病理學研究中常用的分子生物學基本技術及其應用課件

病理學研究中常用的分子生物學基本技術及其應用

病理教研室王婭蘭分子病理學基本概念

現(xiàn)代分子生物學vs傳統(tǒng)病理學疾病發(fā)生過程中分子事件及其與疾病發(fā)生的關系揭示根本機制復習有關的分子生物學概念(1)核酸的結構與功能核酸---多核苷酸。

核酸由核苷酸組成核苷酸由堿基、核糖/脫氧核糖和磷酸構成堿基有五種：

A腺嘌呤T胸腺嘧啶U尿嘧啶

G鳥嘌呤C胞嘧啶核苷酸連接方式核酸----DNA（脫氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）DNA和RNA的差別從結構上看DNA：含脫氧核糖及胸腺嘧啶ACGTRNA：含核糖及尿嘧啶ACGU從功能上看DNA：構成染色體內(nèi)的基因組、細胞器基因組，是遺傳信息的貯存和

攜帶者

RNA：包括mRNA(信使RNA),rRNA(核糖體RNA),tRNA(轉移RNA)，分別進行轉錄、轉譯的功能DNA結構一級結構

即DNA分子中脫氧核苷酸的排列順序堿基順序就代表了核苷酸順序。又稱為核苷酸序列或堿基序列二級結構

即DNA分子的雙螺旋結構這種雙螺旋結構的一個重要特征是：在一定條件下，雙鏈可解開，亦可重新形成雙鏈三級結構

DNA超螺旋結構

DNA復制

雙鏈解鏈各自為模板合成新的互補鏈

DNA轉錄

以DNA為模板合成RNA過程

DNA翻譯

蛋白質(zhì)合成的同義詞以遺傳密碼破讀的手段轉變?yōu)榈鞍踪|(zhì)的氨基酸排列順序如GGC——甘氨酸GTC——頡氨酸遺傳信息貯存于DNA，在核內(nèi)通過轉錄成mRNA，在胞漿內(nèi)mRNA作直接模板來指導翻譯(2)基因(gene)基因表達是指基因的轉錄翻譯以及它們的調(diào)控轉錄在胞核內(nèi)進行，翻譯在胞漿中進行(3)染色質(zhì)(chromatin)主要成分是DNA和蛋白質(zhì)，細胞間期,光鏡下呈細顆粒狀染色體（chromatosome）

主要成分同上，細胞分裂期，由染色質(zhì)濃集而成，呈桿狀,有恒定數(shù)目真核生物基因組單復制順序（singlecopysequence）在整個DNA分子中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次中等重復順序

(moderatelyrepetitivesequences)在DNA分子中重復出現(xiàn)幾十到幾千次高重復順序(highlytepetitivesequence)在DNA分子中重復幾百萬次反轉重復順序(invertedrepetitivesequerce)

其特點是一段堿基呈回文結構

回文結構（palindromicstructure）又稱發(fā)夾結構(hairpinstructure)如：5’AAGCTAGCTT3’3’TTCGATCGAA5’其中一條單鏈回折又可形成雙鏈3’TTCGA

∣∣∣∣∣5’AAGCT內(nèi)含子與外顯子內(nèi)含子（intron）或插入順序外顯子（exon）DNA變性定義變性后性質(zhì)變性條件DNA復性（renaturation）退火一.病理學研究中常用的分子生物學基本技術(一)核酸分子雜交（nucleicacidmolecularhybridisation）技術

概念具有一定同源性的核酸單鏈一定條件下堿基互補退火形成雙鏈用帶有標記的具有特殊堿基序列（已知堿基序列）的一段DNA或RNA單鏈片段來檢測靶核酸（待測核酸）中是否存在與之同源的序列

已知的核酸序列——即探針（probe）

探針標記1.固相雜交(solid-phasehybridization)概念

固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳酸顆粒、磁珠和微孔板等基本方法：在此以膜相為例(1)DNA變性：使DNA由雙鏈解鏈成為單鏈。是成功的關鍵(2)變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定(3)預雜交(4)雜交(5)洗膜(6)結果顯示斑點雜交應用于DNA斑點雜交RNA斑點雜交對于培養(yǎng)細胞，不必提取和純化RNA，只需簡單處理(0.5%NonidetP40低滲緩沖液)

完整細胞斑點雜交NaOH處理，使DNA暴露可用于篩選大量標本，但它不適用于非放射性標記探針(DNA純度不夠)斑點雜交的特點優(yōu)點

A操作簡便、快速，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電泳分離核酸樣品B可在同一張膜上進行多個樣品的檢測C可作半定量分析缺點A不能鑒定所測基因的相對分子量B特異性較差，有一定比例的假陽性(3)印跡雜交（blottinghybridization)southern印跡雜交

