生化論文淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1、淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的研究姓名：學(xué)院： 班級(jí)： 學(xué)號(hào)： 2011 年 12月摘要：淀粉酶是水解淀粉的糖苷鍵的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，按照其水解淀粉的作用方式，可以分成-淀粉酶，-淀粉酶等。-淀粉酶和-淀粉酶是其中最主要的兩種。-淀粉酶存在于休眠的種子中，而-淀粉酶是在種子萌發(fā)過(guò)程中形成的，淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3,5-二硝基水楊酸試劑測(cè)定，麥芽糖能將3,5-二硝基水楊酸還原成硝基氨基酸的顯色基團(tuán)，其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時(shí)間內(nèi)生成麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。酶的最適溫度在四十度左右，低于或高于這個(gè)溫度酶的活性都有所降低。酶的最適PH在5.6左右，低于或高于

2、該P(yáng)H都會(huì)降低酶的活性；氯化鈉使酶的活性增強(qiáng)，是酶活性的激活劑；硫酸銅使酶的活性有所降低是酶活性的抑制劑。引言：淀粉是植物最主要的儲(chǔ)藏多糖，也是人和動(dòng)物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉經(jīng)淀粉酶水解后生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質(zhì)而被機(jī)體利用。淀粉酶主要包括-淀粉酶和-淀粉酶。其中-淀粉酶是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的酶制劑之一。目前, - 淀粉酶已廣泛應(yīng)用于變性淀粉及淀粉糖、焙烤工業(yè)、啤酒釀造、酒精工業(yè)、發(fā)酵以及紡織等許多行業(yè)。本實(shí)驗(yàn)以小麥為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)小麥淀粉酶活性和酶學(xué)性質(zhì)作了研究：淀粉酶活力的測(cè)定：1.1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹参镏械牡矸勖改軐①A藏的淀粉水解成麥芽糖。淀粉酶幾乎存在于所有植物中，其中

3、以禾谷類(lèi)種子的淀粉酶活性最強(qiáng)。植物中有淀粉酶和淀粉酶，其活性因植物的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期不同而有所變化。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)掌握淀粉酶的提取和測(cè)定方法。1.2、原理 淀粉酶和淀粉酶，各有其一定的特性，如淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化，而淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下則發(fā)生鈍化。通常提取液中同時(shí)有兩種淀粉酶存在，測(cè)定時(shí)，可根據(jù)它們的特性分別加以處理，鈍化其中之一，即可測(cè)出另一酶的活性。將提取液加熱到70維持15 min以鈍化淀粉酶，便可測(cè)定淀粉酶的活性?；蛘邔⑻崛∫河胮H3.6之醋酸在0加以處理，鈍化淀粉酶，以求出淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3，5二硝基水楊酸試劑測(cè)定。由于麥芽糖能將后者還原生成3

4、氨基5硝基水楊酸的顯色基團(tuán)，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與糖的濃度成正比，故可求出麥芽糖的含量。以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。1.3、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備 1.3.1實(shí)驗(yàn)材料 萌發(fā)的小麥（芽長(zhǎng)1 cm左右）。 1.3.2實(shí)驗(yàn)試劑1. 1淀粉：稱(chēng)取1.0g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH 5.6的檸檬酸緩沖液中。2. 0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液：A液：稱(chēng)取檸檬酸20.01 g，溶解后稀釋至l000 mL；B液：稱(chēng)取檸檬酸鈉29.41 g，溶解后稀釋至1000 mL。取A液55 mL與B液145 mL混勻，即為pH5.6之緩沖液。3. 3, 5二硝

5、基水楊酸溶液：精確稱(chēng)取3, 5二硝基水楊酸1 g溶于20 mL 2 mol/L氫氧化鈉中，加入50 mL蒸餾水，再加入30 g酒石酸鉀鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100 mL，蓋緊瓶塞，勿使二氧化碳進(jìn)入。4. 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液：稱(chēng)取麥芽糖0.100 g溶于少量蒸餾水中，仔細(xì)移入100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。 1.3.3實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備 小臺(tái)秤，研缽，容量瓶100 mL，具塞刻度試管，試管，刻度吸管l mL2 mL10 mL，離心機(jī)，恒溫水浴，分光光度計(jì)，具塞刻度管1.4、實(shí)驗(yàn)步驟 1.4.1 酶液的提取稱(chēng)取1.0 g萌發(fā)的小麥種子，置研缽中加2 mL蒸餾水和少量石英砂，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心

