KJ06液相色譜方法開(kāi)發(fā)課件

1、液相色譜教程液相色譜方法開(kāi)發(fā) 液相色譜教程液相色譜方法開(kāi)發(fā) 開(kāi)發(fā)液相色譜方法液相色譜方法即液相色譜實(shí)驗(yàn)所需的基本參數(shù),包括以下各項(xiàng)內(nèi)容:流動(dòng)相:種類及配比(等度或梯度)固定相:色譜柱類型及內(nèi)徑,長(zhǎng)短流動(dòng)相輸送系統(tǒng)參數(shù):流速檢測(cè)器參數(shù):檢測(cè)波長(zhǎng),靈敏度等溫度控制 進(jìn)樣量 以上參數(shù)即構(gòu)成一個(gè)具體的HPLC方法,亦稱 色譜條件開(kāi)發(fā)液相色譜方法液相色譜方法即液相色譜實(shí)驗(yàn)所需的基本參數(shù),包評(píng)價(jià)液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題什么樣的分離結(jié)果是好的?分離度?評(píng)價(jià)液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題什么樣的分離結(jié)果是好的?分離度?什么是液相色譜的分離度？分離度的定義：R: 分離程度的量度什么是液相色譜的分離度？分離度的定義：R:

2、分離程度的量度影響分離度的因素K,N分離度方程 K是容量因子，表達(dá)了被分離組分與柱填料 的作用強(qiáng)弱 是分離因子,描述兩個(gè)組分分離的好壞程度, 是化學(xué)因素 N 是理論塔板數(shù),描述色譜峰的譜帶展寬程度影響分離度的因素K,N分離度方程容量因子 k改變k值的方法調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性、pH、離子強(qiáng)度等梯度淋洗與峰高的關(guān)系與R的關(guān)系容量因子 k改變k值的方法與峰高的關(guān)系與R的關(guān)系分離因子 定義 =1 時(shí)兩組分分不開(kāi)改變的途徑 改變固定相 改變流動(dòng)相 改變溫度 改變樣品的本身性質(zhì)分離因子 定義色譜柱的柱效 N理論塔板數(shù)計(jì)算公式： W 方法Wtan16切線法Wh5.54半峰高W39 3W416 4W525 5色譜

3、柱的柱效 N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：，k，N如何控制分離度?，k，N如何控制分離度?開(kāi)發(fā)方法的其它考慮因素分離度是色譜分離中主要考慮的因素除分離度之外,在開(kāi)發(fā)色譜方法時(shí),以下幾個(gè)因素也都要考慮:靈敏度載樣量分析速度溶劑損耗成本容易使用色譜柱壽命效率開(kāi)發(fā)方法的其它考慮因素分離度是色譜分離中主要考慮的因素成本方法開(kāi)發(fā):第一步干什么?想辦法得到各種信息向同行了解是否做過(guò)此類樣品，或有否類似樣品的分析方法查文獻(xiàn)，如CA(化學(xué)文摘)儀器制造商的文獻(xiàn)，如Waters對(duì)色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開(kāi)發(fā)方法充分了解自己的樣品方法開(kāi)發(fā):第一步干什么?想辦法得到各種信息參照文獻(xiàn)方法時(shí)的注意事項(xiàng)采用與文獻(xiàn)方法相

4、同的色譜柱(品牌,固定相,內(nèi)徑,長(zhǎng)度),否則不能重現(xiàn)文獻(xiàn)結(jié)果注意不同HPLC系統(tǒng)體積的差異,若系統(tǒng)體積不同,則不能重現(xiàn)文獻(xiàn)的梯度方法注意盡量避免流動(dòng)相對(duì)色譜柱的損害(pH,緩沖鹽的種類和濃度)注意文獻(xiàn)方法發(fā)表的年代背景,不要機(jī)械照搬,而應(yīng)立足創(chuàng)新,盡可能采用HPLC新技術(shù)參照文獻(xiàn)方法時(shí)的注意事項(xiàng)采用與文獻(xiàn)方法相同的色譜柱(品牌,固一般的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對(duì)較高的流速使用盡可能高純度的標(biāo)準(zhǔn)品先用高強(qiáng)度的洗脫液調(diào)節(jié)k值改變保留值調(diào)節(jié)值改變選擇性調(diào)節(jié)柱長(zhǎng)度改變柱效及分離速度一般的具體步驟先用一根短的色譜柱反相色譜方法開(kāi)發(fā)實(shí)例1色譜柱: C18 , 4 mm x 30 cm流動(dòng)相: 甲醇,