（southernblottinghybridization）1975年由Southern創(chuàng)建多用限制性內(nèi)切酶將DNA切成片段進行凝膠電泳分離（分開）,凝膠上使DNA變性原位將單鏈DNA片段轉移固相支持物上再與相應的已標記的探針進行雜交反應用放射性自顯影或酶反應顯色，確定探針互補的每一條DNA帶的位置可用于DNA圖譜分析

基因克隆鑒定（克隆基因的酶切圖譜分析）

基因構成研究（基因組的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態(tài)性分析（RFLP）等。），northern印跡雜交（Northernblottinghybridization）其被測樣品是RNA方法與southern印跡雜交類似

此法常用于基因表達的研究，可推算出癌基因的表達程度(4)原位雜交（insituhybridization）核酸原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）的簡稱已知堿基順序并帶有標記的核酸作為探針與細胞組織切片中待測的核酸特異性結合成雜交體應用與標記物相應的檢測系統(tǒng)在被檢測的核酸原位檢測雜交信號首創(chuàng)放射性標記(1969)熒光素標記(1981)生物素標記(1983)

其與菌落原位雜交不同原位雜交可以確定探針的互補序列在細胞內(nèi)的空間位置C不需要從組織中提取核酸

D可完整的保持組織與細胞的形態(tài)，準確反映其與組織細胞的相互關系原位雜交與免疫組化方法結合免疫組化

檢測抗原成分，在翻譯水平上研究基因表達

原位雜交檢測DNA/RNA，進行基因定位，在基因擴增或在轉錄水平上研究基因表達原位雜交的探針單鏈DNA雙鏈DNARNA探針基本方法(RNA雜交為例)

A.雜交前準備

固定盡快予以冷凍/固定

培養(yǎng)細胞、新鮮組織、石蠟包埋組織均可進行原位雜交通常石蠟包埋信號低于冰凍切片C.雜交后處理D.顯示

如AP顯色系統(tǒng)NBT（四氮唑藍）顯色等有兩種方法:

直接法直接標記探針

間接法抗原標記探針,雜交后,再用特異性標記的抗體反應,在呈色雙重原位雜交方法

通常有兩種方法

A.用相鄰的連續(xù)切片（3μ），用兩種不同的探針進行原位雜交

適用于較大細胞的研究優(yōu)點

二者雜交過程和結果互不干擾

顯示方法和呈色可用同一檢測系統(tǒng)，敏感性相同，可比性強缺點

雜交信號可能因切片較薄而減弱尋找同一細胞的切面進行分析有一定困難B.用兩種探針在同一標本上作原位雜交，兩種不同標記探針的雜交陽性信號呈色不同(5)熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）技術基本原理生物素、地高辛或熒光素標記特異的DNA探針對外周血、腫瘤細胞或癌前組織的離散培養(yǎng)細胞的染色體鋪片或切片（包括石蠟切片）DNA-DNA原位雜交熒光素標記抗探針標記物的抗體其雜交定位信號用熒光法顯示?？捎枚喾N熒光素的不同顏色顯示多個染色體的結構或DNA。如FITC

(fluorescienisothiocy-anate,異硫氰酸熒光素)——呈黃綠色

Texas紅——呈紅色特點

操作簡易，快捷,探針標記后穩(wěn)定方法敏感在同一標本上可以同時檢測幾個不同的基因不僅可以在染色體分裂相上觀察結果，而且可以應用于培養(yǎng)的間期細胞，組織的石蠟切片、冰凍切片應用

臨床應用

應用非常廣泛研究應用

腫瘤中染色體異?；驁D譜繪制確定基因在染色體上的順序(6)其它雜交方法

A.差異雜交（differentialhybridization）B.cDNA微點陣雜交（cDNAmicroarrayhybridization）C.

寡核苷酸微點陣雜交

（oligonucleotidemicroarrayhybridization）

2.液相雜交

（solutionhybridization）所參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中(1)吸附雜交方法HAP（羥基磷灰石）吸附雜交方法(DNA:DNA)親和吸附雜交方法(DNA:RNA)生物素標記DNA探針?；H和素包被固相支持物用特異性抗DNA-RNA雜交物的酶標單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應酶顯色磁珠吸附雜交方法吖啶翁酯（acridiniumester）標記探針吸附在磁化的有孔小珠(2)發(fā)光液相方法能量傳遞法兩個緊接的探針，一個探針的一端用化學發(fā)光基團（供體）標記，另一個探針的一端用熒光物質(zhì)標記，并且這兩個探針靠得很近。由于只有在兩個探針分子靠得很近時，才能產(chǎn)生發(fā)光具有較好的特異性