6、管中，用7mL蒸餾水分次將殘?jiān)慈腚x心管，提取液在室溫下放置提取1520 min，每隔數(shù)分鐘攪動(dòng)1次使其充分提取。然后在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，將上清液倒入50mL容量瓶中加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液。吸取上速淀粉酶原液5mL，放入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度搖勻，即為淀粉酶稀釋液。 1.4.2麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取6支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按下表加入試劑：表 制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線配方表管號(hào)123456麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液/ml00.40.81.21.62.0蒸餾水/ml2.01.61.20.80.40麥芽糖含量/mg00.40.81.21.62.03,5-二硝基

7、水楊酸 /ml2.02.02.02.02.02.0搖勻，置于沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄：麥芽糖含量00.40.81.21.62光密度值00.0720.1190.1590.2170.278根據(jù)以上數(shù)據(jù)，以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并顯示趨勢(shì)線方程及R。要求R0.99.如圖可知R=0.99390.99 所以結(jié)果有效，繪制的圖形符合要求。1.4.3 酶活力的測(cè)定取6支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按下表進(jìn)行操作。表 酶活力的

8、測(cè)定配方表操作項(xiàng)目-淀粉酶活力測(cè)定 總酶活力測(cè)定 = 1 * ROMAN I-1 = 1 * ROMAN I-2 = 1 * Arabic 1-3 = 1 * ROMAN I-4 = 2 * ROMAN II-1 = 2 * ROMAN II-2 = 2 * ROMAN II-3 = 2 * ROMAN II-4淀粉酶原液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 0 0 0 0鈍化-淀粉酶 置70水浴15min，冷卻淀粉酶稀釋液/ml 0 0 0 0 1.0 1.0 1.0 1.0預(yù)保溫將各試管和淀粉溶液置于40恒溫水浴中保溫10minPH5.6緩沖液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.

9、0 1.0 1.0 1.00.4mol/LNaOH 4.0 0 0 0 4.0 0 0 01%淀粉溶液/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0保溫 在40恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5min0.4mol/LNaOH 0 4.0 4.0 4.0 0 4.0 4.0 4.0搖勻，置于水浴中煮沸5 min,取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。搖勻，在540nm波長(zhǎng)下比色，記錄光密度值，從麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出麥芽糖含量，用以表示酶活性。1.5 結(jié)果計(jì)算( +)淀粉酶共同水解淀粉所計(jì)錄的結(jié)果如下： = 2 * ROMAN II-1 = 2 * ROMAN II-2 = 2 * R

10、OMAN II-3 = 2 * ROMAN II-40.0170.193 0.1750.194由記錄的結(jié)果查表得B=1.3468 B=0.0706( +) 淀粉酶活性【麥芽糖質(zhì)量（mg）/鮮重（g）*5min】 =（1.3468-0.0706）*8*25*50/(2.00*2) =3190.51.6 實(shí)驗(yàn)討論1.活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)的總體設(shè)計(jì)思路是什么？實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵你認(rèn)為是什么？為什么？答：本實(shí)驗(yàn)的總體設(shè)計(jì)思路是在最適p H、溫度等條件下測(cè)定-及-淀粉酶的作用產(chǎn)物麥芽糖的生成速度來(lái)表征酶的催化能力。首先應(yīng)注意材料萌發(fā)種子的提取液中本身就會(huì)含有麥芽糖，這部分麥芽糖需用“對(duì)照管”來(lái)精確排除所有非指定測(cè)定