5、 1% 醋酸, 80/20流 速: 2.5 ml/min樣 品: 1) 撲熱息痛 2) 咖啡因 3) 水楊酰胺 4) 阿斯匹林檢測(cè)器: UV 254nm, 0.05 AUFS 理論上等度方法的開(kāi)發(fā)應(yīng)從強(qiáng)溶劑開(kāi)始,它能在柱空體積處或接近空體積處洗脫每一個(gè)組分.反相色譜方法開(kāi)發(fā)實(shí)例1色譜柱: C18 , 4色譜柱: C18 4 mm x 30 cm流動(dòng)相: 甲醇, 1% 醋酸, 60/40流 速: 2.5 ml/min樣 品: 1) 撲熱息痛 2) 咖啡因 3) 水楊酰胺 4) 阿斯匹林檢測(cè)器: UV 254nm, 0.05 AUFS反相色譜方法開(kāi)發(fā)實(shí)例1 洗脫液中水(弱溶劑)的加入可稍微增加k值

6、色譜柱: C18 4 mm x 30 cm反色譜柱: C18 4 mm x 30 cm流動(dòng)相: 甲醇, 1% 醋酸, 40/60流 速: 2.5 ml/min樣 品: 1) 撲熱息痛 2) 咖啡因 3) 水楊酰胺 4) 阿斯匹林檢測(cè)器: UV 254nm, 0.05 AUFS反相色譜方法開(kāi)發(fā)實(shí)例1弱溶劑再增加20% 時(shí),導(dǎo)致使分離更加改善的保留色譜柱: C18 4 mm x 30 cm反相色譜柱: C18 4 mm x 30 cm流動(dòng)相: 甲醇, 1% 醋酸, 30/70流 速: 2.5 ml/min樣 品: 1) 撲熱息痛 2) 咖啡因 3) 水楊酰胺 4) 阿斯匹林檢測(cè)器: UV 254n

7、m, 0.05 AUFS反相色譜方法開(kāi)發(fā)實(shí)例1再增加 10% 的水,得到最終的優(yōu)化分離條件色譜柱: C18 4 mm x 30 cm反相反相色譜方法開(kāi)發(fā)實(shí)例2色譜條件色譜柱：C18，4mm30mm流動(dòng)相：乙腈/水，不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：2ml/min樣品： 對(duì)羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)反相色譜方法開(kāi)發(fā)實(shí)例2色譜條件實(shí)例2:改變?nèi)萘恳蜃?K實(shí)例1譜圖實(shí)例2:改變?nèi)萘恳蜃?K實(shí)例1譜圖通過(guò)改變流動(dòng)相改變選擇性同樣強(qiáng)度的不同溶劑改變色譜柱的

8、影響會(huì)更大實(shí)例2:改變選擇性()通過(guò)改變流動(dòng)相改變選擇性實(shí)例2:改變選擇性()離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動(dòng)相的pH值，抑制樣品離子的電離適用于弱酸性化合物的分離降低流動(dòng)相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的安全范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險(xiǎn)值3-7）之間H+ + Ac-HAc在稀溶液中:離子抑制色譜H+ + Ac-HAc在稀溶液中:離子抑制色譜實(shí)例在乙腈/水及pH=7時(shí)，多數(shù)保留時(shí)間很短，無(wú)法完全分離。離子抑制色譜實(shí)例在乙腈/水及pH=7時(shí)，多數(shù)保留時(shí)間很短，常用緩沖液及其pH值常用緩沖液及其pH值離子對(duì)色譜法在反相色譜流動(dòng)相內(nèi)加入

