鯉魚(yú)克隆及二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析

1、 HYPERLINK ./ HYPERLINK ./ 更多資料請(qǐng)請(qǐng)?jiān)L問(wèn).HYPERLINK E:還還未拷貝貝企企業(yè)管理理管管理知識(shí)識(shí)(htttp:.)(.) HYPERLINK ./ 更多企業(yè)學(xué)學(xué)院： HYPERLINK ./Shop/ ./SShopp/中小企業(yè)業(yè)管理全全能版183套講講座+8897000份資料 HYPERLINK ./Shop/40.shtml ./Shhop/40.shttml總經(jīng)理、高高層管理理49套講座座+1663888份資料 HYPERLINK ./Shop/38.shtml ./Shhop/38.shttml中層管理理學(xué)院46套講座座+60020份份資料 HYPE

2、RLINK ./Shop/39.shtml ./Shhop/39.shttml國(guó)學(xué)智慧慧、易經(jīng)經(jīng)46套講座座 HYPERLINK ./Shop/41.shtml ./Shhop/41.shttml人力資源源學(xué)院56套講座座+2771233份資料 HYPERLINK ./Shop/44.shtml ./Shhop/44.shttml各階段員員工培訓(xùn)訓(xùn)學(xué)院77套講座座+ 3324份份資料 HYPERLINK ./Shop/49.shtml ./Shhop/49.shttml員工管理理企業(yè)學(xué)學(xué)院67套講座座+ 887200份資料 HYPERLINK ./Shop/42.shtml ./Shhop/4

3、2.shttml工廠生產(chǎn)產(chǎn)管理學(xué)學(xué)院52套講座座+ 1139220份資料 HYPERLINK ./Shop/43.shtml ./Shhop/43.shttml財(cái)務(wù)管理理學(xué)院53套講座座+ 1179445份資料 HYPERLINK ./Shop/45.shtml ./Shhop/45.shttml銷(xiāo)售經(jīng)理理學(xué)院56套講座座+ 1143550份資料 HYPERLINK ./Shop/46.shtml ./Shhop/46.shttml銷(xiāo)售人員員培訓(xùn)學(xué)學(xué)院72套講座座+ 448799份資料 HYPERLINK ./Shop/47.shtml ./Shhop/47.shttml黑龍江野鯉鯉核糖體體內(nèi)

4、轉(zhuǎn)錄錄間隔區(qū)區(qū)（ITTS-11）的克克隆及二二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)的預(yù)測(cè)測(cè)與分析析基金基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部淡水魚(yú)類(lèi)遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（BZ2009-05）;中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)基金（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心）（2007JBFB04）作者簡(jiǎn)介：鐘立強(qiáng)（1985 - ）, 男 , 江蘇高郵人 , 碩士 , 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種研究。（Email）stevezhong1985163. 通訊作者：朱健, （Email）zhujffrc. 鐘立強(qiáng)1,2，張成鋒鋒2，蔡生力力1，劉紅1，李冰2,3，朱健1,2,33上海海洋大大學(xué)水產(chǎn)產(chǎn)與生命命學(xué)院，上上海 220

5、13306； 2.農(nóng)業(yè)部部淡水魚(yú)魚(yú)類(lèi)遺傳傳育種和和養(yǎng)殖生生物學(xué)重重點(diǎn)開(kāi)放放實(shí)驗(yàn)室室，中國(guó)國(guó)水產(chǎn)科科學(xué)研究究院淡水水漁業(yè)研研究中心心，江蘇蘇 無(wú)錫錫 21140881；33.南京京農(nóng)業(yè)大大學(xué)無(wú)錫錫漁業(yè)學(xué)學(xué)院，江江蘇 無(wú)無(wú)錫 22140081）摘要： 【目目的】黑黑龍江野野鯉是我我國(guó)北方方重要的的養(yǎng)殖魚(yú)魚(yú)類(lèi)，分分析和了了解其遺傳結(jié)結(jié)構(gòu)對(duì)鯉鯉魚(yú)種質(zhì)質(zhì)資源的的保護(hù)和和遺傳性性狀的改改良具有有重要的的意義?！痉椒ǚā繉?duì)黑龍江江野鯉(Cypprinnus carrpioo haaemaatoppterrus)核糖體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間間隔區(qū) (ITTS-1)進(jìn)進(jìn)行了克克隆測(cè)序序，并對(duì) ITSS-1序列列進(jìn)行了了分析

