實驗一光學(xué)顯微鏡微量吸管及改良牛鮑計數(shù)板使用

1、關(guān)于實驗一光學(xué)顯微鏡微量吸管及改良牛鮑計數(shù)板使用第1頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三一、光學(xué)顯微鏡使用與維護第2頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三【目的】 掌握顯微鏡的操作規(guī)程；了解光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)及原理；了解顯微鏡的保養(yǎng)方法。第3頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三（一）顯微鏡的結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡（以下簡稱為顯微鏡），是用來觀察肉眼看不見的微小生物結(jié)構(gòu)的。雖然電子顯微鏡已經(jīng)問世，但是，在目前一般的科學(xué)研究和教學(xué)中，顯微鏡仍然是重要的、較為精密的生物觀察儀器。為了正確操作、妥善保管和維護顯微鏡，使之延長使用年限，作為生物學(xué)工作者，必

2、須了解顯微鏡的結(jié)構(gòu)和功能。第4頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三機械部分1鏡筒是一個金屬長筒，筒口上端安裝目鏡鏡 頭，下端裝有鏡頭轉(zhuǎn)換器和物鏡鏡頭。2鏡頭轉(zhuǎn)換器是安裝在鏡簡下端的一個旋轉(zhuǎn)圓盤。鏡頭轉(zhuǎn)換器上有3-5 個孔，分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。3粗準焦螺旋位于鏡臂的下方，可以轉(zhuǎn)動，以便使載物臺能上下移動，從而調(diào)節(jié)焦距。4細準焦螺旋位于粗準焦螺旋外方，它的移動范圍較粗準焦螺旋小，可以細調(diào)焦距。5鏡座位于鏡臂下方，用以穩(wěn)固和支持鏡身。第5頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三 5鏡座位于鏡臂下方，用以穩(wěn)固和支持鏡身。6.鏡臂上接鏡筒，下連載物臺，呈弓曲形

3、。為顯微鏡上的手握之處。7載物臺是放置玻片的平臺。其中央具有通光孔，載物臺上有金屬夾片夾，是用來卡住載玻片的夾子，轉(zhuǎn)動左、右移動尺螺旋還可使切片在載物臺上移動。第6頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三光學(xué)部分 1目鏡是插在鏡筒頂部的鏡頭，是由一組透鏡組成的，它可以使物鏡成倍地分辨、放大物像，例如 5、10、15和20。2物鏡安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體清晰地放大。物鏡上刻有放大倍數(shù)，例如 （4、10、25、40、100）等。顯微鏡的放大倍數(shù)是目鏡倍數(shù)乘以物鏡的倍數(shù)。3底光源位于底座上，開關(guān)位于底座側(cè)方。光線的強度可以調(diào)節(jié)。第7頁，共40頁，202

4、2年，5月20日，22點7分，星期三 4在鏡柱前有一個聚光器調(diào)節(jié)螺旋，它可以使聚光器升降，用以調(diào)節(jié)光線的強弱，下降時明亮度降低，上升時明亮度加強。5虹彩光圈又稱可變光闌，由多數(shù)金屬片組成，在較高級顯微鏡上具有此裝置。使用時移動其把柄，可控制聚光器透鏡的通光范圍，用以調(diào)節(jié)光的強度。虹彩光圈下常附有金屬圈，其上裝有濾光片，可調(diào)節(jié)光源的色調(diào)。第8頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三第9頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三一、使用方法1觀察前的準備（1）置顯微鏡于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約為一寸左右。鏡檢者姿勢要端正，一般用左眼觀察，右眼便于繪圖或記錄，

5、兩眼必須同時睜開，以減少疲勞，亦可練習左右眼均能觀察。（2）顯微鏡是光學(xué)精密儀器，在使用時要特別小心，使用前要熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能，檢查各總零件是否完好無損。鏡身有無灰塵，鏡頭是否清潔，做好必要的清潔和調(diào)整工作。 （3）調(diào)節(jié)光源對光時應(yīng)避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置和鏡頭，并刺激眼睛。晴天可直接用窗外的散射光，如明暗天氣，可用830W日光燈或顯微鏡燈照明 第10頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三調(diào)節(jié)光源及光照的一般步驟： 將低倍物鏡旋至鏡筒下方，旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)輪，使鏡頭和載物臺距離約為0.5cm左右。上升聚光器，使與載物臺表面同樣高。否則使用油鏡時光線

6、較暗。左眼看目鏡，調(diào)節(jié)反光鏡鏡面角度（反光鏡有凹平兩面，光線較強自然光源，宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源，宜用凹面鏡。）對光使全視野內(nèi)為均勻的明亮度。凡檢查染色標本時，光線應(yīng)強；檢查未染色標本時，光線不宜太強。可通過擴大或縮小光圈、升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)節(jié)光線第11頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三2低倍鏡觀察。 檢查的標本須先用低信鏡觀察，因為低倍鏡視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標和確定檢查的位置。（1）先將標本玻片置于載物臺上，并將標本部位處于物鏡的正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)輪，下降物鏡或上升載物臺使物鏡至標本0.5cm處。（2）左眼看目鏡，同時反時針方向慢慢旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)輪，當

