尤其是大容量載體庫，更容易產(chǎn)生此結果。如果需要得到基因完整的序列，必須用基因組文庫方能達到，有利于價究

8、內(nèi)含子、啟動子和調控序列結構和功能。理論上講，除少數(shù)基因外，一個基因組含有不同基因數(shù)量相等，即獲取的機會相同。保留了基因組文庫相當于保存了整個基因組，對于瀕臨滅絕的生物或許是延續(xù)物種的一種辦法。(四)PCR技術聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)，即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA的方法，故又稱為基因的體外擴增法。二、功能克隆法(一)雙抗體法早期人們克隆目的基因采用一種雙抗體技術。由于抗體的特異性，它只對特種抗原產(chǎn)生反應，可以用已知蛋白質免疫制造特異性抗體。用此抗體與特定細胞的胞質進行反應。因為細胞中不斷在核糖體與mRNA復合體上翻譯出長短不一的

9、靶蛋白，這些蛋白與復合體一起與特異性抗體產(chǎn)生反應，結合在一起。然后再用抗體與它們反應，生成更大的顆粒。通過超速離心即能使其從細胞質中分離出來。最后用蛋白酶降解蛋白質，可以得到特異的mRNA，以01igodT為引物，逆轉錄合成cDNA經(jīng)克隆即可得到目的基因。(二)反向生物學法原理 已知蛋白質序列可以根據(jù)它的密碼組成，合成出寡聚核苷酸探針，再從DNA文庫中分離出目的基因克隆。另外，自然界中有一些蛋白質的核苷酸編碼序列，在其進化的過程中保持著高度的保守性，這樣就使核酸的種間雜交成為可能。(三)表達文庫法將cDYA克隆在表達載體上，再導入大腸桿菌構成cDNA表達文庫。然后通過對蛋白質產(chǎn)物的鑒定，分離克

10、隆真核目的基因。用于構建表達文庫的載體，可以是質粒載體，也可以是從噬菌體載體發(fā)展而來的原核表達載體。表達的蛋白質以融合蛋白質形式合成，不易被原核細胞中的有關的蛋白酶消化降解，可以得到較高的表達水平。三、表性克隆法 (一)差異雜交差異雜交又叫差異篩選。它特別適用于分離在特定組織中或發(fā)育的特定階段表達的基因以及受生長因子調節(jié)的基因，亦可有效地分離經(jīng)特殊處理誘導表達的基因。1差異雜交原理 差異雜交的技術只需要擁有兩種不同的細胞群體，在一個細胞群體中目的基因正常表達，在另一個細胞群體中目的基因不表達。這樣兩種不同細胞群體的DNA提取物中，一個群體含有一定比例的目的基因DNA。另一個群體不含有。因此，以

11、這兩種總mRNA(或是它們的cDNA拷貝)為探針，分別對由表達目的基因的細胞群體構建的cDNA文庫進行篩選。當以目的基因表達的DNA群體為探針時，所有包含著重組體的菌落都呈陽性反應；而以目的基因不表達的DNA群體為探針時，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽性反應。比較這兩種結果并對照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落。2差異雜交技術的局限性 差異雜交的靈敏度比較低，特別是對于那些低豐度的mRNA。這是因為在差異雜交中所使用的雜交探針，僅有極少的一部分能與目的基因核苷酸序列完全互補，所以那些低豐度的DNA很難用此法檢測出來。另外，差異雜交需要篩選大量的雜交膜，鑒定大量的噬菌斑，因此

12、十分耗時費力。（二）衰減雜交技術衰減雜交原理 衰減雜交的本質是除去那些共同存在的cDNA序列，使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高分離的敏感性。從表達目的基因的組織(記作)提取mRNA逆轉錄為cDNA，然后與無目的基因表達的組織(記作)提取的mRNA做過量雜交，在組織與組織中均表達的基因產(chǎn)物形成cDNA mRNA雙鏈雜交分子，而特異mRNA逆轉錄的cDNA仍保持單鏈狀態(tài)，將此種雜交混合物通過羥基磷灰石柱，DNADNA雜交分子便結合在柱上，而游離的單鏈cDNA則過柱流出。(三)差異顯示技術差異顯示技術可以從一對細胞群體或一對基因型各自產(chǎn)生的約15萬種mRNA中，有效地鑒定并分離出差異表達