6、?！窘Y(jié)果】結(jié)果顯示，所克隆的黑龍江野鯉ITS-1序列長(zhǎng)度為365 bp，其中 A、T、G、C 4種堿基的含量分別為21.4%、12.3%、34.0% 和32.3%；與從GenBank中檢索到的6種鯉科魚(yú)類(lèi)的ITS-1序列相比較，相似性較低，介于24.9% 59.5%之間；同時(shí)利用最小自由能原理預(yù)測(cè)了7種鯉科魚(yú)類(lèi)ITS-1序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并分析了其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?！窘Y(jié)論】根據(jù)鯉魚(yú)與其他6種鯉科魚(yú)類(lèi)的ITS-1序列的同源性構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，所得的分類(lèi)結(jié)果與傳統(tǒng)的分類(lèi)結(jié)果基本一致。在ITS-1序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，微衛(wèi)星序列主要分布于環(huán)和凸起部位，并導(dǎo)致了核苷酸變異和序列長(zhǎng)度差異。一、二級(jí)結(jié)構(gòu)相結(jié)合將是研究

7、物種分子系統(tǒng)學(xué)的重要手段關(guān)鍵詞：黑黑龍江野野鯉 (Cypprinnus carrpioo haaemaatoppterrus)；內(nèi)轉(zhuǎn)錄錄間隔區(qū)區(qū) 1(ITSS-1); 基因因克隆; 二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)Cloniing andd seeconndarry sstruuctuure anaalyssis of thee rDDNA intternnal traansccribbed spaacerr 1 in Cypprinnus carrpio haeemattoptteruusZHONGG Lii-qiiangg 1,2，ZZHANNG CChenng-ffengg 2，Caii Shhengg-li

8、i 1，Liiu HHongg 1，LII Biing 2,33, ZHHU JJiann1,22,3(1. FFishheriies andd Aqqua-liffe sscieencee Coolleege, Shhangghaii Occeann Unniveersiity, Shhangghaii 20013006, Chiina; 2. Keyy laaborratoory of Gennetiic BBreeedinng aand Aquuacuultuure Bioologgy oof FFresshwaaterr Fiishees, Minnisttry of Agrricuu

9、ltuure, Frreshhwatter Fissherriess Reeseaarchh Ceenteer, Chiinesse AAcaddemyy off Fiisheery Sciiencce, Wuxxi 22140081, Chhinaa; 33. FFishheriies Colllegge, Nannjinng Agrricuultuure Uniiverrsitty, Wuxxi 22140081, Chhinaa)Abstrractt: CCyprrinuus ccarppio haeemattoptteruus wass ann immporrtannt ffressh

10、waaterr fiish in Norrth Chiina. Anallyziing andd unnderrstaandiing itss geenettic strructturee iss heelpfful to thee prroteectiion of willd ggermmplaasm ressourrce andd thhe iimprroveemennt oof ggeneeticc trraitts.The intternnal traansccribbed spaacerr 1 (ISST-11) ffromm Cyypriinuss caarpio haeematt

11、optteruus wwas cloonedd, ssequuencced andd annalyyzedd. TThe ressultt shhoweed aa seequeencee wiith tottal lenngthh off 3665 nnuclleottidees oof IITS-1. Thee coonteentss off A, T, G andd C in ITSS-1 of Cypprinnus carrpioo haaemaatoppterrus werre 221.44%, 12.3%, 344.0% annd 332.33% resspecctivvelyy.

12、Coompaarinng tto IITS-1 ssequuencces of thee ottherr 6 Cypprinninee fiishees in GennBannk, theere werre lloweer hhomoologgiess frrom 24.9% to 59.5% beetweeen Cypprinnus carrpioo haaemaatoppterrus andd ottherr fiishees. Bassed on thee seequeencees, thee seeconndarry sstruuctuuress of rrDNAA ITTS-11 i

13、nn Cypprinnus carrpioo haaemaatoppterrus andd ottherr 6 Cypprinninee fiishees wweree prrediicteed aaccoordiing to thee prrincciplle oof mminiimizzingg frree eneergyy, sstruuctuurall chharaacteerissticcs wweree allso anaalyzzed. Thee evvoluutioon ttreee buuiltt frrom thee ITTS-11 hoomollogyy off thhe