9、“離子對(duì)”試劑與樣品中可電離的組份形成“對(duì)離子”目的:在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對(duì)試劑的類型PIC A：磷酸季丁銨，適用于酸性組份PIC B：烷基磺酸鹽，適用于堿性組份烷基長(zhǎng)度不同，形成對(duì)離子的能力不同通常有：B5，B6，B7，B8PIC D4：磷酸二丁胺，適用于弱堿離子對(duì)色譜法在反相色譜流動(dòng)相內(nèi)加入“離子對(duì)”試劑離子對(duì)色譜機(jī)理離子對(duì)色譜機(jī)理離子對(duì)色譜的應(yīng)用抗組胺及減充血?jiǎng)┧幬锏姆治鯟CCCOOOHOHNNCHCH2NHCH3HONHCCH3OOCH2CH3CHCHHOCH3NH2OCH3CH2NNCH2CH2NCH3CH31.馬來(lái)酸 Maleelc Acid2.去氧腎上腺素 Phen

10、ylephrine3.N-去甲麻黃堿 Phenylpropanolamine4.鹽酸萘甲唑啉 Naphazooline5.菲那西丁 Phenacetin6.新安替根 Pyrilamine離子對(duì)色譜的應(yīng)用抗組胺及減充血?jiǎng)┧幬锏姆治鯟CCCOOOHO使用五烷基磺酸鹽(PICB5)使用五烷基磺酸鹽(PICB5)使用六烷基磺酸鹽(PICB6)使用六烷基磺酸鹽(PICB6)使用七烷基磺酸鹽(PICB7)使用七烷基磺酸鹽(PICB7)樣品濃度對(duì)分析的影響0.02AU0.2AUPIC-B7的濃度很低,為0.001M,在樣品濃度較大時(shí), 第號(hào)峰由于PIC不足而分叉,見(jiàn)右圖樣品濃度對(duì)分析的影響0.02AU0.2

11、AUPIC-B7的濃度離子對(duì)色譜分析水溶性維生素離子對(duì)色譜分析水溶性維生素用不同的離子對(duì)試劑色譜柱mBondaPak C18 3.9mm300mm溶劑1.MeOH/H2O,PIC-B7 2.MeOH/H2O,PIC-B5 3.MeOH/H2O,PIC-B7/B51.如用PIC-B7，在分開(kāi)的情況下，保留時(shí)間太長(zhǎng)2.如用PIC-B5，峰分不開(kāi)3.如用PIC-B7加B5，各組份分開(kāi)，且保留時(shí)間合適用不同的離子對(duì)試劑色譜柱mBondaPak C18 離子對(duì)色譜 - 水溶性維生素離子對(duì)色譜 - 水溶性維生素對(duì)氨基苯甲酸與 PIC A試劑色譜柱: Bondapak C18 4 mm x 30 cm流動(dòng)相

12、: MeOH:H2O, 50:50 含 PIC A流 速: 2.0 ml/min檢測(cè)器: UV, 254 nm 對(duì)氨基苯甲酸與 PIC A試劑色譜柱: Bondapak對(duì)氨基苯甲酸與 PIC B7試劑色譜柱: Bondapak C18 4 mm x 30 cm流動(dòng)相: MeOH:H2O, 50:50 含 PIC B-7流 速: 2.0 ml/min檢測(cè)器: UV, 254 nm 對(duì)氨基苯甲酸與 PIC B7試劑色譜柱: Bondap離子對(duì)色譜的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):可用反相色譜分析離子離子和中性化合物可在同一次色譜分析中完成通過(guò)選擇不同的PIC試劑可使選擇性得到驚人的改善,特別是對(duì)中性和離子型溶質(zhì)缺點(diǎn):

13、PIC 試劑的平衡較慢 推薦專用色譜柱作離子對(duì)分析當(dāng)心 PIC 試劑在甲醇,乙腈等溶劑中沉淀當(dāng)心用過(guò)的離子對(duì)試劑的化學(xué)污染離子對(duì)色譜的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):用離子對(duì)？還是離子抑制？用離子對(duì)？還是離子抑制？什么是梯度方法90/10, CH3CN/H2O80/20, CH3CN/H2O梯度:流動(dòng)相的組成或流速隨洗脫時(shí)間的變化而變化什么是梯度方法90/10, CH3CN/H2O80/20, 梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)單位時(shí)間的分離能力增加檢測(cè)靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測(cè)方式色譜柱需再生定量分析的重復(fù)性較低梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)梯度洗脫的方式高壓梯度及低壓梯度溶劑 A溶劑 B泵 A泵 B混合器A 高壓梯度溶劑

