雙熒光素酶檢測的原理和應(yīng)用

1、雙熒光素酶檢測的原理和應(yīng)用一、熒光素酶報告基因的檢測原理熒光素酶(Luciferase)是生物體內(nèi)催化熒光素(luciferin)或脂肪醛firefly aldehyde)氧化發(fā)光的一類酶的總稱，來自于自 然界能夠發(fā)光的生物。自然界存在的熒光素酶來自螢火蟲、發(fā)光細(xì)菌、發(fā)光海星、發(fā)光節(jié)蟲、發(fā)光魚、發(fā)光甲蟲等。細(xì)菌熒光素酶對熱敏感，因此在 哺乳細(xì)胞的應(yīng)用中受到限制。目前，以北美螢火蟲蟲(Photinus pyralis)來源的熒光素酶基因應(yīng)用的最為廣泛，該基因可編碼 550個氨基酸的熒光素酶蛋白，是一個61kDa的單體酶，無需表達(dá)后修飾，直接具有完全酶活。發(fā)光機制生物熒光實質(zhì)是一種化學(xué)熒光。螢火蟲

2、熒光素酶在Mg2+、ATP、02的參與下，催化D2熒光素(D2luciferin)氧化脫羧，產(chǎn)生激 活態(tài)的氧化熒光素，并放出光子，產(chǎn)生550580 nm的熒光，其化學(xué)反應(yīng)式如下。這種無需激發(fā)光就可發(fā)出偏紅色的生物熒光，其組織穿透能力明顯強于綠色熒光蛋白(GFP)。熒光素酶是靠酶和底物的相互反應(yīng) 發(fā)光，特異性很強，靈敏度高，由于沒有激發(fā)光的非特異性干擾，信噪比也比較高。二、熒光素酶報告基因的檢測流程1、重組質(zhì)粒制備：制備含有待檢測基因-Luc/Rluc的重組質(zhì)粒；2、細(xì)胞系選擇：根據(jù)實驗需要選擇細(xì)胞株，通常選擇轉(zhuǎn)染效率較高的293T細(xì)胞或原代細(xì)胞等；3、共轉(zhuǎn)染：將帶有Luc/Rluc標(biāo)記的報告基

3、因和目的基因進行共轉(zhuǎn)染，設(shè)置不同的檢測時間點，一般為24h/48h；4、外界干預(yù)：轉(zhuǎn)染后，可進行物理/化學(xué)/病毒等的相應(yīng)刺激；5、細(xì)胞處理：采用進口/國產(chǎn)雙熒光素酶檢測試劑盒依照protocol操作；6、熒光檢測：使用GENios Pro酶標(biāo)儀或具有類似檢測功能的設(shè)備進行熒光強度檢測。三、熒光素酶報告基因的優(yōu)點1、優(yōu)越的靈敏度，比Westernbloting靈敏度高1000倍以上；2、內(nèi)源性低，哺乳動物無內(nèi)源性表達(dá)；3、熒光素酶檢測不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)影響；4、發(fā)光檢測，檢測方便；5、靈敏度高，10-20摩爾熒光素酶分子；6、檢測范圍廣，大于7個數(shù)量級。雙熒光素酶檢測結(jié)果示例四、主要應(yīng)用領(lǐng)域1、

4、潛在啟動子/啟動子核心區(qū)域檢測；2、潛在增強子/抑制子等調(diào)控子核心元件檢測；3、啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點檢測；4、啟動子/增強子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用；5、病毒/細(xì)胞相互作用；6、藥物等化學(xué)誘導(dǎo)因素對啟動子活性的調(diào)節(jié)(抑制或增強)；7、射線等物理誘導(dǎo)因素對啟動子活性的調(diào)節(jié)(抑制或增強)。五、熒光素酶報告基因檢測方法與Western-Blot檢測方法在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控機制研究中的區(qū)別1、熒光素酶報告基因檢測是測定上游刺激對下游靶基因在轉(zhuǎn)錄水平的影響，即對靶基因mRNA表達(dá)水平的影響，可以通過實時 熒光定量PCR來驗證；Western blot是測定上游刺激對下游靶基因?qū)?yīng)的蛋白表達(dá)水平的

5、影響，特別是磷酸化程度的改變。因 此，兩方面的實驗結(jié)果可以結(jié)合起來更細(xì)致、更全面地揭示細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的分子機制。2、熒光素酶報告基因檢測方法操作過程相對簡單，檢測靈敏度較高；Western blotting操作過程繁瑣，檢測靈敏度較低。3、熒光素酶報告基因檢測只需要成功將含有目標(biāo)DNA序列插入到報告載體中，即可進行后續(xù)實驗，Western blotting則需要購 買商品化的一抗，一般價高量少，且抗體的雜交條件需要摸索；若自制的一抗，抗體效價需要驗證，實驗周期較長。六、參考文獻(xiàn)Pan, Y., R. Geng, N. Zhou, G. F. Zheng, H. Zhao, J. Wang,

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