14、 77 Cyypriininne ffishhes wass coonsiisteent witth tthatt off trradiitioonall taaxonnomiic rresuultss. Simmplee seequeencee reepeaats (SSSRs) loccateed iin looops andd buulgees, werre rrespponssiblle ffor mosst oof thee obbserrvedd nuucleeotiide varriabbiliity andd leengtth ddifffereencee. Coombiine

15、dd nuucleeotiide seqquennce witth ssecoondaary strructturee wiill be a iimpoortaant wayy too sttudyy Moolecculaar SSysttemss Biioloogy.Key wwordds：CCyprrinuus ccarppio haeemattoptteruus；iinteernaal ttrannscrribeed sspaccer 1；mmoleecullar cloone；secconddaryy sttruccturre鯉魚(yú)是我國(guó)國(guó)重要的的淡水養(yǎng)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)類(lèi),其養(yǎng)殖殖歷史悠悠久，養(yǎng)

16、養(yǎng)殖范圍圍廣闊。在在自然變變異的基基礎(chǔ)上經(jīng)經(jīng)過(guò)多年年的人工工選育,我國(guó)各各地獲得得了多個(gè)具有有明顯雜雜種優(yōu)勢(shì)勢(shì)的雜交交鯉魚(yú)品品種1，而黑黑龍江野野鯉具有有較強(qiáng)抗抗寒能力力，因此此分析和和了解其其遺傳結(jié)結(jié)構(gòu)對(duì)鯉鯉魚(yú)種質(zhì)質(zhì)資源的的保護(hù)和和遺傳性性狀的改改良具有有重要的的意義。核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄間隔隔區(qū) (ITSS-1)介介于核糖糖體 DDNA (rDDNA)的188S和558SS之間，是是非編碼碼區(qū)序列列，最終終不加入入成熟核核糖體，其其受到的的選擇壓壓力較小小，進(jìn)化化速度快快，能提提供比較較豐富的的核苷酸酸變異位位點(diǎn)和信信息位點(diǎn)點(diǎn)，適合合物種間間和種群群水平上上的系統(tǒng)統(tǒng)發(fā)生研研究2-77。自20世紀(jì)

17、紀(jì)七十年年代末 DNAA 序列列測(cè)定開(kāi)開(kāi)始以來(lái)來(lái)，關(guān)于于核糖體體RNAA及其鄰鄰近區(qū)域域的二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)研研究不斷斷深入8。利用用最鄰近近能量參參數(shù)的自自由能最最小原理理進(jìn)行RRNA二二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)的預(yù)測(cè)測(cè)工作開(kāi)開(kāi)始于TTinooco等等9,110。經(jīng)過(guò)一一系列對(duì)對(duì)動(dòng)態(tài)計(jì)計(jì)算方程程的研究究，二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)預(yù)測(cè)的方方法越來(lái)來(lái)越有效效11-14。本研究究對(duì)黑龍龍江野鯉鯉核糖體體 ITTS-11進(jìn)行了了克隆和和測(cè)序，并將其其ITSS-1序序列和 6種鯉科魚(yú)類(lèi)類(lèi)進(jìn)行了了對(duì)比分分析，同同時(shí)利用用最鄰近近能量參參數(shù)的自自由能最最小原理理對(duì)其RRNA的的二級(jí)結(jié)結(jié)構(gòu)進(jìn)行行了預(yù)測(cè)測(cè)，旨在在了解其其核糖體體的分子子遺傳背背

18、景，同時(shí)為為進(jìn)一步步開(kāi)展鯉鯉魚(yú)遺傳傳變異和和鯉科魚(yú)魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)統(tǒng)進(jìn)化的的研究提提供基礎(chǔ)礎(chǔ)資料。1 材料料與方法法1.1 實(shí)驗(yàn)材材料黑龍江野鯉鯉10尾尾樣品來(lái)來(lái)自中國(guó)國(guó)水產(chǎn)科科學(xué)研究究院淡水水漁業(yè)研研究中心心宜興養(yǎng)養(yǎng)殖場(chǎng)。Gel DNA purification Kit（膠回收試劑盒）、pMD19-T載體質(zhì)粒、Taq DNA聚合酶和蛋白酶K均購(gòu)自寶生物 (大連)有限公司。1.2 基因組組DNAA提取剪取黑龍江江野鯉尾尾鰭1550 mg左右右，加入入5000 L裂解解液（0.55% SSDS，2000 gg/mLL 蛋白酶酶 K，0.2 mmol/L EEDTAA pH88.0），55 消化 34 h