吖啶翁酯標記法檢測雜交探針的化學發(fā)光此法敏感度低僅適用于檢測擴增的靶序列(3)液相夾心雜交方法親和雜交方法兩個探針與靶核酸雜交，形成夾心結構。雜交物上的吸附探針可結合到固相支持物上雜交物上的檢測探針可產(chǎn)生檢測信號一般用生物素標記吸附探針，用125I標記檢測探針該試驗保持了固相雜交的高度特異性(二)聚合酶鏈反應及其相關技術1.聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction,PCR）技術又稱體外基因擴增利用DNA變性和復性原理在體外進行特定的DNA片段高效擴增的技術獲得或放大特異基因信號的重要手段基本原理

在模板DNA（待測DNA）引物（模板兩端的已知序列）四種脫氧核苷酸(dNTP)DNA聚合酶依賴的酶促合成反應擴增的特異性取決于引物與模板DNA整個步驟分三步變性加熱模板DNA成兩條單鏈退火降溫模板DNA與引物互補結合延伸DNA聚合酶及鎂離子形成與模板鏈互補的新DNA鏈三步為一個循環(huán)DNA量增加1倍25-30個循環(huán)DNA可增加106-109倍

PCR反應體系組分包括引物DNA聚合酶PCR反應緩沖液dNTPs（四種核苷酸）實際操作中,分別有不同的要求和注意事項反應條件應不斷優(yōu)化如變性復性延伸溫度及時間循環(huán)參數(shù)鎂離子濃度平臺效應防止污染等

PCR模板（待測DNA）細菌全血標本或白細胞新鮮組織石蠟包埋組織

但各自的制備方法各異

PCR擴增產(chǎn)物的檢測分析

凝膠電泳分析瓊脂糖凝膠電泳(最常用)聚丙烯酰胺凝膠電泳單一條帶點雜交方法將產(chǎn)物直接點到膜上2.PCR相關技術(1)定量PCR最常用的為競爭性PCR

(2)逆轉錄PCR(RT-PCR)

用來擴增RNA的方法

由mRNA逆轉錄（reversetranscription,RT）反應產(chǎn)生的cDNA第一條鏈作PCR的模板

(3)競爭逆轉錄PCR(competitivereversttranscription-polymerasechainreaction,c-RT-PCR)(4)多重PCR(multiplexPCR)

(5)反向PCR(inversePCR)對已知DNA片段兩側未知序列進行擴增(6)不對稱PCR

(7)錨定PCR

(8)著色互補試驗或熒光PCR(9)雙溫PCR(two-temperaturePCR)(10)原位PCR（insituPCR,ISPCR）技術90年Hasse首次創(chuàng)建概念在細胞(爬片,甩片,涂片)組織切片(冰凍/石蠟)直接對核酸進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法

既能在組織原位檢測單復制的特定DNA/RNA又能使擴增的特定的DNA/RNA片段在組織切片中定位特點1.PCR特異性高敏感性,又有原位雜交樣的定位準確性2.能檢測低于2個拷貝量的細胞內(nèi)特定的DNA序列3.有助于細胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學變化的結合分析基本方法

A.細胞或組織切片上滴加PCR反應液B.把載玻片放入熱循環(huán)儀（原位PCR儀）中進行擴增C.進行原位擴增產(chǎn)物檢測

分類A.直接法原位PCR(directinsituPCR)

基本原理對三磷酸核苷酸或引物進行標記使擴增產(chǎn)物直接攜帶標記分子據(jù)標記物性質(zhì)進行產(chǎn)物的檢測

標記物

最常用的有三種

放射性同位素生物素地高辛特點

操作簡便特異性較差易出現(xiàn)假陽性擴增效率低應用注意事項

a.不能用于切片標本b.不適用于研究內(nèi)源性基因重排和染色體易位

B．間接原位PCR(indirectinsitu,PCR)基本原理同常規(guī)PCR,不帶任何標記物再利用原位雜交方法加以檢測

主要步驟

標本固定保持原有組織細胞的形態(tài)結構

滲入使引物核苷酸和酶等反應液進入細胞內(nèi)(如用酶進行消化)

原位擴增通過原位PCR技術（原位PCR儀）增加靶核酸序列的數(shù)量，以達到可檢測的水平

原位雜交檢測用特異性探針檢測產(chǎn)物特點

步驟雖然較多，但擴增效率高，特異性較直接法強

在原位PCR中常用的原位雜交標記物

非同位素標記物如生物素地高辛等C．原位反轉錄PCR

(insitureversetranscription,PCR)又稱為insituRT-PCR結合反轉錄反應（以mRNA為模板合成cDNA）和PCR擴增檢測細胞內(nèi)低復制mRNA的方法