7、在視野內(nèi)出現(xiàn)物象后，改用細調(diào)節(jié)輪，上下微微轉(zhuǎn)動，直至視野內(nèi)獲得清晰的物象。然后認真觀察標本各部位，確定并將需進一步要觀察的部位移視野中央，準備用高倍鏡觀察。第12頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三3高倍鏡觀察； 將高倍鏡轉(zhuǎn)正至正下方，在轉(zhuǎn)換接物鏡時，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后由接目鏡觀察，再仔細調(diào)節(jié)光圈和聚光鏡，使光線的明亮度適宜，同時再仔細正反兩方向微轉(zhuǎn)動細調(diào)節(jié)輪，直至獲得清晰的物象后為止，找到最適宜于觀察的部位。需進一步要觀察的部位移視野中央，準備用油鏡觀察。第13頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三4油鏡觀察：（1）上升聚光器，

8、全開虹彩光圈（2）用粗調(diào)節(jié)輪提起鏡筒或下降載物臺，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒正下方。在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。右手順時針方向慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)輪使鏡筒下降或載物臺上升，與此同時，從顯微鏡的側(cè)面觀察使油鏡浸入油中，直到幾乎與標本接觸時為止。注意不要壓到標本，以免壓碎玻片，甚至損壞油鏡頭。（3）從接目鏡內(nèi)觀察，進一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)輪將鏡筒徐徐上升或?qū)⑤d物臺徐徐下降，直到視野內(nèi)出現(xiàn)物像為止，然后用細調(diào)節(jié)輪校正焦距。如油鏡已離開油面而仍未見物象，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物象看清為止。第14頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三換片 觀察完一個標本

9、后，如果想要再觀察另一標本時，需先將高倍物鏡（或油竟鏡）轉(zhuǎn)回到低倍物鏡，取出標本，按放片的方法換上新片，即可觀察。千萬不可在高倍物鏡（或油竟鏡）下?lián)Q片，以防損壞鏡頭。第15頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三二、顯微鏡的保養(yǎng) 第16頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三（1）油鏡使用完畢，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再取一張擦鏡紙，滴上少量的二甲苯擦拭，然后再取另一張新擦鏡紙將鏡頭上殘留的二甲苯擦凈。否則粘固透鏡的膠質(zhì)會被二甲苯溶解，日久鏡片易移位脫落。（2）下降聚光器，打開虹彩光圈，使反光鏡垂直于鏡座，以免積聚灰塵。（3）用綢布將鏡身擦拭干凈（切不可用手擦

10、拭），除去灰塵、油污、水汽，以免生銹長霉。第17頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三（4）使顯微鏡的各部件恢復(fù)回原位，下降鏡筒，使物鏡呈“八”字形置于載物臺上，然后將顯微鏡送回鏡箱中。（5）顯微鏡應(yīng)存放在干燥陰涼的地方，不要放在強烈的日光下暴曬，霉雨季節(jié)應(yīng)在顯微鏡箱內(nèi)放置干燥劑（硅膠），如長時間不用，則光學(xué)部分應(yīng)卸下放在干燥器中，以免受潮生霉。（6）顯微鏡應(yīng)嚴禁與揮發(fā)性藥品或腐蝕性藥品放在一起，如碘片、鹽酸、硫酸等藥品。第18頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三三、注意事項 第19頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三1拿取顯微鏡必須一

11、只手拿著鏡臂，一只手托著鏡座，并保持鏡身的上下垂直，應(yīng)避免震動，輕放臺上。切不可一只手提起，以防顯微鏡、反光鏡功目鏡墜落。2使用前應(yīng)將鏡身擦拭一遍、用擦鏡紙將鏡頭擦凈（切不可用手指擦抹）。若遇到鏡臺或鏡頭上有干香柏油，可用擦鏡紙沾取少量二甲苯將其擦去。3使用時如發(fā)現(xiàn)顯微鏡操作不靈活或有損壞，不要擅自拆卸修理，應(yīng)立即報告指導(dǎo)教師處理。第20頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三 4注意保護鏡頭，切不可壓碎標本被片，損壞鏡頭 5顯微鏡使用完畢，應(yīng)登記顯微鏡使用卡經(jīng)指導(dǎo)教師檢查后放回鏡箱。第21頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三二、微量吸管使用第22頁，共40

