談慢性鋁暴露對(duì)大鼠海馬鈣離子穩(wěn)態(tài)及CaMKⅡ和CREB 活性的影響論文

談慢性鋁暴露對(duì)大鼠海馬鈣離子穩(wěn)態(tài)及CaMKⅡ和CREB活性的影響論文談慢性鋁暴露對(duì)大鼠海馬鈣離子穩(wěn)態(tài)及CaMKⅡ和CREB活性的影響論文鋁(Al)是一種慢性神經(jīng)毒性物質(zhì)，隨著鋁的生物利用度增加，其與很多神經(jīng)變性疾病密切相關(guān)，包括阿爾茨海默病(AD)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、帕金森癡呆和海灣戰(zhàn)爭(zhēng)綜合征。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Al鹽可引起很多動(dòng)物腦內(nèi)構(gòu)成神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)病理變化，如兔、貓、小鼠、大鼠和猴。最新的研究結(jié)果也證實(shí)，Al暴露可導(dǎo)致腦內(nèi)產(chǎn)生AD樣病理變化以及認(rèn)知障礙，并且飲水中Al含量與AD患者死亡率呈正相關(guān)。慢性Al暴露能夠加強(qiáng)AD患者腦內(nèi)NFT和Aβ的構(gòu)成，進(jìn)而增加淀粉樣斑塊的體積和數(shù)量。在神經(jīng)元中，鈣離子(Ca2+)持續(xù)性升高可造成神經(jīng)毒性，與急慢性神經(jīng)退行性病變中的神經(jīng)損傷密切相關(guān)。神經(jīng)元內(nèi)的Al能夠影響靜息Ca2+水平，減慢Ca2+流出細(xì)胞質(zhì)。同時(shí)，Al能夠抑制調(diào)節(jié)Ca2+的相關(guān)蛋白表達(dá)。因而，了解鋁暴露對(duì)Ca2+穩(wěn)態(tài)的影響對(duì)于明確鋁神經(jīng)毒性的機(jī)制，具有特別重要的意義。Ca2+/鈣調(diào)蛋白(CaM)依靠的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是神經(jīng)細(xì)胞興奮性轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)的關(guān)鍵媒介，也是突觸可塑性改變的關(guān)鍵蛋白。此外，cAMP反響元件結(jié)合蛋白(CREB)是CaMKⅡ的下游分子之一，在突觸可塑性中具有重要作用，激活CREB可促進(jìn)多種與突觸可塑性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生一些與學(xué)習(xí)記憶特別相關(guān)的蛋白分子。研究表明，Al在腦內(nèi)特定的敏感區(qū)域內(nèi)選擇性地沉積，如海馬區(qū)等。但是，慢性Al暴露對(duì)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)以及其下游CaMKⅡ、CREB信號(hào)分子活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。1材料與方法1.1主要材料選擇60只斷乳后Wistar大鼠(體重約30g)，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。CREB抗體、磷酸化(p)-CREB抗體(CellSignal公司);CaMKⅡ抗體、p-CaMKⅡ抗體、神經(jīng)顆粒素(Ng)抗體(美國(guó)SANTACruz公司)、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(北京中杉生物公司);ECL發(fā)光試劑(美國(guó)Sigma公司)、Chemilmager5500V2103(美國(guó))。其他試劑均為分析純。1.2動(dòng)物模型建立將60只(AlCl3)大鼠隨機(jī)分3組，每組20只。對(duì)照組用蒸餾水喂養(yǎng)，Al暴露組分別用含有0.2%和0.4%氯化鋁的蒸餾水喂養(yǎng)。動(dòng)物室溫度保持在18℃～23℃、相對(duì)濕度為45%～55%，光照時(shí)間12h∶12h。Al暴露大鼠保持健康，體重為對(duì)照大鼠的(90±6)%。3個(gè)月后，進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)及其他生化指標(biāo)測(cè)定。1.3Morris水迷宮測(cè)定大鼠學(xué)習(xí)記憶行為參考文獻(xiàn)的方法，Morris水迷宮測(cè)試在內(nèi)徑180cm、高60cm的圓形水池中進(jìn)行。水深48cm，水溫為(22±0.5)℃，水池內(nèi)放入奶粉使之成為乳白色。將水池分為西南、西北、東南和東北(SW、NW、SE和NE)四個(gè)象限，NW象限正中距池壁20cm處放置逃避平臺(tái)(直徑約8cm)，平臺(tái)位于水下2cm。水池正上方安裝帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤計(jì)時(shí)并記錄游泳軌跡，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)迷宮外參照物保持不變。