基本原理

它由mRNA經(jīng)逆轉錄反應產(chǎn)生cDNA鏈（即在逆轉錄酶的催化下，以mRNA為模板合成cDNA）

再以cDNA為模板，用PCR對靶序列進行擴增擴增結束后，再用特異性的探針進行原位雜交

整個反應過程均在固定的組織或細胞標本上進行

標本要用DNA酶處理

原位PCR的應用

1)檢測內(nèi)源性基因

固有基因的檢測異?；蜃儺惢?/p>

2)外源性基因的檢測

感染基因病毒基因細菌基因

導入基因原位PCR應用中存在的問題及對策

敏感性特異性產(chǎn)生假陽性原因(直接法)錯配核苷酸錯誤摻入受損DNA修復;擴增產(chǎn)物彌散對策熱啟動減少彌散復雜性定量分析目前還停留在相對定量或半定量水平(11)免疫聚合酶鏈反應（immunopolymerasechainreaction,immuno-PCR,簡稱免疫PCR）技術由Sano等于1992年首建基本原理單克隆抗體進行生物素化核苷酸（DNA）也生物素化用親和素或鏈霉親和素將兩者連接構成具有雙功能的嵌合分子單抗--生物素--中介分子--生物素--DNA

(親和素)與抗原結合PCR擴增抗體端可以與抗原結合，特異性地捕獲待測抗原，以保證檢測結果的特異性，核酸（DNA）端則可用引物對其進行擴增，通過對擴增產(chǎn)物的檢測，間接證明抗原的存在。產(chǎn)物可用瓊脂糖電泳檢測采用不同大小標準的DNA進行標記，進行電泳檢測，則可同時檢出不同的抗原分子。(12)原位免疫PCR（insituimmuno-PCR,IS-PCR）技術

基本原理中介分子同時與DNA和抗體分子特異結合其一端連接DNA（DNA作為標記物）另一端連接抗原-抗體復合物形成一個抗原-抗體-DNA連接物作為標記物的DNA分子用原位PCR擴增，檢測特異的PCR產(chǎn)物，即可間接地證明抗原的存在

中介分子鏈酶親和素（SA）-蛋白A嵌合體(三)用引物介導的原位標記（primedinsitulabelling,PRINS）技術用于細胞或染色體原位檢測特異性DNA/RNA基本原理PCR和FISH技術的結合

dUTP（用熒光素如FITC標記）和dATPdCTP,dGTP摻入延伸的DNA中，使新合成的DNA帶有熒光素,用熒光顯微鏡檢測地高辛標記再用免疫細胞化學顯色普通光學顯微鏡檢測特點及應用前景

1.快速，簡便也適用于組織切片2.敏感性和特異性較高.3.具有很高的快速性4.地高辛標記，適用于普通顯微鏡觀察，避免了標本熒光素標記褪色快的缺點5.不需使用DNA或cDNA探針，只需要特異性引物序列，合成簡便(四)

基因重組技術基因重組是基因克隆的關鍵技術。其基本內(nèi)容包括分離純化或人工合成DNA制備DNA重組體轉化宿主細胞篩選表達重組DNA的宿主細胞使其擴增鑒定目的基因的正確連接及表達主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝目的基因的獲得通常所需要的目的基因都是一些已有相關基礎研究的基因

常用方法

1.PCR擴增目的基因2.從基因組文庫或cDNA文庫中獲得目的基因3.人工合成目的基因DNA體外重組載體常用的有

質(zhì)粒載體最常用的是pBR322

噬菌體（phage）載體最常用的為λDNA及其衍生物重組DNA轉化宿主細胞重組體克隆的篩選與鑒定酶切、電泳、雜交等方法(五)

基因轉染（genetransfection）技術將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細胞內(nèi)，并在細胞內(nèi)表達的技術方法有磷酸鈣介導的轉染法DEAE葡聚糖介導轉染法脂質(zhì)體介導轉染法電擊基因轉染法二.腫瘤研究中常用的分子生物學技術

(一)基因擴增的檢測1.原位雜交（ISH）2.熒光原位雜交（FISH）3.Southernblot(DNA雜交)4.Northernblot(RNA雜交)5.原位PCR6.RT_PCR(二)基因突變的檢測突變的幾種形式點突變基因特定位置發(fā)生一個核苷酸的改變基因缺失基因易位或重排其他：插入甲基化染色體非組蛋白改變等突變的檢測方法1.聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性分析（Singlestrandconformationpolymorphismanalysisofpolymerasechainreactionproducts,PCR-SSCP）

長度相同，但堿基序列不同的單鏈DNA構象不同,在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，遷移率（泳動率）不同基本方法

作PCR將產(chǎn)物變性而成為單鏈進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

顯示結果

可用同位素/熒光素標記電泳后用相應方法檢測(標記在PCR時進行)

非同位素標記電泳后銀染顯色。特點P