13、的基因。差異顯示技術的原理 其原理是以一類與mRNA的plyA結合的寡核苷酸序列作為錨定引物，進行逆轉錄，形成mRNADNA雜交分子。再加入另一短的隨機序列l(wèi)0聚體作為引物，進行PCR反應，然后用聚丙烯酰胺凝膠顯示擴增片段。（四）代表性差異分析技術代表性差異分析技術原理 試驗對象(tester,T)和供試探針(driver，D)在接受差異分析前，均用一種識別4堿基序列的限制性內(nèi)切酶做切割處理，形成平均長度為256bp的DNA片段代表群，保證絕大多數(shù)遺傳信息能被PCR擴增。第一次T與D雜交反應時兩者總量比為1100，第二次增加到1400，第三次則為180000，T群體相非特異性序列幾乎沒有偶然逃

14、脫的可能。另外，T減D反應后僅設置了72復性與延伸和95變性這兩個參數(shù)，共20個循環(huán)，從而使PCR產(chǎn)物的特異性及所得的探針純度均大為提高。四、插入分離法此類技術多用于植物基因分離。當一段特定的DNA序列插入到植物基因組中目的基因的內(nèi)部或其鄰近位點時，使會誘發(fā)該基因發(fā)生突變，并最終導致表型變化，形成突變體植株。用此DNA作為雜交的分子探針，從突變體植株的基因組DNA文庫中篩選到突變的基因。而后再利用此突變基因作探針，就能從野生型植株的基因組DNA文庫中克隆到野生型的目的基因。這樣插入的DNA序列相當于在植物基因上貼了一張標簽，因此DNA插入突變分離基因的技術，又叫做DNA標簽法。主要包括轉座子標

15、簽法和TDNA標簽法兩種類型。第二節(jié) 轉基因技術動物轉基因技術植物轉基因技術微生物轉基因技術報告基因和選擇標記一、動物轉基因技術將外源DNA導入哺乳動物細胞的方法原則上可大致分為三類：生物方法、物理學方法和化學方法。在化學方法中最常用的有磷酸鈣沉淀法、DEAE葡聚糖轉化法和脂質體轉化法。在物理方法中，有電穿孔法，還有其他用于較為特殊的情況下的方法，如基因槍轟擊法、受體介導的基因導入法等。在生物方法中，目前主要是把病毒作為外源DNA導入的工具，通過病毒感染將外源DNA導入細胞中。這種方法的優(yōu)點在于它具有較高的轉化效率，并能在一定的條件下實現(xiàn)對特定細胞的靶向性，目前主要用于基因治療的研究中。一、動

16、物轉基因技術根據(jù)不同的實驗目的，外源DNA導入哺乳動物細胞又可分為瞬時轉化和穩(wěn)定轉化。瞬時轉化一般是外源DNA導入細胞14d后收獲轉化細胞，對轉化基因的轉錄和復制進行分析。穩(wěn)定轉化則需要使外源基因整合于細胞染色體，從而得到穩(wěn)定的轉化細胞株。一、動物轉基因技術 1磷酸鈣沉淀法 如果核酸和磷酸鈣以共沉淀物顆粒形式存在，細胞將顯著增加其攝取核酸的能力，這一現(xiàn)象是磷酸鈣轉化方法的基礎。磷酸鈣轉化中要用較高濃度的DNA(1050g)。一、動物轉基因技術 2DEAE葡聚糖轉化法本方法簡單，重復性好，適用于瞬時表達。在DEAE葡聚糖轉化中，加入的細胞數(shù)量、DNA濃度及DEAE葡聚糖的濃度，對于優(yōu)化轉化效率是

17、最為重要的。 3脂質體介導的轉化 一般認為，DNA上帶負電的磷酸基團與脂質體上的正電荷結合，然后脂質體上剩余的正電荷與細胞膜上的唾液酸殘基的負電荷結合，然后通過二者的融合將DNA導入細胞。 4電穿孔轉化法 電穿孔方法是應用高壓電場在細胞上穿孔，將DNA導入細胞，DNA通過所穿的孔而擴散進入細胞中，然后細胞恢復正常功能，從而使導人基因得到表達。這項技術不依賴細胞的特性，所以可用于幾乎所有類型的細胞。 5基因槍轟擊法 是將外源基因DNA導入植物細胞及哺乳動物細胞的方法。 基本的操作方法是：在真空狀態(tài)下，利用粒子加速器將外面包裹了外源基因DNA的金顆粒打入完整的細胞中，使外源基因DNA得以在靶細胞中