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，簡(jiǎn)單地講，實(shí)驗(yàn)大鼠天天游泳4次，分別從不同象限將動(dòng)物頭朝池壁入水，并在水池上標(biāo)定一樣一點(diǎn)作為每次實(shí)驗(yàn)大鼠的入水點(diǎn)，尋找平臺(tái)時(shí)間上限設(shè)置為120s。假如在規(guī)定時(shí)間內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺(tái)并停留30s以加強(qiáng)記憶，緩解緊張情緒。逃避潛伏期記錄為120s，每只大鼠的游泳時(shí)間間隔為15min。觀察和記錄120s內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、在原平臺(tái)象限搜索時(shí)間占總時(shí)間的百分比和在原平臺(tái)象限搜索距離占總距離的百分比，并記錄大鼠在120s內(nèi)搜索平臺(tái)的道路圖?？臻g探索實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行1次。1.4腦組織和血液中Al含量測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)，準(zhǔn)確分離并稱取各組大鼠海馬組織(約0.1～0.5g)或準(zhǔn)確汲取0.2～0.5ml的全血于石英燒杯中，放入聚四氟乙烯(PTFE)中，參加5～8ml混酸(硝酸∶高氯酸體積比為4∶1)，同時(shí)做空白對(duì)照。低溫加熱至試樣全部溶解，繼續(xù)加熱蒸發(fā)至近干后加0.2%硝酸溶解殘留物，并以0.2%硝酸定容至50ml，采用石墨爐原子吸收分光光度法測(cè)定腦鋁或血鋁含量。1.5大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量測(cè)定〔20〕冰上分離大鼠海馬組織后，放入D-Hank液中。37℃下用0.125%胰酶消化20min，反復(fù)吹打后離心，制備密度為106～107個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色，確定分離出的單細(xì)胞存活率在95%以上。將終濃度為4μmol/L的Fura-2/AM參加上述分離出來(lái)的細(xì)胞懸液中，37℃下孵育35min后，用含0.2%BSA的Hank液清洗殘留的Fura-2/AM。然后，將細(xì)胞重懸于無(wú)Mg2+的Hank液中(mmol/L):HEPES10，KCl5.0，NaCl145，CaCl21.3，L-glucose10，Na2HPO4。采用日立F-3000型熒光雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞Ca2+濃度。激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)定為340～380nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為510nm。根據(jù)下面公式計(jì)算Ca2+濃度〔Ca2+〕i=Kd〔(R-Rmin)/(Rmax-R)〕(Fmin/Fmax)。Kd值為224nmol/L，R為熒光值，〔Ca2+〕i為nmol/L，而Fmin為參加EGTA后測(cè)得的熒光值，F(xiàn)max為參加TritonX-100后測(cè)得的'熒光值。1.6逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)冰上分離各組大鼠海馬組織，根據(jù)TRIzol講明書(shū)(Invitrogen，USA)抽提各組海馬組織的總RNA。應(yīng)用紫外分光光度儀測(cè)定RNA樣品260/280nm波長(zhǎng)處吸光度比值為1.9～2.0。根據(jù)試劑盒講明書(shū)要求，采用oligo(dT)和superscriptⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，用雙標(biāo)記熒光探針混合物(SYBRGreenPCRMastermix)在ABIprism7500自動(dòng)序列分析系統(tǒng)(Biosystems)中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，每組重復(fù)3次。CaMKⅡ基因引物特異序列分別為5-AGCCATCCTCACCACTAT-3(上游)和5-CTTCACGCCATCATTCTTC-3(下游);CREB基因引物特異序列分別為:5-CCAGCCATCAGTTATTCAGT-3(上游)和5-TTACACTATCCACAGACTCCT(下游);β-actin作為內(nèi)參照，其引物特異序列為5-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3(上游)和5-GGATCTTCATGAGGTAGTCAG-3。