生物樣品預(yù)處理

1、生物樣品預(yù)處理的常用方法以及最新進(jìn)展常用的處理方法 處理方法簡介 4生物樣品預(yù)處理的目的 1預(yù)處理的指導(dǎo)原則23目錄一、生物樣品 生物樣品的種類生物樣品血液尿液其他頭發(fā)唾液組織器官膽汁、乳汁、腦脊液、淚液、精液、胃液、胰液、淋巴液、糞便等。一、生物樣品預(yù)處理的目的1.使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放出來，以測定藥物的 總濃度。2.生物樣品介質(zhì)組成復(fù)雜，干擾多，而藥物組分是微量 的，必須先經(jīng)過預(yù)處理，使純化，富集。3.為了適應(yīng)和符合測定方法所要求的靈敏度。4.為了防止分析儀器的污染、劣化，提高測定靈敏度、 準(zhǔn)確度、精密度和選擇性等。二、生物樣品預(yù)處理的指導(dǎo)原則生物樣品進(jìn)行預(yù)處理時(shí)應(yīng)考慮到的問題： 1

2、.藥物的理化性質(zhì)和存在性質(zhì) 2.待測藥物的濃度 3.藥物測定的目的 4.選用的生物樣品類型 5.樣品預(yù)處理與分析技術(shù)的關(guān)系二、指導(dǎo)原則-預(yù)處理應(yīng)考慮問題 1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式 A.酸堿性質(zhì)、未電離分子的親脂性、揮發(fā)性：涉及藥物 的提取性質(zhì)、是否揮發(fā)損失以及能否采用GC法 a.較親脂的藥物：可用溶劑萃取，也可用烷基鍵和相 硅膠、大孔吸附樹脂及親水型填料SPE等方法。 b.親水性較強(qiáng)且有酸堿性、可電離藥物：離子交換柱 和離子對(duì)液液萃取等。 c.親水性較強(qiáng)但不能電離藥物：沉淀蛋白二、指導(dǎo)原則-預(yù)處理應(yīng)考慮問題 1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式 B.藥物在體內(nèi)的存在形式及蛋白結(jié)合率： a.結(jié)合蛋白

3、率高: 首先去蛋白 b.多為代謝綴合物：綴合物水解 C.藥物的光譜特性及官能團(tuán)特性：涉及分析儀器 的選擇以及是否需要衍生化和特殊檢測器。 紫外吸收強(qiáng)弱：是否用UV檢測器 含有-NO2 、-Cl等電負(fù)性基團(tuán)：ECD檢測器二、指導(dǎo)原則-預(yù)處理應(yīng)考慮問題 1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式 D.藥物的穩(wěn)定性： a.易氧化藥物:加入抗氧劑 b.易被光分解藥物:避光 c.易被酯酶水解藥物:對(duì)酶進(jìn)行滅活二、指導(dǎo)原則-預(yù)處理應(yīng)考慮問題 2.待測藥物的濃度 濃度越大，預(yù)處理要求越低；反之，濃度越小， 預(yù)處理要求越高。例如，地高辛的治療血藥濃度 為1-2ng/ml,而水楊酸的治療血藥濃度為20-100g/ml。 3.

4、藥物測定的目的 a.急性中毒病例：快速鑒定所懷疑的藥物，盡 可能短時(shí)間測得。預(yù)處理可粗放些。 b.分別獲得酸性、中性或堿性代謝物：要考慮 全面、細(xì)致二、指導(dǎo)原則-預(yù)處理應(yīng)考慮問題 4.選用的生物樣品類型血漿、血清：除蛋白然后提取唾液：離心去粘蛋白尿液：酸水解或酶水解法使綴合物水解頭發(fā)：有機(jī)破壞 5.樣品預(yù)處理與分析技術(shù)的關(guān)系 樣品預(yù)處理需要的凈化程度與所用分析 方法是否專屬、是否具有分離能力、檢 測系統(tǒng)對(duì)雜質(zhì)污染的耐受程度有關(guān)。三、常用的處理方法常用方法1.有機(jī)破壞法2.除蛋白法3.綴合物的水解4.分離，純化 與濃集5.衍生化法重點(diǎn)介紹除蛋白法 液液萃取法三、常用的處理方法-有機(jī)破壞法 1.有

