實(shí)驗(yàn)三血清球蛋白的分離純化及鑒定七制

1、實(shí)驗(yàn)三血清球蛋白的分離純化及鑒定七年制第一頁，共三十九頁。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?學(xué)習(xí)鹽析法、凝膠層析和離子交換層析分離純 化蛋白質(zhì)的基本原理及應(yīng)用2掌握醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)的原理及應(yīng)用3了解蛋白質(zhì)分離純化的總體思路第二頁，共三十九頁。 【實(shí)驗(yàn)方法】 一、鹽析法粗分-球蛋白 二、凝膠過濾方法脫鹽 三、離子交換層析方法純化-球蛋白 四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定-球蛋白的純度 第三頁，共三十九頁。【基本原理】 蛋白質(zhì)的分離、純化及鑒定是研究蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)功能的重要手段之一。 不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及在一定條件下，帶電的情況等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。第四頁，共三十九頁

2、。分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法層析法 電學(xué)法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析在分離純化時(shí)，根據(jù)情況選用幾種方法，相互配合才能達(dá)到分離純化一種蛋白質(zhì)的目的。第五頁，共三十九頁?！净驹怼?本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過濾、離子交換層析方法，分離純化血清-球蛋白。最后用醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定-球蛋白的純度。 第六頁，共三十九頁。實(shí)驗(yàn)思路分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定先粗后細(xì)離子交換層析純化第七頁，共三十九頁。一、鹽析法粗分離血清-球蛋白 鹽析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在不同濃度的中性鹽溶液中溶解度不

3、同，分別析出，達(dá)到彼此分離的方法。 本實(shí)驗(yàn)在半飽和硫酸銨溶液中，清蛋白溶解，球蛋白將沉淀析出，經(jīng)離心所得的沉淀即為球蛋白的粗提液。第八頁，共三十九頁。定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。 原理: 破壞蛋白質(zhì)兩個(gè)穩(wěn)定因素： 水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)不變性，常用。鹽析法第九頁，共三十九頁。鹽析步驟取離心管一支加入血清 2ml加入2ml 0.9%氯化鈉搖勻邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和(NH4)2SO4 4ml上清液（主要含清蛋白）傾去靜置10min，再離心（5000轉(zhuǎn)/分）10min沉淀用1ml 0.9%氯化鈉攪拌

4、溶解逐滴加飽和(NH4)2SO4 2ml,搖勻靜置10min，再離心（5000轉(zhuǎn)/分）10min傾棄上清液（主要含、球蛋白）沉淀即為初步純化的球蛋白加入0.0175mol/L磷酸緩沖液（pH=6.3)1ml溶解球蛋白粗提液第十頁，共三十九頁。二、葡聚糖凝膠柱層析脫鹽 欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量鹽，通常有兩種方法： 凝膠層析法、透析本試驗(yàn)采用葡聚糖凝膠Sephadex G 25層析方法除去球蛋白粗提液中的鹽硫酸銨，以便下一步用離子交換層析方法進(jìn)一步提純球蛋白。 第十一頁，共三十九頁。凝膠層析原理：P31 凝膠層析法是按混合物各組分分子量大小不同隨流動(dòng)相經(jīng)過層析柱的時(shí)間不同而被分離的

5、技術(shù)。 凝膠是一類具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的干燥顆粒，當(dāng)吸收一定量溶液后溶漲成柔軟、富有彈性、不帶電荷、不與溶質(zhì)相互作用的惰性物質(zhì)，凝膠層析以其為固定相。層析時(shí)，直徑大于凝膠網(wǎng)孔的大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動(dòng)相向下移動(dòng)，所以流程短、流速快，首先流出層析柱；而小分子物質(zhì)直徑小于凝膠網(wǎng)孔能自由出入，洗脫時(shí)間長，后流出層析柱，經(jīng)過一定時(shí)間層析，分子大小不同的物質(zhì)彼此分開，達(dá)到分離的目的。 第十二頁，共三十九頁。凝膠層析法脫鹽第十三頁，共三十九頁。凝膠柱層析脫鹽第十四頁，共三十九頁。分子篩層析第十五頁，共三十九頁。數(shù)學(xué)模型 Vo Vi VtVi凝膠孔內(nèi)水（內(nèi)水）Vo顆粒間水（