11、時(shí)間段內(nèi)的待測(cè)產(chǎn)物。同時(shí)如何使其中一種酶失活而不影響另一種酶的活性，來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定每種酶的活性，也是需要考慮的內(nèi)容之一。2.-淀粉酶活性測(cè)定時(shí)70水浴為何要嚴(yán)格保溫15分鐘？保溫后為何要立即于冰浴中驟冷？答：-淀粉酶的耐熱程度同樣有限，15min既保證了-淀粉酶最大程度鈍化，有保證了-淀粉酶活性不受損傷；立即冷卻是阻止-淀粉酶的復(fù)性。3.眾多測(cè)定淀粉酶活力的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中一般均采取鈍化-淀粉酶的活力而測(cè)-淀粉酶和測(cè)總酶活力的策略，為何不采取鈍化-淀粉酶活力去測(cè)-淀粉酶活力呢？這種設(shè)計(jì)思路說(shuō)明什么？答：熱鈍化-淀粉酶是體系外加熱然后驟冷，繼續(xù)-淀粉酶的測(cè)定。而不耐酸的-淀粉酶的鈍化必須在體系內(nèi)進(jìn)行，后續(xù)

12、測(cè)定如調(diào)節(jié)pH至5.6，-淀粉酶將會(huì)復(fù)性，不調(diào)節(jié)pH值，-淀粉酶的測(cè)定又缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性，所以雖然理論上可行，但實(shí)際中操作性很差；這種設(shè)計(jì)思路說(shuō)明了理論上的可行性與實(shí)際中的可操作性之前是需要權(quán)衡的，只有可操作性強(qiáng)，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度才越高。4.我們所測(cè)定得到的總酶活力減去所測(cè)定得到的-淀粉酶活力是否就等于-淀粉酶活力？為什么？你的結(jié)論說(shuō)明什么？答：不等于，-及-淀粉酶的作用位點(diǎn)不用，活力不是簡(jiǎn)單的加和，在生命活動(dòng)中，-和-淀粉酶會(huì)產(chǎn)生酶的協(xié)同作用，協(xié)同作用所產(chǎn)生的活力，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于二者單獨(dú)作用的活5.-淀粉酶活性測(cè)定時(shí)70水浴為何要嚴(yán)格保溫15分鐘？保溫后為何要立即于冰浴中驟冷？答：-淀粉酶的耐熱程度同

13、樣有限，15min既保證了-淀粉酶最大程度鈍化，有保證了-淀粉酶活性不受損傷；立即冷卻是阻止-淀粉酶的復(fù)性。6.pH5.6緩沖液的作用？各管于40水浴準(zhǔn)確保溫10分鐘的作用？答：pH5.6是本實(shí)驗(yàn)條件下酶的最適pH環(huán)境；反應(yīng)開(kāi)始前準(zhǔn)確保溫10min是保證達(dá)到反應(yīng)最適溫度而又不會(huì)因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而使酶失活。2 淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解酶促反應(yīng)條件對(duì)淀粉酶活性的影響2.2實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶水解產(chǎn)物遇碘呈現(xiàn)不同顏色，不同濃度，不同PH和激活劑、抑制劑對(duì)淀粉酶活性影響程度不同，故可由酶反應(yīng)產(chǎn)物遇碘呈現(xiàn)的顏色判斷上述諸因素對(duì)酶活性的影響。2.3主要試劑檸檬酸緩沖液 NaCL溶液 （0.3） NaSO

14、4溶液（0.3）碘液 CuSO4(0.3) 淀粉溶液（1.0）2.4實(shí)驗(yàn)步驟2.4.1淀粉酶液的提取稱(chēng)取2g萌發(fā)3d的小麥種子(芽長(zhǎng)約1cm)，置于研缽中，加少量石英砂和2ml蒸餾水，研磨勻漿。將勻漿倒入刻度試管中，定容至25ml.提取液在室溫下放置提取15-20min, 每隔數(shù)分鐘攪動(dòng)一次，使其充分提取。然后在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心，將上清液倒入一個(gè)干凈的試管中，即為淀粉酶液。2.2 溫度對(duì)淀粉酶活性的影響為了探究酶的最適溫度，本實(shí)驗(yàn)在pH為5.6時(shí)，設(shè)置了四個(gè)溫度：4、常溫（約20）、40、90四個(gè)溫度進(jìn)行探究。具體操作及加的各試劑的劑量如下表： 編號(hào)項(xiàng)目 AaBbCcDdEe緩沖液