5、機(jī)破壞法分 類特 點(diǎn)樣 品濕法破壞硝酸 高氯酸法1、硫酸作為分解劑（消化劑），加氧化劑（硝酸、高氯酸、過氧化氫等）作輔助分解劑。 2、破壞能力強(qiáng)，反應(yīng)比較激烈，操作時(shí)，應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。 3、先低溫反應(yīng)，再高溫蒸發(fā)，以免發(fā)生爆炸； 4、所得的無機(jī)金屬離子，一般為高價(jià)態(tài)。 血、尿、組織電熱消化器法人發(fā)電熱板消化法烘箱消化法干法破壞高溫?zé)胱品?、適用于鹵素、硒、硫、磷等微量元素分析的前處理 2、高溫?zé)胱品ǎ痕釄?，先完全炭化，再灰化，鹽酸溶解定容。鹽酸加無水碳酸鈉或氧化鎂等以助灰化。（高溫電子爐、低溫等離子） 3、氧瓶燃燒法：密閉的燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，選擇適當(dāng)吸收液。氧瓶燃燒法血、人發(fā)三、常用的處理方

6、法-除蛋白法蛋白質(zhì)沉淀酶解法去除蛋白三、常用的處理方法-除蛋白法 1.蛋白質(zhì)沉淀 蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為 蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)，變性蛋白質(zhì) 一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì) 沉淀，在一定的條件下，變性的蛋白質(zhì)也可 不發(fā)生沉淀。 表面水化層 調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)蛋白質(zhì)親水膠體顆粒 凝集析出 表面電荷 加入脫水劑破壞破壞三、常用的處理方法-除蛋白法 測定血樣時(shí)，首先應(yīng)去除蛋白質(zhì)。 去除蛋白質(zhì)作用： a.可使結(jié)合型藥物釋放出來，以便 測定藥物的總濃度； b.可預(yù)防提取過程中蛋白質(zhì)發(fā)泡， 減少乳化的形成； c.可保護(hù)儀器性能（如保護(hù) HPLC柱 不被污染），延長使用期

7、限。 三、常用的處理方法-除蛋白法1.蛋白質(zhì)沉淀方法 溶劑解法 鹽析和脫水 加入中性鹽蛋白質(zhì)沉淀 加入強(qiáng)酸 生成不溶性鹽沉淀 加入重金屬沉淀劑三、常用的處理方法-除蛋白法A.溶劑解法-加入與水相混溶的有機(jī)溶劑 加入水溶性的有機(jī)溶劑，可使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子 間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，使與蛋白質(zhì)結(jié) 合的藥物釋放出來。 常用的水溶性有機(jī)溶劑有：乙腈、甲醇、乙醇、丙 醇、丙酮、四氫呋喃等。含藥物的血漿或血清與水 溶性有機(jī)溶劑的體積比為1：（13）時(shí)，就可以將 90以上的蛋白質(zhì)除去。水溶性有機(jī)溶劑的種類不 同時(shí)，析出的蛋白質(zhì)形狀亦不同；并且所得上清液 的pH值也稍有差別，如用乙腈或甲醇時(shí)，上清液p

8、H 為8.59.5，用乙醇或丙酮時(shí)，上清液pH為910。 三、常用的處理方法-除蛋白法A.溶劑解法-加入與水相混溶的有機(jī)溶劑 操作步驟： a.水溶性有機(jī)溶劑與血漿或血清按一定比例混合 b.離心分離，采用超速離心機(jī)（10000rmin）離 心12min。（使用具塞塑料尖底管） c.取上清液作為樣品。 將蛋白質(zhì)粘牢在管底，便于吸取上清液三、常用的處理方法-除蛋白法A.溶劑解法-加入與水相混溶的有機(jī)溶劑 優(yōu)點(diǎn)：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑 只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀； 2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易； 3）在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。 缺點(diǎn)：對(duì)具有生物活性的大分子容易引起變性

9、失活， 操作要求在低溫下進(jìn)行?？傮w來說，蛋白質(zhì)和 酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。 三、常用的處理方法-除蛋白法B.加入中性鹽 加入中性鹽，使溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化。中性鹽 能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來，從而使蛋白質(zhì)脫 水而沉淀。 常用的中性鹽有：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷 酸鹽及枸櫞酸鹽等。 操作：a.按血清與飽和硫酸銨的比例為1：2混合; b.離心（10000r/min）12min，即可除去90以 上的蛋白質(zhì)。 c.得上清液的pH為7.07.7。三、常用的處理方法-除蛋白法B.加入中性鹽優(yōu)點(diǎn): 藥物的回收率高；不引起蛋白質(zhì)變性。注意事項(xiàng) :鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強(qiáng)度，溶液p