6、外水）Vg凝膠體積總體積Vt= Vi +Vo+Vg第十六頁，共三十九頁。Kd 分配系數(shù)：精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗脫行為，反映物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度，是溶質(zhì)分子大小的一個(gè)函數(shù)Ve洗脫體積：分離物被洗脫時(shí)所用的洗脫液體積 Kd=(Ve-Vo)/Vi 洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度/吸光度為縱坐標(biāo)作圖第十七頁，共三十九頁。（1）完全被排阻的極端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+KdVi，0Kd1（3）完全滲透的小分子，Ve=Vo+Vi， Kd=1第十八頁，共三十九頁。 Sephadex G-25的準(zhǔn)備 裝柱（1520cm）操作步驟：1、層析柱保

7、持垂直。2、放蒸餾水，排出空氣，關(guān)閉出口。3、加入攪拌均勻的SephadexG-25懸液，調(diào)節(jié)流速10滴/min，使凝膠均勻沉降，不斷補(bǔ)充，直至18cm。4、上留1-2mm的水，關(guān)閉出口。 注意： 床面上要保持少許水，防止膠床露出液面。 膠面不平，用玻棒輕輕攪動(dòng)，讓凝膠自然沉降， 使表面平整。第十九頁，共三十九頁。 加樣與洗脫 凝膠的再生1、加樣：用滴管將鹽析后樣品加入柱床面，打開出口使樣品 溶液滲入凝膠。2、洗脫：加入洗脫液，打開出口，保持流速10滴/min，收 集洗脫液，每管收集1ml。用奈氏試劑檢測(cè)NH4+。3、保存：20%璜基水楊酸溶液檢測(cè)洗脫液的蛋白質(zhì)，保存 含量高的進(jìn)一步純化 不斷

8、加洗脫液，使NH4+全部流出，為下次實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備第二十頁，共三十九頁。脫鹽 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10上樣球蛋白， 粗提液 裝柱 葡聚糖凝膠G-25， 柱高18-20cm流速：每分鐘10滴左右 加入洗脫劑收集 20滴換一支試管第二十一頁，共三十九頁。.層析后洗脫液檢測(cè)白色比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加奈氏試劑（檢測(cè)NH4+）,另一塊滴加20%璜基水楊酸（檢測(cè)蛋白質(zhì)）。不用滴管,避免污染,直接倒用“-”表示無現(xiàn)象，用“+”, “+”, “+”等表示顏色深淺 回收凝膠第二十二頁，共三十九頁。注意事項(xiàng)： 1 . 凝膠柱的制備質(zhì)量決定分離效果的好壞 。 2. 加樣分離時(shí)，滴速越慢，分離效

9、果越好。 以管號(hào)為橫軸，蛋白質(zhì)含量為縱軸繪制洗脫曲線，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第二十三頁，共三十九頁。三、DEAE纖維素離子交換層析 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1. 通過使用DEAE纖維素離子交換層析法，進(jìn)一步 純化-球蛋白脫鹽液，得到較純的-球蛋白溶液 2. 學(xué)習(xí)了解離子交換層析方法的基本原理和應(yīng)用第二十四頁，共三十九頁。離子交換層析的基本原理 離子交換層析是一種常用的、通過使用各種類型的離子交換劑達(dá)到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通過化學(xué)反應(yīng)將帶電基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的固體物質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)中作為固定相。如果其帶負(fù)電，則能結(jié)合陽離子，成為陽離子交換劑；如果其帶正電，則能結(jié)合陰離子，稱為陰離子交換劑?？筛鶕?jù)