12、頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三（一）目的、原理、實驗用品、標本1、目的：掌握微量吸管的實驗方法。2、原理：擠壓乳膠頭使微量吸管產(chǎn)生負壓而吸取液體。3、實驗用品：一次性微量吸管、帶孔乳膠吸頭、試管、2ml吸管、NS等。4、標本：新鮮抗凝血第23頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三（二）操作方法1、準備吸管 將帶孔的乳膠吸頭套在微量吸管上，連接處應(yīng)嚴密不漏氣。2、加稀釋液 取試管1支，加生理鹽水2ml.3、持管吸血 右手拇指和中指夾住吸管及吸頭交接處，示指蓋住吸頭小孔，三個指頭輕微用力，排出適量的氣體使管內(nèi)形成較小的負壓，將管尖插入抗凝血，三個指頭慢慢松勁，吸取

13、抗凝血到所需刻度后，抬起示指，注意管尖始終不要離開液面，以免吸入氣泡，也不要過度用力將血液吸入乳膠吸頭。第24頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三 4、拭凈余血 用干棉球順微量吸管口拭凈余血。 5、稀釋血液 將微量吸管插入含生理鹽水的試管底部，慢慢排出吸管內(nèi)的血液，再用上清液沖洗管內(nèi)余血2-3次。 6、洗滌吸管 依次用蒸餾水洗凈，95%乙醇脫水。乙醚干燥。如為一次性微量吸管，可省略該步驟。第25頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三（三）注意事項1、操作步驟3需反復(fù)練習才能準確吸取血液到所需量。2、一次吸取血液到所需的量，吸管內(nèi)不能有空節(jié)也不能吸取血液過多

14、，最好不要超過所需刻度的2mm.3、稀釋血液前一定要拭凈管外余血，釋放血液時的動作不能太劇烈，避免破壞血液成分或不能利用上清液將管內(nèi)血液洗凈。第26頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三（四）實驗評價 微量吸管使用是手工法血細胞分析的第 一步，有很多因素影響檢驗結(jié)果的準確性和精確度，如一次性吸管的質(zhì)量、操作者的技術(shù)熟練程度和責任心等。第27頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三三、改良牛鮑計數(shù)板的使用（一）目的：掌握改良牛鮑計數(shù)板結(jié)構(gòu)及使用方法。（二）原理：一定倍數(shù)稀釋的血液或體液混勻后滴入具有固定體積和精密劃分刻度的改良牛鮑計數(shù)板中，在顯微鏡下對所選擇的區(qū)

15、域中的細胞進行計數(shù)，在乘以稀釋倍數(shù)，即可換算成單位體積內(nèi)的細胞數(shù)。第28頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三（三）、實驗用品1、器材 改良牛鮑計數(shù)板、專用蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、綢布、微量吸管、帶孔乳膠吸頭、刻度吸管、試管。2、試劑 紅細胞稀釋液（四）標本：抗凝血第29頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三五、操作1、稀釋血液 取試管1支，加紅細胞稀釋液2ml,加抗凝血10微升，立即混勻，制成紅細胞懸液。2、準備計數(shù)板 用綢布拭凈改良牛鮑計數(shù)板和專業(yè)蓋玻片，采用推式法從計數(shù)板下緣向前平推蓋玻片，將其蓋在計數(shù)池上。3、沖池 用完了吸管吸取制備好的再次混勻的紅細胞

16、懸液，沿蓋玻片與計數(shù)板之間的縫隙沖入計數(shù)池。充液量以恰好充滿一側(cè)計數(shù)池為宜，不可過多、過少或有氣泡，否則需重新操作。第30頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三 4、靜置 紅細胞懸液注入計數(shù)池后，靜置 2-3分鐘待細胞下沉。 5、顯微鏡計數(shù) 首先在低倍鏡下觀察整個計數(shù)池的結(jié)構(gòu)，同時觀察細胞分布是否均勻，如嚴重不均應(yīng)重新沖池。根據(jù)計數(shù)不同的血細胞選用不同的放大倍數(shù)。計數(shù)時應(yīng)遵循一定的路徑進行，以免重復(fù)或遺漏。對壓線細胞，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則進行計數(shù)。 第31頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三附：牛鮑計數(shù)板基本結(jié)構(gòu) 血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載

17、玻片，載玻片上有四個槽構(gòu)成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各刻有一小方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分九個大方格，中央的一大方格作為計數(shù)用，稱為計數(shù)區(qū)。計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為16個中方格（大方格用三線隔開），而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個中方格（中方格之間用雙線分開），而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點，即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。 計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為lmm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3。第32頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三1855 年 發(fā)明計數(shù)紅細胞的計數(shù)板 血細胞計數(shù)板法是最可靠和最經(jīng)典計數(shù)技術(shù)改良Neubauer計數(shù)板第33頁，共40頁，2022年，5月20日，22點7分，星期三第34頁，共40頁，2022年，