14、 A溶劑 B比例閥（溶劑混合點(diǎn)）混合器B 低壓梯度（溶劑混合點(diǎn)）泵梯度洗脫的方式高壓梯度及低壓梯度溶劑 A溶劑 B泵 A泵 B梯度滯后:系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無(wú)色譜柱時(shí))滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測(cè)器進(jìn)樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼 器、混合器及其管路比例閥檢測(cè)器進(jìn)樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器梯度滯后:系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無(wú)色譜柱時(shí))滯滯后體積大小的影響滯后體積太大會(huì)引起梯度變化的延遲例如滯后體積為 2.0ml，流速 1.0ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚 2 分鐘響

15、應(yīng)，沒(méi)有問(wèn)題對(duì)微柱色譜影響更大，如上例，流速0.1ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚20 分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會(huì)使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會(huì)使方法不能重現(xiàn)普通HPLC的滯后體積為24ml對(duì)分析型HPLC沒(méi)有影響對(duì)作微柱實(shí)驗(yàn)用梯度時(shí)影響較大，因此應(yīng)選滯后體積小的液相色譜儀，以適應(yīng)梯度實(shí)驗(yàn)滯后體積大小的影響滯后體積太大會(huì)引起梯度變化的延遲梯度洗脫的可變參數(shù)A,B液的化學(xué)特性 和配比梯度的起終點(diǎn)及陡度梯度變化的路徑 (梯度曲線形狀)梯度洗脫的可變參數(shù)A,B液的化學(xué)特性梯度曲線的變化凹線梯度曲線的變化凹線梯度曲線的變化凸線梯度曲線的變化凸線梯度平衡時(shí)間的影響10分鐘的梯度，6分鐘的

16、平衡時(shí)間色譜圖不重復(fù)梯度平衡時(shí)間的影響10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時(shí)間色譜圖不重梯度平衡時(shí)間的影響平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說(shuō)明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個(gè)時(shí)間時(shí)，平衡充足梯度平衡時(shí)間的影響平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)間有水中有機(jī)污染物的影響50ml超純水的有機(jī)物污染狀態(tài)水中有機(jī)污染物的影響50ml超純水的有機(jī)物污染狀態(tài)水中有機(jī)污染物的影響典型的“實(shí)驗(yàn)室水”有大量的有機(jī)污染物不適合高靈敏度梯度分析水中有機(jī)污染物的影響典型的“實(shí)驗(yàn)室水”有大量的有機(jī)污染物不適梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第一步Curve 60 - 100%開(kāi)發(fā)一個(gè)有9個(gè)

17、烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的條件下(0-100% 乙腈- 水)，分離不理想。整個(gè)色譜峰組保留時(shí)間太長(zhǎng)，分離度也不好。梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第一步Curve 6開(kāi)發(fā)一個(gè)有9個(gè)烷基梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第二步Curve 650 - 100%為使色譜峰前移，提高起始時(shí)乙腈的比例(50-100%， 乙腈- 水),分離得到改善。但是9個(gè)化合物出了10個(gè)色譜峰，說(shuō)明有雜質(zhì)存在，很可能是流動(dòng)相水中的梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第二步Curve 6為使色譜峰前移，提梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第三步Curve 650 - 100%從空白梯度圖顯示，在同樣的色譜條件，同樣的檢測(cè)靈敏度下，共有兩個(gè)雜質(zhì)峰。說(shuō)

18、明流動(dòng)相水中的雜質(zhì)在此條件下可能會(huì)對(duì)檢測(cè)有影響。梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第三步Curve 6從空白梯度圖顯示，梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第四步Curve 650 - 100%空白梯度圖同樣品的色譜圖進(jìn)行對(duì)照后，我們看到雜質(zhì)（共兩個(gè)峰）中的第一個(gè)小峰對(duì)第8個(gè)色譜峰有干擾，會(huì)使其定量分析結(jié)果不準(zhǔn)確。梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第四步Curve 6空白梯度圖同樣品的梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第五步Curve 550 - 95%根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用5 #曲線使3-9號(hào)峰提前(曲線5，50-100%B)，但是小峰仍未分出來(lái)，改用50-95%B見(jiàn)到變好的趨勢(shì)梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第五步Curve 5根據(jù)“梯度曲線下的梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例 - 第六步Curve 45