15、（PH5.6）1-1-1-1-1-淀粉酶溶液/ml2.5-2.5-2.5-2.5-2.5-淀粉酶提取液/ml-1-1-1-1-1預(yù)保溫/10min4室溫40沸水浴沸水浴混合A倒入aB倒入bC倒入cD倒入dE倒入e酶促反應(yīng)(10min)4室溫40沸水浴沸水浴碘液各3滴（冷卻至室溫）低溫時(shí)，酶的活性低，但不失活，隨著溫度升高，酶的活性逐漸升高，達(dá)到一定溫度后，酶的活性有逐漸降低。最后用碘檢驗(yàn)酶活性時(shí)，得到如下結(jié)果：(由左到右依次是酶在4、常溫、40，沸水浴條件下碘顯色）顏色分別為：紫色、淺紅銅色、基本無(wú)色、深藍(lán)色。4時(shí)，酶反應(yīng)混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色較深，呈紫色，說(shuō)明此刻蛋白質(zhì)被催化反應(yīng)的量較少，此溫

16、度下酶活性不高室溫時(shí)，酶反應(yīng)混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色較淺，呈淺紅銅色，說(shuō)明室溫下蛋白質(zhì)被催化而反應(yīng)的量很多，酶的活性較高40時(shí)，酶反應(yīng)混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色很淺，幾乎無(wú)色，說(shuō)明該溫度下蛋白質(zhì)幾乎全部被催化反應(yīng)，酶的活性很高沸水溫度，酶反應(yīng)混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色很深，呈深藍(lán)色，說(shuō)明該溫度下蛋白質(zhì)幾乎沒(méi)有被催化反應(yīng)，酶的活性很低2.3 pH對(duì)淀粉酶活性的影響pH也是影響酶活性的主要因素之一。淀粉酶在40時(shí)，分別設(shè)置pH為3.6、5.6、8.0。具體的操作步驟如下表所示: 編號(hào)項(xiàng)目 IIIIII緩沖液/mL2(PH3.0)2(PH5.6)2(PH8.0)淀粉溶液/mL各2.5淀粉酶提取液/mL各1酶促反應(yīng)搖

17、勻，40水浴10min碘液各3滴實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：（由左到右是PH為3.6、5.6、8.0時(shí)酶作用的碘顯色）顏色分別為：銅紅色、淺黃色、深藍(lán)紫色。PH3.6時(shí)，酶反應(yīng)混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色很淺，呈銅紅色，說(shuō)明室溫下蛋白質(zhì)被催化而反應(yīng)的量很多，酶的活性較高PH5.6時(shí)，酶反應(yīng)混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色很淺，呈淺黃色，說(shuō)明該溫度下蛋白質(zhì)幾乎全部被催化反應(yīng)，酶的活性很高PH8.0時(shí)，酶反應(yīng)混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色較深，呈深藍(lán)紫色，說(shuō)明此刻蛋白質(zhì)被催化反應(yīng)的量較少，此溫度下酶活性不高2.4激活劑和抑制劑對(duì)淀粉酶活性的影響有的試劑對(duì)能夠加速酶的催化作用，而月有的卻相反。本實(shí)驗(yàn)分別以NaCl、CuSO4研究試劑對(duì)淀粉酶活

18、性的影響。 編號(hào) 項(xiàng)目1234緩沖液PH5.6/ml各2NaCl/ml1-GuSO4/ml-1-Na2SO4/ml-1-淀粉溶液/ml各2.5淀粉酶提取液/ml各1酶促反應(yīng)(10min)搖勻，40水浴10min碘液各3滴實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：(由左到右分別是加NaCl、CuSO4、H2O后酶產(chǎn)物的碘顯色)顏色分別為：無(wú)色、淺藍(lán)色、淺黃色。加入氯化鈉，酶反應(yīng)混合物遇碘呈現(xiàn)顏色，呈無(wú)色，說(shuō)明加入氯化鈉對(duì)酶活性起到一定的促進(jìn)作用加入硫酸銅，酶反應(yīng)混合物遇碘呈現(xiàn)淺藍(lán)色，說(shuō)明有蛋白質(zhì)殘余，加入硫酸銅對(duì)酶活性起到一定的抑制作用加入等量的水做空白組，酶反應(yīng)混合物遇碘呈現(xiàn)淡黃色，說(shuō)明仍有少量蛋白質(zhì)殘余，對(duì)比更顯出氯化