18、穩(wěn)定轉化并有可能獲得表達。金顆粒直徑的大小取決于靶細胞直徑的大小。在通常情況下，顆粒直徑為1.0m時可獲得成功和穩(wěn)定的轉化。金顆粒的形狀和直徑的大小非常均勻，且毒性很低。其缺點主要就是價格相對昂貴，金顆粒DNA的包裹效率相對不穩(wěn)定。6受體介導的基因導入法 受體介導的基因導入法主要應用于基因治療的研究。 外源基因導入體內(nèi)的方式可分成兩類：間接體內(nèi)方式和直接體內(nèi)方式。間接體內(nèi)方式是從供體分離出細胞，在體外轉染外源基因，經(jīng)選擇和培養(yǎng)后返輸回供體內(nèi)。受體介導的基因導入法的基本原理，是基于人工合成的已知受體配基與多聚陽離子(一般是多聚賴氨酸或陽離子表面活性劑)偶聯(lián)形成的連接物，既能通過電性作用結合并濃縮

19、DNA分子成為可溶性顆粒狀物質，又不失去與細胞膜受體結合的功能，因而能通過配體/受體介導的內(nèi)吞作用，將此復合物導入細胞。其中很少一部分DNA從內(nèi)吞小體逸出，并進入細胞核實現(xiàn)功能基因的表達。一、動物轉基因技術 7顯微注射技術 應用玻璃顯微注射器，可以把重組DNA直接注射到哺乳動物細胞的細胞質或細胞核。通常根據(jù)DNA注射的不同方式，可以把顯微注射區(qū)分為(真正的)顯微注射和穿刺兩種。真正的顯微注射是由注射針直接將重組DNA注入細胞，而穿刺的重組DNA處在細胞周圍培養(yǎng)基中，然后隨穿刺形成的小孔進入細胞內(nèi)部。一、動物轉基因技術 8精子載體介導法 精子載體介導法是利用一定的方法先將外源基因附著在精子上，然

20、后通過受精過程將外源基因帶入卵子中。目前由于對精子載體介導法的作用機制尚缺乏了解，對其可靠性仍有爭議，限制了此方法的廣泛使用。隨著該方法的不斷完善，將有可能成為一種簡單有效的轉基因技術。一、動物轉基因技術 9胚胎干細胞介導法 胚胎干細胞介導法是利用轉化技術，將外源基因導入未分化的全能性胚胎干細胞中，外源基因通過同源重組整合到細胞染色體基因組特定的位點上，然后將其注入囊胚腔中，發(fā)育成攜帶有外源基因的動物個體。該方法的最大特點是外源基因能根據(jù)需要定位整合到細胞染色體基因組的特定位置上，為研究某種基因在動物發(fā)育過程中的作用及定點突變提供了一個強有力的手段。該方法的另外一個特點是整合率高達50，但所形

21、成的轉基因動物是嵌合體。這種動物體內(nèi)一部分組織或器官含有外源基因，只有外源基因整合到生殖細胞中，下一代才可形成轉基因動物。一、動物轉基因技術 10哺乳動物細胞基因打靶 基因打靶技術，通過在轉染細胞中發(fā)生的外源打靶基因與核基因組目標基因之間的DNA同源重組，能夠使外源基因定點地整合到核基因組的特定位置上，從而達到改變細胞遺傳特性的目的。 基因打靶的分子基礎是，兩條具有同樣或類似核苷酸序列的同源DN分A子之間發(fā)生的遺傳信息的重組事件。這也就是說，基因打靶的一個基本條件是，在外源打靶基因與內(nèi)源核基因組目標基因之間，必須存在一段適當長度的同源的DNA序列。二、植物轉基因技術 (一)植物基因轉化受體系統(tǒng) 植物基因轉化受體系統(tǒng)應具備如下條件：再生能力。用于植物基因轉化的外植體，必須易于再生，有很高的再生頻率，并且具有良好的穩(wěn)定性和重復性。遺傳穩(wěn)定性。植物受體系統(tǒng)接受外源DNA后應不影響其分裂和分化，并能穩(wěn)定地將外源基因遺傳給后代，保持遺傳的穩(wěn)定性，盡量減少變異。外植體來源?；蜣D化的頻率很低，需要多次反復地實驗，所以就需要大量的外植體材料。轉化的外植體一般采用無菌實生苗的子葉、胚鈾、幼葉等，或采用可進行快速繁殖的材料。對選擇條件敏感