19、h， 然然后用酚酚、氯仿仿和異戊戊醇混合合液（225241）抽提提2次，75%乙醇洗洗滌，自自然干燥燥后加 1000 LL 1TE (10 mM TriisHHCl, 1 mmM EEDTAA, ppH 77.5) 溶解。44 保存?zhèn)鋫溆谩DNA濃濃度、質(zhì)質(zhì)量用分分光光度度儀（UUnicco UUV-448022H）和和1% 瓊脂糖糖凝膠電電泳檢驗(yàn)驗(yàn)。1.3 PCRR擴(kuò)增及及序列測(cè)測(cè)定參照GennBannk中金魚(yú)(Carrasssiuss auurattus)、歐鳊鳊(Abrramiis bballleruus)等等鯉科魚(yú)類(lèi)核核糖體序序列，設(shè)設(shè)計(jì)引物物：ITTS-11F 5CGGTAAACA

20、AAGGTTTTCCCGTTAGGGTG33；ITSS-1RR 5 AGGTGAATCCCACCCGCTTAAGGAGTTTG 3，引引物由上上海生物物工程技技術(shù)有限限公司合合成。PCR反應(yīng)應(yīng)體系為為50 ul：模板DDNA 50-1000 ng；2PCRR Miix 225 ul；上上、下游游引物（110 moll/L）各各1 l，其余余體積用用水補(bǔ)足足。反應(yīng)應(yīng)條件為為：944 預(yù)變性性2 mmin，94 變性45 s，60 退火1 min，72 延伸1 min，經(jīng)35個(gè)循環(huán)后再72 延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳確定目的條帶，用Gel DNA purification Kit（膠回收試劑盒

21、）純化回收，與pMD19-T Vector 16 過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落，轉(zhuǎn)至配好的PCR體系溶液中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)并篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子。菌液送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。1.4 數(shù)據(jù)處處理及二二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)的預(yù)測(cè)測(cè)用MEGAA 4.1軟件件計(jì)算堿堿基含量量，并與與從GeenBaank數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)檢檢索到的的6種鯉科魚(yú)類(lèi)類(lèi)的 IITS-1序列列進(jìn)行比比對(duì)，構(gòu)建NJJ系統(tǒng)進(jìn)進(jìn)化樹(shù)。對(duì)黑龍江野野鯉核糖糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間間隔區(qū) (ITTS-1)序序列進(jìn)行行二級(jí)結(jié)結(jié)構(gòu)的預(yù)預(yù)測(cè)，二級(jí)結(jié)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)測(cè)軟件為為Mfoold webb seerveer

22、3.2 15,16。二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)預(yù)測(cè)的參參數(shù)設(shè)置置如下 ：(11) 折折疊溫度度(fooldiing temmperratuure)為 337 ；(22) 序序列類(lèi)型型為RNNA、線線狀(11ineear)；(3) 離子子條件(ionnic conndittionns)為為 1 M NNaC11，無(wú)二二價(jià)離子子(diivallentt ioons)；(4) 計(jì)算算的最大大折疊數(shù)數(shù)(uppperr booundd onn thhe nnumbber of commputted folldinngs)為 550；(5) 窗口口參數(shù)(winndoww paarammeteer)為為 200；(66)

23、 凹凸環(huán)環(huán)的最大大值(mmaxiimiuum ssizee off a bullgeintteriior looop)為為30 bp；(7) 凹凸凸環(huán)最大大不對(duì)稱(chēng)稱(chēng)數(shù) (maxximuum aasymmmettry of a bbulggeiinteerioor lloopp)為330；(8) 堿基基對(duì)之間間的最大大距離值值 (mmaxiimumm diistaancee beetweeen paiiredd baasess)為無(wú)無(wú)限制 (noo liimitt)。二二級(jí)折疊疊的選擇擇參照 Cammpbeell 等17。 2 結(jié)果果2.1 PPCR擴(kuò)擴(kuò)增結(jié)果果及序列列分析經(jīng)PCR成成功擴(kuò)增增出

24、一條條清晰明明亮的條條帶，大小為4407 bp（圖圖1）, 與預(yù)預(yù)期片段段大小相相符。110個(gè)個(gè)個(gè)體的序序列經(jīng)DDnaSSP軟件件分析，共共獲得44種單倍倍型，其其中單倍倍型A有有7個(gè)個(gè)個(gè)體，而而單倍型型B、CC和D各各只有一一個(gè)個(gè)體體。單倍倍型A序序列核糖糖體 IITS-1全序序列大小小為3665 bbp, 其堿基基排列順順序見(jiàn)圖圖2，GGenBBankk數(shù)據(jù)庫(kù)庫(kù)登錄號(hào)號(hào)為GQQ29333599。利用用MEGGA 44.1軟軟件分析析序列的的堿基組組成為 T(112.33%)、CC(322.3% )、AA (221.44% )、G(34.0% ), G +C含量量為 666.33%, 明顯高

