液相串聯(lián)質(zhì)譜法在生物樣品分析中的幾個關(guān)鍵問題

1、LC/MS/MS在生物樣品分析時的關(guān)鍵問題2022年10月2日 簡介 LC/ESI-MS/MS是近10年來發(fā)展成熟的分析技術(shù)，它集高效液相色譜的高分離性能與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性的優(yōu)點于一體，已成為定量測定生物樣品中藥物及其代謝產(chǎn)物的最強有力分析手段。 然而，它在分析生物樣品過程中也碰到了具有挑戰(zhàn)性的問題基質(zhì)效應(yīng)，對于以人參皂苷為代表的中性、熱不穩(wěn)定、難于離子化的皂苷類化合物來說，基質(zhì)效應(yīng)的影響更為嚴(yán)重。 離子抑制效應(yīng)不僅影響檢測的靈敏度，也影響定量的準(zhǔn)確性，因為這種抑制效應(yīng)在不同個體的相同生物基質(zhì)間、甚至同一個生物樣品在不同的色譜保留時間可能均不一樣，這樣就會使測試結(jié)果的準(zhǔn)確性受到嚴(yán)重影響

2、。 吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年10月2日基線 1234567891011Time, min20%40%60%80%100%Intensity, cps吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年10月2日血漿樣品經(jīng)液液萃取處理得到的譜圖 Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年10月2日Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%血漿樣品經(jīng)SPE處理得到的譜圖 吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年10月2日尿樣

3、經(jīng)液液萃取處理得到的譜圖 Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年10月2日Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%尿樣經(jīng)2次水洗后的液液萃取處理得到的譜圖 吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年10月2日吉林大學(xué)藥物代謝研究中心考察基質(zhì)效應(yīng)方法柱后補償技術(shù)（Post-column addition/infusion, PCA/PCI）補償標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以空白基質(zhì)提取物進樣測定-位置、強度標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣；等量的

4、標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白基質(zhì)提取物中進樣；二者峰面積比較液相系統(tǒng)色譜柱質(zhì)譜三通閥注射泵2022年10月2日基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生原因外源雜質(zhì)的引入（不同廠家生產(chǎn)的試管、肝素鋰）生物樣品內(nèi)源性基質(zhì)共洗脫作用co-elution生物樣品與分析物形成新的化合物柱超載作用(column overload)吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年10月2日吉林大學(xué)藥物代謝研究中心影響檢測的靈敏度1影響定量的準(zhǔn)確性2基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果2022年10月2日Key Point 2選擇合適的內(nèi)標(biāo)提高待測物的離子化效率、降低基質(zhì)效應(yīng)Key Point 1關(guān)鍵問題提高LC/MS/MS的工作效率Key Point 3吉林大學(xué)藥物代謝研究中心20

5、22年10月2日提高離子化效率 1、改進霧化效果 產(chǎn)生更多更小的液滴，提高離子/分子轉(zhuǎn)化比。 2 、模式選擇及優(yōu)化措施 酸性化合物流動相中加鹽,如甲酸銨、乙酸銨，或堿（氨水）來增強化合物的離子化，一般采用負(fù)離子檢測模式。 堿性化合物流動相中加酸以增強化合物的離子化,加甲酸的效果可能要好于醋酸和三氟乙酸。酸根負(fù)離子會與樣品正離子結(jié)合降低離子化效率，且三氟乙酸會明顯的抑制質(zhì)譜信號響應(yīng)，一般用正離子方式檢測。 3、慎重選擇添加劑 商品化的LC-MS級醋酸銨、甲酸銨含有表面活性劑，抑制電離。實驗中若需要，可以用氨水加酸調(diào)節(jié)而成。 吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年10月2日 4、優(yōu)化儀器參數(shù)（DP、C

6、E、IS等） 5、鹽類對離子信號的影響 一般小分子鹽的摩爾濃度比較高時，在電噴霧系統(tǒng)中有強烈的競爭性離子化作用，導(dǎo)致較強的離子抑制效應(yīng)，使得待測物的靈敏度明顯降低。 其次，鹽類的存在將產(chǎn)生一系列的離子加合峰，使得譜圖的解析變復(fù)雜。此外，太多的鹽類會腐蝕和污染質(zhì)譜系統(tǒng)硬件，嚴(yán)重時導(dǎo)致硬件損壞，需要及時清洗。 高濃度的鹽對電噴霧有明顯負(fù)作用，微量鹽可能有助于某些物質(zhì)的靈敏度提高。一些不揮發(fā)鹽，如磷酸鹽、氯化鈉等，對質(zhì)譜造成不可逆損傷。高鹽類樣品，進樣前一般要進行脫鹽處理。6、控制進樣濃度及上樣量 色譜柱、質(zhì)譜超載 吉林大學(xué)藥物代謝研究中心進樣濃度大上樣量大2022年10月2日吉林大學(xué)藥物代謝研究中

7、心Mass Spectrometry Reviews, 2001, 20, 362 3872022年10月2日消除/減小基質(zhì)的途徑吉林大學(xué)藥物代謝研究中心樣品處理液相條件選擇質(zhì)譜條件選擇2022年10月2日Protein-precipitationLiquid-liquid partitioning(extraction) Solid Phase extractionOff-line/On-line 2-Dimension LC(column back-flushing)吉林大學(xué)藥物代謝研究中心樣品前處理方法 選擇合適的樣品前處理方法是消除基質(zhì)效應(yīng)影響最有效的的方式，對于不同的樣品處理方法，基

8、質(zhì)對每種組分的影響也不同，要通過實驗綜合其他參數(shù)（提取回收率，提取穩(wěn)定性，定量限等）來確定樣品前處理方法。2022年10月2日柱子的選擇 填料的性質(zhì)、大小、柱長、柱子口徑流動相的選擇 組成、比例、流速、緩沖鹽、信號增強劑、pH值；洗脫方式的選擇（等梯度、梯度）；柱后補償 堿性藥物丙酸、異丙醇；酸性藥物2-（2-methoxyethoxy)ethanol。吉林大學(xué)藥物代謝研究中心優(yōu)化液相色譜條件 適當(dāng)?shù)卦黾哟郎y組分的保留時間；減少進樣體積2022年10月2日離子源（ESI、APCI）選擇：總的趨勢 ESI較APCI更易受基質(zhì)效應(yīng)的影響。檢測方式（負(fù)離子、正離子掃描方式）吉林大學(xué)藥物代謝研究中心優(yōu)化質(zhì)譜檢測條件2022年10月2日吉林大學(xué)藥物代謝研究中心雙內(nèi)標(biāo)法提高LC/MS/MS分析的準(zhǔn)確性20