10、H值越接近蛋白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)越容易沉淀。三、常用的處理方法-除蛋白法C.加入強(qiáng)酸 當(dāng)pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以陽離子形式 存在。此時(shí)加入強(qiáng)酸，可與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶 性鹽而沉淀。 常用的強(qiáng)酸有：10三氯醋酸、6高氯酸、硫酸- 鎢酸混合液及5偏磷酸等。 三、常用的處理方法-除蛋白法C.加入強(qiáng)酸 操作： a.含藥物血清與強(qiáng)酸的比例為1：0.6混合; b.離心10000rmin）12min(可以除去90以上的蛋白質(zhì)) c.取上清液作為樣品。優(yōu)點(diǎn)：該方法去蛋白迅速簡單， 且而所需樣品量少， 組分極少變化。 分析：過量的三氯醋酸可經(jīng)煮沸，分解為氯仿和二氧化碳而被除去； 也有用乙醚提取過量三氯

11、醋酸的方法。過量的高氯酸可用碳 酸鉀、醋酸鉀、氫氧化鈉等中和，然后加乙醇使產(chǎn)生的高氯 酸鉀（鈉）沉淀而被除去。偏磷酸及硫酸-鎢酸可用同法除去。 因加入了強(qiáng)酸，上清液呈酸性（pH04），在酸性條件下易 分解的藥物不宜用本法除蛋白。 三、常用的處理方法-除蛋白法D.加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑 當(dāng)pH高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，金屬陽離子與蛋白質(zhì) 分子中帶負(fù)電荷的羧基形成不溶性鹽而沉淀。常用的沉淀劑有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等。離心分離后所得的上清液pH分別為5.77.3和6.57.5。 優(yōu)點(diǎn)： 可將含水體液樣品直接進(jìn)樣或只經(jīng)簡單去蛋白處理后進(jìn)樣，簡化操作。三、常用的處理方法-除蛋白法2

12、.酶解法 在測定一些酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物時(shí)，常需 用酶解法。 最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。 它不僅可使組織溶解，并可使藥物析出?？莶菥芩厥?一種細(xì)菌性堿性蛋白分解酶，可在較寬的pH范圍（ PH7.011.0）內(nèi)使蛋白質(zhì)的肽鍵降解，在5060 具有最大活力。 三、常用的處理方法-除蛋白法2.酶解法 操作：先將被測組織加Tris-緩沖液pH 10.5及酶， 60培育1h，用玻璃棉過濾，得澄清濾液， 即可供藥物提取用。 優(yōu)點(diǎn)：可避免某些藥物在酸及高溫下降解；對(duì)與 蛋白質(zhì)結(jié)合牢的藥物（如保泰松、苯妥英鈉）， 可顯著改善回收率；可用有機(jī)溶劑直接提取 酶解液而無乳化現(xiàn)象生成，當(dāng)采用HPL

13、C法檢 測時(shí)，無需再進(jìn)行過多的凈化操作。 不足：不適用于在堿性下易水解的藥物。 三、常用的處理方法-綴合物的水解綴合物：藥物或其代謝物與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成 的產(chǎn)物。內(nèi)源性物質(zhì)： a.葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸 等； b.一些含有羥基，羧基，氨基和巰基的藥物，可 與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸結(jié)合形成葡萄糖醛酸 苷綴合物； c.一些含酚羥基，芳胺及醇類藥物與內(nèi)源性物質(zhì) 硫酸形成硫酸酯綴合物。 三、常用的處理方法-綴合物的水解特點(diǎn)：多用于尿中藥物或其代謝物；綴合物極性 較大，不易被有機(jī)溶劑提取。常用方法：a.酸水解：適量鹽酸（條件因藥而異）b.酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或兩者 的混