25、高于 AA + T含量量 (333.77% )。圖1 黑龍龍江野鯉鯉的rDDNA ITSS-1序序列的PPCR擴(kuò)擴(kuò)增產(chǎn)物物 Fig.11 PCCR aampllifiied prooduccts of rDNNA IITS-1 ffromm Cyypriinuss caarpiio hhaemmatoopteeruss圖2 黑龍龍江野鯉鯉核糖體體DNAA IITS-1單倍倍型A核核苷酸全全序列Fig.22 Commpleete nuccleootidde oof CCyprrinuus ccarppio haeemattoptteruus rrDNAA ITTS-11 haaplootyppe

26、 AA在GenBBankk中檢索索到6種鯉科魚(yú)類(lèi)類(lèi)的核糖體體ITSS-1序列，與黑龍江江野鯉的的核糖體體ITSS-1單倍型型A序列列比對(duì)，結(jié)果如如表1所所示，黑龍江江野鯉與與其他66種鯉科魚(yú)類(lèi)類(lèi)的序列相相似性為為24.9% 599.5%，利用MEEGA 4.11軟件中基基于Kiimurra 雙雙參數(shù)模模型的NNJ法(Neeighhborr-Jooiniing)構(gòu)建了系系統(tǒng)發(fā)生生樹(shù)，采用Boootsstraap (重復(fù)數(shù)數(shù)=5000) 檢驗(yàn)分分子系統(tǒng)統(tǒng)樹(shù)各分分支的置置信度，所得的的分類(lèi)結(jié)結(jié)果與傳傳統(tǒng)的分分類(lèi)結(jié)果果相吻合合(圖 2)。表1 黑龍龍江野鯉鯉與其他他魚(yú)類(lèi)核核糖體IITS-1序列列同源性

27、性、長(zhǎng)度度和G+C含量量的比較較Tab.11 Thhe hhomoologgy, lenngthh, GG +CC coonteent of rDNNA IITS-1 ssequuencces of C.cc.haaemaatoppterrus andd ottherr fisshess種類(lèi)相似性（%）序列長(zhǎng)度（bp）G+C（%）GenBaank登登錄號(hào)黃鰭結(jié)魚(yú)（Torr puutittoraa）馬休結(jié)魚(yú)（Tor mussullah）金魚(yú)（Caarasssiuus aauraatuss）似龜結(jié)魚(yú)（Tor chelynoides）歐鳊（Abbrammis balllerrus）歐鰱（Leeuci

28、iscuus ccephhaluus）黑龍江野鯉鯉（C.c.hhaemmatoopteeruss）24.929.559.526.345.341.190581029470834532536557.95764.956.761.259.466.3FJ85993655FJ80444166EF10007277FJ18220688FJ94553266FJ94553299GQ29333599圖3 77種鯉科科魚(yú)類(lèi)核核糖體DDNA ITSS-1序序列構(gòu)建建的NJJ系統(tǒng)進(jìn)進(jìn)化樹(shù)Fig.33 Phhyloogennetiic ttreee deerivved froom rrDNAA ITTS-11seqquen

29、ncess off 7 Cypprinninee fiishees2.2 IITS-1的二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)分分析對(duì)黑龍江野野鯉核糖糖體ITTS-11 單倍型型A序列列進(jìn)行二二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)的預(yù)測(cè)測(cè)（圖33），自自由能G= -1662.449 kkcall/mool，包括66條臂（sstemm），其其中0號(hào)號(hào)臂由55 和和 3 末端端相互配配對(duì)形成成。黑龍江江野鯉IITS-1單倍倍型A序序列中的的簡(jiǎn)單重重復(fù)序列列(Siimplle SSequuencce RRepeeat，SSSR)通過(guò)微微衛(wèi)星搜搜索服務(wù)務(wù)網(wǎng)站檢檢索（.bioophpp.orrg/mminiitoools/miccrossateelliite