兩種基因擴(kuò)增結(jié)果用β-actin進(jìn)行標(biāo)化。1.7免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)采用頸椎脫臼法處死大鼠，冰上分離大鼠海馬，剔除血管。在每個(gè)裝有海馬的離心管中，根據(jù)1∶9比例參加裂解液(10mmol/LTris-HClpH7.5，1mmol/LEDTA，1mmol/LEGTA，100mmol/LNaCl，50mmol/LNaF，1%TritonX-100，1mmol/LNa3VO4，1mmol/LPMSF)，1μg/ml亮肽素，1μg/ml抑蛋白酶(SantaCruz，USA)，50mmol/Lβ-glycerolphosphate，1mmol/L二硫蘇糖醇和0.09%Brij-35。4℃下超聲粉碎后27000g離心1.5h，取上清，即總蛋白提取液。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度，取50μg總蛋白，采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(110V，2h)。待電泳完成后，把蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)上。分別用抗tCREB、p-CREB(Ser133)(1∶100)、Ng(1∶500)、p-CaMKⅡ(1∶500)和β-actin(1∶1000)抗體孵育，最后參加HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗，ECL發(fā)光并成像分析。1.8免疫組化檢測(cè)蛋白表達(dá)各組大鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌流固定后取海馬組織，30%蔗糖(用4%多聚甲醛配置)后固定48h，冷凍切片(40μm/片)。分別經(jīng)0.3%過(guò)氧化氫甲醇溶液、0.3%Triton-100處理后，0.01mol/LPBS清洗5min×3次。參加一抗CaMKⅡ(1∶200)4℃孵育過(guò)夜、二抗(1∶1000)室溫下孵育2h、DAB法顯色。1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS11.0軟件，組間資料統(tǒng)計(jì)用單因素方差分析(ANOVA)。采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析評(píng)估行為學(xué)數(shù)據(jù)。2結(jié)果2.1慢性Al暴露可誘導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果表明，與對(duì)照組相比擬，鋁暴露各組大鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)、在原平臺(tái)象限搜索時(shí)間占總時(shí)間的百分比和在原平臺(tái)象限搜索距離占總距離的百分比顯著降低(P0.05);在慢性Al暴露各組之間，0.4%AlCl3組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和搜索距離明顯低于0.2%AlCl3組(P0.05)，呈現(xiàn)劑量依靠性;各組搜索時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.2慢性Al暴露可增加大鼠血Al和海馬組織內(nèi)Al的含量與對(duì)照組相比擬，Al暴露各組大鼠的血液和海馬組織中Al含量明顯增加(P0.05);在Al暴露各組大鼠之間，0.4%AlCl3__組大鼠的血Al和海馬組織Al含量明顯高于0.2%組(P0.05)。2.3慢性Al暴露可增加大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的自由鈣離子(〔Ca2+〕i)濃度與對(duì)照組相比，Al暴露各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)〔Ca2+〕i明顯增高，從(155.75±15.33)nmol/L(對(duì)照組)分別增至(515.92±53.59)nmol/L(0.2%AlCl3組)和(646.87±62.32)nmol/L(0.4%AlCl3組);與0.2%AlCl3組相比，0.4%AlCl3組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)〔Ca2+〕i顯著升高(P0.05)。2.4慢性Al暴露對(duì)CaMKⅡ和CREBmRNA表達(dá)的影響各組CaMKⅡ及CREBmRNA表達(dá)無(wú)顯著變化(P0.05)。對(duì)照組設(shè)為1，0.2%AlCl3組與0.4%AlCl3組CaMKⅡmRNA表達(dá)量分別為0.98±0.21、1.11±0.18，CREBmRNA表達(dá)量分別為0.99±0.19、1.03±0.15。2.5慢性Al暴露對(duì)CaMKⅡ和CREB總蛋白表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示，各組CaMKⅡ染色密度元顯著差異(P0.05)。