14、合酶，一般控制pH值在4.55.5， 37培育數(shù)小時(shí)。三、常用的處理方法-綴合物的水解特點(diǎn)專屬性強(qiáng)溫和時(shí)間長 帶入粘蛋白阻塞色譜柱 費(fèi)用高 帶入粘蛋白導(dǎo)致乳化 b.酶水解法四、常用的處理方法-分離、濃集、純化（一）液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）是傳統(tǒng)的分離、分析方法，據(jù)檢測靈敏度要求，提取后一般需濃集。傳統(tǒng)濃集方法： a.在末次提取時(shí)加入的提取液盡量少，使被測組分提取 到小體積溶劑中，然后直接吸出適量供測定。 b.揮去提取溶劑法。揮去溶劑時(shí)應(yīng)避免直接加熱，防止 被測組分破壞或揮發(fā)損失。揮去提取溶劑的常用方法 是直接通入氮?dú)饬鞔蹈?；?duì)于易隨氣流揮發(fā)或遇熱不

15、穩(wěn)定的藥物，可采用減壓法揮去溶劑。 四、分離、濃集、純化-液液萃取法原理：多數(shù)藥物是親脂性的，在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血液或尿液中含有的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性雜質(zhì)。因而用有機(jī)溶劑提取一次即可除去大部分雜質(zhì)，從大量的樣品中提取藥物經(jīng)濃集后作為分析樣品。四、分離、濃集、純化-液液萃取法操作：萃取一次，不采用反復(fù)萃取的方法。特殊情況（雜質(zhì)不易除去，萃取液難以揮發(fā)干擾測定），用一定pH值的水溶液對(duì)含藥有機(jī)相進(jìn)行反萃 ?。╞ack extraction）萃取率不低于50%即可。萃取前加入等量內(nèi)標(biāo)。四、分離、濃集、純化-液液萃取法影響萃取的因素影響萃取的因素：有機(jī)溶劑的

16、特性、有機(jī)溶劑相與水相的 體積及水相的pH值等1.溶劑的選擇與純度要求 a.提取率和選擇性 b.操作是否方便。選擇溶劑時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： 要了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，根據(jù)相似 相溶的原理進(jìn)行選用 要求對(duì)藥物的未電離分子可溶，而對(duì)電離形式的 分子不溶 沸點(diǎn)低，易揮散、濃集 無毒、不易燃燒四、分離、濃集、純化-液液萃取法影響萃取的因素選擇溶劑時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： 與水不相混溶，如乙醚，萃取后可混入約1.2% 的水份，可能帶入一些水溶性雜質(zhì)。乙醚萃取 能力強(qiáng)，易于揮散、濃集、為常用萃取溶劑， 可采用無水碳酸鈉脫水，減少混入的水溶性雜 質(zhì)量 不易形成乳化 具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性 不影響紫外檢測

17、四、分離、濃集、純化-液液萃取法影響萃取的因素提取溶劑：四、分離、濃集、純化-液液萃取法影響萃取的因素2.有機(jī)溶劑相和水相的體積 a.有機(jī)相與水相（體液樣品）容積比為1:1或2:1。 b.在實(shí)驗(yàn)中考察有機(jī)溶劑的最佳用量。3.水相的pH值 a.一般規(guī)則來說，堿性藥物在堿性pH值，酸性藥物在酸性pH值介質(zhì)下提??； b.生物樣品一般多在堿性下提取； c.一些堿性藥物在堿性pH不穩(wěn)定時(shí)，則在近中性pH處用氯仿和異丙醇提??； d.中性藥物在pH7附近提取。四、分離、濃集、純化-液液萃取法液液萃取法優(yōu)點(diǎn)：操作方便;具有選擇性，藥物能與多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)分離，尤其 在使用非專屬性的光譜分析時(shí)，這一優(yōu)點(diǎn)更為突出，但這依賴 有機(jī)溶劑的選擇。缺點(diǎn)：a.產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，引起藥物損失，導(dǎo)致回收率較低; b.有機(jī)溶劑易揮發(fā)、有毒性、對(duì)環(huán)保不利; c.不能自動(dòng)化。注意：1.防止乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生 a.采用較大體積的有機(jī)溶劑進(jìn)行提??； b.在提取前于水中加入固體氯化鈉; c.輕微乳化時(shí)，適當(dāng)轉(zhuǎn)速離心; d.嚴(yán)重乳化時(shí)，置低溫冰箱中使水相快速凍凝，破壞乳化 層再溶化后離心。 2.減少吸附 a.加入異戊醇 b.加入二乙胺四、分離、濃集、純化-液