30、_reppeatts_ffindder/demmo.pphp），參數(shù)設(shè)置如下：重復(fù)序列長(zhǎng)度（Length of repeated sequence）=2-3；最小重復(fù)數(shù)（Minimum number of repeats）=3；最小連續(xù)重復(fù)長(zhǎng)度（Minimum length of tanden repeat）=6；錯(cuò)配比例（Allowed percentage of mismatches）=0.2，共發(fā)現(xiàn)9個(gè)SSR序列（表2），而這些SSR序列都位于內(nèi)環(huán)(Interior loop)、多分枝環(huán)(Multi-loop)和發(fā)夾環(huán)（Hairpin loop）部位(圖4)。表2 黑龍龍江野鯉鯉ITSS

31、-1單單倍型AA中微衛(wèi)衛(wèi)星位點(diǎn)點(diǎn)和序列列Tab.22 Miccrossateelliitess looci andd seequeencees iin IITS-1 off Cyypriinuss caarioo haaemaatoppterrus happlottypee ANOPosittionnCycleeRepeaatsSequeencee1234567892372100184263275299308324222522222433333333CTCTCCTCTTCCCCCCCACACAACCAGGGGCGGGGGCCGGGGGCCCCCCCGGGGGGGCCCCCCCTTTTTTTTG

32、TGTTG圖4 黑龍龍江野鯉鯉（Cypprinnus carrio haeemattoptteruus）核核糖體DDNA ITSS-1單單倍型AA序列的RNAA轉(zhuǎn)錄二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)預(yù)測(cè)圖Fig.44 PPreddictted secconddaryy sttruccturre oof RRNA traansccrippt oof IITS-1 ssequuencces of Cypprinnus carrio haeemattoptteruus happlottypee A注：圖中放放大部位位顯示了了SSRR的位置置與結(jié)構(gòu)構(gòu)，粗箭箭頭所指指為兩個(gè)個(gè)保守序序列，細(xì)細(xì)箭頭是是兩個(gè)SSSR序序列相互互配

33、對(duì)形形成發(fā)夾夾結(jié)構(gòu)的的柄部 Note：Thee exxpanndedd poortiionss shhoweed rregiionss off SSRRs. Twoo coonseerveed ssequuencces (-CCGUAAACAA-) werre iindiicatted by twoo thiick arrrowss, tthe thiin aarroow sshowwed twoo SSSRs paiiredd wiith eacch ootheer, expposeed iin tthe steem oof aa dooublle hhairrpinn. 對(duì)對(duì)GennBan

34、nk中檢檢索到其其他6種鯉科魚(yú)類(lèi)類(lèi)的核糖體體ITSS-1序列的二二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)也進(jìn)行行了預(yù)測(cè)測(cè)，7種鯉科魚(yú)魚(yú)類(lèi)核糖糖體ITTS-1序列的的二級(jí)結(jié)結(jié)構(gòu)的特特征見(jiàn)表表3。在相相同的折折疊參數(shù)數(shù)下，這這7種鯉科科魚(yú)類(lèi)ITTS-1序列二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)最最低自由由能存在在一定差差別，并并與其序序列長(zhǎng)度度正相關(guān)關(guān)。在黑黑龍江野野鯉魚(yú)的的2號(hào)與與5號(hào)臂臂發(fā)現(xiàn)相相同的保保守序列列（Consservved seqquenncess：CGGUAAACAGG，它們們都位于于雙發(fā)夾夾的發(fā)夾夾環(huán)（圖圖4粗箭箭頭所示示），而而在黑龍龍江野鯉鯉魚(yú)，三三種結(jié)魚(yú)魚(yú)和金魚(yú)魚(yú)的二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)中中發(fā)現(xiàn)了了一個(gè)保保守序列列（Coonseerveed

35、 mmotiif：5-CCCCCCCCGTMMMBRRGGGGGGGGG-33），該保保守序列列的二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)位位于發(fā)夾夾結(jié)構(gòu)，且且序列前前段的CCCCCCCC與與后段GGGGGGGG相相互配對(duì)對(duì)（見(jiàn)圖圖4細(xì)箭箭頭），形形成發(fā)夾夾結(jié)構(gòu)的的柄，根根據(jù)這個(gè)個(gè)保守序序列（CConsservved mottif）的相似似性構(gòu)建建了系統(tǒng)統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)樹(shù)（圖55）。表3 基于于Mfoold模模型產(chǎn)生生的7種種鯉科魚(yú)魚(yú)類(lèi)ITTS-1二級(jí)結(jié)結(jié)構(gòu)特征征Tab.33 ITSS-1 ssecoondaary strructturaal ffeatturees bbaseed oon Mfoold moddelss off