10、實(shí)驗(yàn)需要，選擇不同的離子交換劑進(jìn)行離子交換層析。 DEAE （二乙基氨基乙基）纖維素含有可離子化的堿基，可與氫離子結(jié)合，成為帶正電荷的陰離子交換劑。 第二十五頁，共三十九頁。DEAE纖維素離子交換層析純化球蛋白 血清、球蛋白、清蛋白的等電點(diǎn)為： 清蛋白pI=4.64， 2球蛋白 pI=5.06， 球蛋白pI=5.12， 球蛋白pI=7.3 本實(shí)驗(yàn)采用0.0175 mol/l pH6.5 NH4Ac緩沖液進(jìn)行洗脫。此pH，DEAE帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的、-球蛋白和清蛋白結(jié)合，而帶正電荷的-球蛋白不與DEAE結(jié)合，首先從層析柱中洗脫出來，首先收集到的既是純化的-球蛋白。第二十六頁，共三十九頁。操

11、 作 將脫鹽后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同凝膠過濾），用0.0175 mol/l pH 6.3 NH4Ac緩沖液洗脫，流速10滴15滴/分，用小試管連續(xù)收集流出液（約1.0 ml/管），用20%磺基水楊酸溶液檢查蛋白質(zhì)分布情況，收集含量最高的部分，濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫下來的是球蛋白。第二十七頁，共三十九頁。.使用離心機(jī)的操作注意事項(xiàng)。.裝柱時(shí)檢查是否漏水。.裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。.柱床面保持有緩沖液。.加樣時(shí)動(dòng)作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。.每用一次滴管，請(qǐng)用水清洗干凈，防止試劑及被測(cè)樣品交叉污染。第二十八頁，共三十九頁。四、球蛋白純化液的濃縮 利用葡聚糖

12、凝膠富含羥基，吸水，不允許大分子蛋白進(jìn)入微孔的特性，在樣品溶液中加少量凝膠，離心，濃縮蛋白。 每ml純化球蛋白溶液加Sephadex G-25 0.25 g，搖動(dòng)23分鐘，離心3000r/min，5分鐘，上清即為濃縮-球蛋白（或用冷凍干燥儀使其濃縮）。 第二十九頁，共三十九頁。五、球蛋白鑒定 用醋酸纖維素薄膜電泳的方法，以血清電泳圖譜為對(duì)照，鑒定所分離的蛋白質(zhì)種類和純度（參見血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳）。 第三十頁，共三十九頁。蛋白質(zhì)的電離示意圖 第三十一頁，共三十九頁。基本原理1、以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。2、在pH8.6巴比妥緩沖液中，血清蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中均帶負(fù)電荷，向正極移

13、動(dòng)。3、帶電荷多、分子量相對(duì)小的泳動(dòng)速度快；帶電荷少、分子量相對(duì)大的泳動(dòng)速度慢。第三十二頁，共三十九頁。血清蛋白質(zhì)乙酸纖維素薄膜電泳第三十三頁，共三十九頁。清蛋白12 加樣線加樣線純化蛋白對(duì)照樣品第三十四頁，共三十九頁。醋酸纖維素薄膜電泳鑒定 點(diǎn)樣 ：全血清：點(diǎn)樣一次 脫鹽后的粗蛋白溶液：點(diǎn)樣35次 濃縮后的純球蛋白溶液：點(diǎn)樣35次 第三十五頁，共三十九頁。醋酸纖維素薄膜電泳電泳條件： 電壓：90110 V； 時(shí)間：50分鐘。染 色：電泳畢，關(guān)電源。取出薄膜浸入盛有氨基黑10B染色液的染色缸中染色5分鐘，用2.5 %醋酸洗脫液漂洗，直至背景呈白色。以血清蛋白圖譜為對(duì)照，觀察提純物屬哪種蛋白，其純度如何？ 第三十六頁，共三十九頁。操作步驟：1、裝置電泳箱。區(qū)分電泳箱正負(fù)極 。2、點(diǎn)