19、鈉的激活劑作用，硫酸銅的抑制劑作用實(shí)驗(yàn)結(jié)論與分析 實(shí)驗(yàn)中，學(xué)習(xí)和掌握了測(cè)定淀粉酶活力的原理和性質(zhì)，并且了解了酶活性主要的幾個(gè)影響因素。淀粉總酶活力為3190.5（ mg/g. min）。酶的催化活性受溫度的影響很大。在本實(shí)驗(yàn)中溫度為40時(shí)，表現(xiàn)最好，基本都將淀粉水解了。因此，確定酶的最適溫度為40。但實(shí)際上，用此法確定酶的最適溫度不夠精確。淀粉酶其本質(zhì)是蛋白質(zhì)，淀粉酶受溫度影響，在低溫時(shí)反應(yīng)較慢，隨著溫度的升高，酶的活性也隨之加快，當(dāng)達(dá)到最是溫度時(shí)，酶反應(yīng)速度達(dá)到最快，以后又隨著溫度升高而逐漸減慢，以至完全停止。這是兩個(gè)不同的過(guò)程。在低溫時(shí)，酶的活性雖然低，但是酶依然有活性，是可逆過(guò)程。當(dāng)經(jīng)高

20、溫后，酶由于結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，是不可逆過(guò)程。在測(cè)量一種酶的活性時(shí)，通常是在最適溫度下進(jìn)行的。然而，一種酶的最適溫度也不是完全固定的，它與作用時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)。因此，要確定酶的最適溫度，需要多次測(cè)量。酶的活性受pH的影響尤為顯著。pH過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響酶的活性，并且影響都是不可逆的。本實(shí)驗(yàn)條件下，pH為5.6時(shí)淀粉酶的活性表現(xiàn)的最好。通常情況下- 淀粉酶的最適作用pH 一般在2 到12 之間變化。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置pH變化范圍較大，不能較準(zhǔn)確的測(cè)定出- 淀粉酶的最適pH。另外, 溫度和鈣離子對(duì)一些- 淀粉酶的最適pH 有一定的影響, 會(huì)改變其最適作用范圍。酶的活性往往還受到激活劑和抑制劑的影響。大多數(shù)激活劑

21、和抑制劑都不能改變淀粉酶的性質(zhì)。抑制劑多與酶的活性中心、外必須基團(tuán)結(jié)合，從而引起抑制作用。而除去抑制劑時(shí)酶的活性又能夠還原。抑制劑有多種，包括許多金屬離子化合物（Ca、Hg、Ag等）和EDTA。在- 淀粉酶中至少包含一個(gè)Ca, Ca使酶分子保持適當(dāng)?shù)臉?gòu)象, 從而維持其最大的活性和穩(wěn)定性。Ca對(duì)- 淀粉酶的親和能力比其它離子強(qiáng), 其結(jié)合鈣的數(shù)量1到10之間。結(jié)晶高峰淀粉酶A( TAA) 包含10 個(gè)Ca, 但只有一個(gè)結(jié)合很牢固。通常況下結(jié)合一個(gè)Ca就足以使- 淀粉酶很穩(wěn)定。用EDTA 透析或者用電滲析可以將Ca從淀粉酶中除去, 加入Ca可以激活鈣游離酶。用Sr2+ 和Mg2+代替TAA中的Ca, 在Sr和Mg過(guò)量的情況下也能使其結(jié)晶。另外，激活劑能夠參與酶活性中心構(gòu)成或與酶及底物結(jié)合或生成復(fù)合物而引起促進(jìn)