36、7 Cypprinnid fisshess種類(lèi)(specciess)序列長(zhǎng)度(bp)成對(duì)堿基數(shù)數(shù)(pairred-basse)自由能GG (kccal/moll)保守序列(Consservved mottif)黑龍江鯉（C.c.haematopterus）黃鰭結(jié)魚(yú)aa（Torr puutittoraa）馬休結(jié)魚(yú)aa（Torr muussuullaah）金魚(yú)（Caarasssiuus aauraatuss）似龜結(jié)魚(yú)（Tor chelynoides）歐鳊（Abbrammis balllerrus）歐鰱（Leeuciiscuus ccephhaluus）36590581029470834532510

37、92002238918310498-164.97-281.52-277.11-133.11-205.69-146.49-136.76CCCCCCCGTTAACCAGGGGGGGGG-CCCCCCCGTTAATTAGGGGGGG-CGGCCCCCCCGTTAATTAGGGGGGG-CGGCCCCCCCCTTCCGGGGGGGGGGGG-CCCCCCCGTTAATTAGGGGGGGGCGG注：a. Mffoldd weeb sservver 3.2 軟件件每次只只能折疊疊8000 bpp長(zhǎng)度的的序列，標(biāo)標(biāo)注“a”的序列列都是部部分折疊疊。Note：a. Sooftwwaree Mffoldd we

38、eb sservver 3.2 caan oonlyy foold 8000 bpp eaach timme, seqquenncess maarkeed wwithh“a” werre pparttiallly folldedd3 討論論通過(guò)對(duì)7種種鯉科魚(yú)魚(yú)類(lèi)的核核糖體DDNA ITSS-1序序列比對(duì)對(duì)，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)序列差差異很大大，堿基基相似性性介于119% 544%之間，這這說(shuō)明IITS-1序列列具有高高度的變變異性，適適合作為為物種鑒鑒定和分分類(lèi)的分分子標(biāo)記記。比對(duì)對(duì)結(jié)果表表明，序序列長(zhǎng)度度差異主主要是由由于重復(fù)復(fù)序列導(dǎo)導(dǎo)致的，HHostte等18認(rèn)為這些些重復(fù)序序列大多多數(shù)位于于核糖體體螺

39、旋內(nèi)內(nèi)部或補(bǔ)補(bǔ)償性堿堿基改變變的末端端環(huán)或凸凸起部分分，在核核糖體活活動(dòng)中不不起關(guān)鍵鍵作用。本本研究構(gòu)構(gòu)建的黑黑龍江野野鯉ITTS-11序列的的RNAA二級(jí)結(jié)結(jié)構(gòu)中，大大多數(shù)SSSR序序列也位位于環(huán)和和凸起部部位，進(jìn)進(jìn)一步驗(yàn)驗(yàn)證了這這一點(diǎn)。黑龍江野鯉ITS-1序列的G + C含量為66.3% , 與其他6種鯉科魚(yú)類(lèi)G +C含量相近, 沒(méi)有明顯差異，卻低于胡子鲇科的G +C含量（67%73%）19。Jansen等19和Bernardi等20認(rèn)為G +C含量與當(dāng)?shù)氐臍夂颦h(huán)境有關(guān), 高的G +C含量越易適應(yīng)熱帶氣候。圖5 55種鯉科科魚(yú)類(lèi)核核糖體DDNA ITSS-1保保守序列列相似性性構(gòu)建的的系統(tǒng)

40、進(jìn)進(jìn)化樹(shù)Fig.55 PPhyllogeenettic treee dderiivedd frrom rDNNA IITS-1 Connserrvedd mootiff off 5 Cypprinnid fisshess有學(xué)者認(rèn)為為這些重重復(fù)序列列是物種種進(jìn)化過(guò)過(guò)程中所所形成的的，與一一級(jí)核苷苷酸序列列相比，重重復(fù)序列列形成的的二級(jí)結(jié)結(jié)構(gòu)更加加保守，因因此可以以用于物物種鑒定定和系統(tǒng)統(tǒng)進(jìn)化分分析。目目前rRRNA二二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)庫(kù)已經(jīng)出出現(xiàn)并收收集保存存了大量量植物，寄寄生蟲(chóng)、微微生物和和植物的的rRNNA二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)。最小自由能法在短序列預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)時(shí)只能保證相對(duì)準(zhǔn)確性（預(yù)測(cè)700 bp長(zhǎng)的RN