同時(shí)，Western印跡結(jié)果也顯示(圖1)，各組CREB總蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P0.05)，CREB總蛋白表達(dá)分別為0.55±0.065(對(duì)照組)、0.54±0.062(0.2%AlCl3組)和0.57±0.064(0.4%AlCl3組)(P0.05)。2.6慢性Al暴露影響學(xué)習(xí)記憶關(guān)鍵蛋白分子CaMKⅡ和CREB的活性與對(duì)照組相比，Al暴露組大鼠海馬組織中p-CaMKⅡ、Ng和p-CREB表達(dá)水平均明顯降低(P0.05);同時(shí)，隨著Al暴露濃度的增加，p-CaMKⅡ、Ng和p-CREB表達(dá)逐步降低，呈劑量依靠性(P0.05)。3討論Al暴露因素是AD發(fā)病機(jī)制中研究最多的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素。Al在神經(jīng)系統(tǒng)中的蓄積可產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，進(jìn)而引起智力和認(rèn)知能力的缺欠。同時(shí)，AD患者腦Al含量較高，神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NTFs)中含有高濃度的Al。因而，研究Al暴露與AD的關(guān)系特別重要。Morris水迷宮行為學(xué)評(píng)估結(jié)果證實(shí)，慢性Al暴露確實(shí)能夠造成大鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷，這些結(jié)果與以往國(guó)內(nèi)外一些研究的結(jié)果類似。Ca2+對(duì)真核細(xì)胞的代謝及各種生理功能具有特別重要的作用，并且細(xì)胞外Ca2+濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。此外，在神經(jīng)系統(tǒng)中，Ca2+作為最基本的第二信使，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、調(diào)控突觸可塑性，甚至是基因表達(dá)。有研究表明，Al3+離子半徑與Ca2+類似，能夠與Ca2+結(jié)合位點(diǎn)作用，進(jìn)而在一定程度上影響細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)。在體外培養(yǎng)的條件下，Al暴露后可顯著提高星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，慢性Al暴露可顯著提高大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，并呈劑量依靠性。此結(jié)果與慢性Al暴露可顯著增加神經(jīng)突觸內(nèi)鈣濃度的研究結(jié)果類似。CaMKⅡ是空間學(xué)習(xí)和記憶的分子基礎(chǔ)，Ca2+內(nèi)流可磷酸化激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ從細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)到突觸并結(jié)合NMDA型谷氨酸受體，而CaMKⅡ-NMDA受體復(fù)合物是誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程加強(qiáng)的關(guān)鍵分子。研究表明，在LTP后期，CaMKⅡ具有放大并強(qiáng)化突觸可塑性的構(gòu)造性功能。我們的結(jié)果證實(shí)，慢性Al暴露并未影響大鼠海馬區(qū)CaMKⅡ總蛋白的表達(dá)，但是卻降低了p-CaMKⅡ的表達(dá)，講明Al暴露可抑制CaMKⅡ的活性。Ng是一種突觸后蛋白，能夠與CaM單體結(jié)合，對(duì)于CaMKⅡ的活性具有重要的影響。研究表明，Ng增高能夠增加CaMKⅡ激活，進(jìn)而加強(qiáng)突觸可塑性;而在Ng敲除的小鼠中，CaMKⅡ的活性也明顯降低。我們的結(jié)果表明，Al暴露能夠降低大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中Ng的蛋白表達(dá)。因而，總體來(lái)講，慢性Al暴露干擾了大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)，降低了p-CaMKⅡ和Ng的蛋白表達(dá)，這可能是Al暴露誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶損傷、誘導(dǎo)AD發(fā)病的機(jī)制之一。CREB是一種分子量為43kD的核轉(zhuǎn)錄因子蛋白，對(duì)于神經(jīng)突觸可塑性長(zhǎng)時(shí)間的改變具有特別重要的作用。CREB上的絲氨酸(Ser)133是很多蛋白激酶的作用靶點(diǎn)，例如CaMKⅡ和Ⅳ、蛋白激酶A和蛋白激酶C