41、A片段時(shí)，精確度達(dá)70%），而魚(yú)類(lèi)ITS-1序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)還鮮見(jiàn)報(bào)道，不能通過(guò)與其他魚(yú)類(lèi)ITS-1序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似性比較去除軟件計(jì)算的錯(cuò)誤和誤差所導(dǎo)致的冗余莖區(qū)，因此本研究初步預(yù)測(cè)和比較了黑龍江野鯉和其他六種鯉科魚(yú)類(lèi)ITS-1序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)比較我們發(fā)現(xiàn)雖然ITS-1序列差異較大，但是其二級(jí)結(jié)構(gòu)存在相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?。保守序列（Conserved motif : 5-CCCCCCGTMMBRGGGGGGG-3）同時(shí)存在于5種魚(yú)中，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且保守序列兩端的C與G相互配對(duì)構(gòu)成了發(fā)夾結(jié)構(gòu)的柄。該保守序列形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)相似性構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)與一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)基本一致，但黃鰭結(jié)魚(yú)、馬休結(jié)魚(yú)

42、和似龜結(jié)魚(yú)之間的進(jìn)化關(guān)系與一級(jí)結(jié)構(gòu)的進(jìn)化樹(shù)存在差異，因此一、二級(jí)結(jié)構(gòu)相結(jié)合將是研究物種分子系統(tǒng)學(xué)的重要手段。參考文獻(xiàn)1 樓樓允東我國(guó)魚(yú)魚(yú)類(lèi)近緣緣雜交研研究及其其在水產(chǎn)產(chǎn)養(yǎng)殖上上的應(yīng)用用J水產(chǎn)學(xué)學(xué)報(bào), 20007,31(4)：5322 - 53882 王王慶,傅洪拓拓核rDNNA IITS 區(qū)在水產(chǎn)產(chǎn)動(dòng)物研研究中的的應(yīng)用J安徽農(nóng)農(nóng)學(xué)通報(bào)報(bào), 20007,13(11)：99 10113 郝郝劍瑾,程舟,梁洪卉卉,楊曉伶伶,李珊,周銅水水,張文駒駒,陳家寬寬基于rDDNA ITSS 序列列探討我我國(guó)冬蟲(chóng)蟲(chóng)夏草的的遺傳分分化及分分布格局局J中草藥藥, 20009,40(1)：112 11664 魏魏曉

43、華櫛孔扇扇貝和海海灣扇貝貝的遺傳傳多樣性性研究及及扇貝科科幾種貝貝類(lèi)的分分子系統(tǒng)統(tǒng)學(xué)研究究D青島:中國(guó)海海洋大學(xué)學(xué), 2000465 程程新峰,席貽龍龍,李化炳炳核rDNNA-IITS區(qū)區(qū)在無(wú)脊脊椎動(dòng)物物分子系系統(tǒng)學(xué)研研究中的的應(yīng)用J動(dòng)物學(xué)學(xué)報(bào),20008 ,54(2) :2455 25556 CChenng HHL, Xiaa DQQ, WWu TTT, Menng XXP, Ji HJ, Doong ZGStuudy on Seqquenncess off Riibossomaal DDNA Intternnal Traansccribbed Spaacerrs of Claams Bel

44、longgingg too thhe VVeneeriddae Fammilyy (MMollluscca: Bivvalvvia) JJ HYPERLINK .sciencedirect./science/journal/03794172 AActaa Geenetticaa Siinicca, 20006, 333:7002-77107 牟牟希東，白白俊杰，汪汪學(xué)杰，羅羅建仁金魚(yú)核糖糖體內(nèi)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄間隔隔區(qū)（IITS-1）的的克隆和和序列分分析JJ淡水漁漁業(yè),20008 ,38(1) :74 768 GGotttschhlinng MM, Plottnerr JSecconddaryy Stt

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48、a./paper.aspx?f=detail&n=10&q=%e4%bd%9c%e8%80%85+%3a+%22Scott+R.+Santos%22+DBID%3aNSTL_QK SScottt RR, SaantoosSecconddaryy struuctuurall modeelinng oof the secoond inteernaal ttrannscrribeed sspaccer (itts2) fromm Pffiessterria-likke ddinooflaagelllattes (Dinoophyyceaae) JHaarmfful Alggae, 20009, 8:

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