冷凍切片技術(shù)

第二章生物組織冷凍切片技術(shù)冷凍切片技術(shù)第1頁冷凍切片技術(shù)冷凍切片（frozensection）是一個在低溫條件下，將動物、植物組織快速冷卻到一定硬度，然后進行切片方法。因其制作過程較石蠟切片快捷、簡便，而應(yīng)用廣泛。冷凍切片種類較多，有低溫恒冷箱冷凍切片法，二氧化碳冷凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冷凍切片法等。冷凍切片技術(shù)第2頁2.1CM

1900介紹CM

1900是徠卡貢獻給廣大用戶用于各種已知低溫冷凍切片真正有效儀器。冷凍切片機用來將生物組織標本快速冷凍后，將標本在低溫狀態(tài)下進行微米級超薄切片，為生物組織分析研究提供快速優(yōu)良組織切片。特點：

·新型CM

1900特色之一是含有大型冷凍室，可冷卻到-35°C?！ぴ搩x器還提供一個獨立樣品冷卻系統(tǒng)，樣品夾溫度調(diào)整范圍到達-10°C到-50°C，可進行不一樣類型樣品切片，每一樣品托有各自獨立溫度，并可在很短時間內(nèi)到達所需溫度,快速冷凍臺保持在-45°C，可同時放多達10個樣品，并和一個可連續(xù)冷卻吸熱器相連，可確保樣品托上樣品快速冷卻.高質(zhì)量，無焊接縫不銹鋼冷凍室表面光滑，利于清潔和預防污染。冷凍切片技術(shù)第3頁規(guī)格參數(shù)：1.

切片厚度：1至60um2.

最大樣品：55

mm直徑3.

樣品臂前后移動：25

mm4.

樣品臂上下移動：59

mm5.

樣品臂前后移動速度：0.8mm/秒

冷凍箱溫度:0至-35℃6.

冷凍箱降溫至:-35℃約4小時7.

除霜功能:以熱氣9分鐘除霜,可自因為二十四小時內(nèi)設(shè)置開始時間8.可隨時按制即時除霜.快速冷凍臺:至-45℃9.

機身大小(長/深/高):890/730/1200mm10.

機身重量(連機切片):180kg11.

獨特雙壓縮作樣品快速冷凍及穩(wěn)定冷凍切片溫度12.

樣品快速冷凍:-10℃至-50℃冷凍切片技術(shù)第4頁2.2操作冷凍切片技術(shù)第5頁冷凍切片技術(shù)第6頁冷凍切片技術(shù)第7頁冷凍切片技術(shù)第8頁冷凍切片技術(shù)第9頁冷凍切片技術(shù)第10頁冷凍切片技術(shù)第11頁冷凍切片技術(shù)第12頁冷凍切片技術(shù)第13頁冷凍切片技術(shù)第14頁冷凍切片技術(shù)第15頁冷凍切片技術(shù)第16頁冷凍切片技術(shù)第17頁冷凍切片技術(shù)第18頁冷凍切片技術(shù)第19頁冷凍切片技術(shù)第20頁2.3維護冷凍切片技術(shù)第21頁冷凍切片技術(shù)第22頁2.4故障排除冷凍切片技術(shù)第23頁冷凍切片技術(shù)第24頁冷凍切片技術(shù)第25頁冷凍切片技術(shù)第26頁冷凍切片技術(shù)第27頁冷凍切片技術(shù)第28頁2.5.冷凍切片一點體會取材，未能固定組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為正方或長方體：1×1×0.5cm；0.5×0.5×0.5cm。取出組織支承器，放平擺好組織，周圍滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細小組織，滴上包埋劑。將冷凍好組織塊，夾緊于切片機持承器上，開啟粗進退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。調(diào)好欲切厚度，依據(jù)不一樣組織而定，標準上是細胞密集薄切，纖維多細胞稀可稍為厚切，普通在5～10um間。冷凍切片技術(shù)第29頁調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板調(diào)整上，這就要求操作者要細心，準確地將其調(diào)很好，調(diào)校至適當位置。切片時，切出切片能在第一時間順利地經(jīng)過刀防卷板間通道，平整地躺在持刀器鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。應(yīng)視不一樣組織選擇不一樣冷凍度。冷凍箱中冷凍度高低，主要依據(jù)不一樣組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時，冷凍箱中溫度不能調(diào)太低，在-10--15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調(diào)在-15～20℃左右，切帶脂肪組織時，應(yīng)調(diào)至-25℃左右，切含大量脂肪時，應(yīng)調(diào)至-30℃。冷凍切片技術(shù)第30頁2.6冰凍切片時注意事項：

防卷板及切片刀和持刀架上板塊應(yīng)保持潔凈，需經(jīng)慣用毛筆挑除切片殘余和用柔軟紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因為這個地方是切片經(jīng)過和附貼地方，假如有殘余包埋劑粘于刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放于不一樣支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據(jù)不一樣編號，依序切片，這么做既不費時也不會亂。冷凍切片技術(shù)第31頁放置組織冰凍前，應(yīng)視組織形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，假如胡亂放置，就不能收到很好效果。組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水固定液，在未到達固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了組織，反而增加了切片難度。假如使用未完全固定組織做冰凍切片，就會出現(xiàn)冰晶。這是因為含水固定液在組織未經(jīng)固定前，其中水份也可滲透到組織中去，當冰凍發(fā)生時，這些水份就存留于組織中，形成了冰晶。冷凍切片技術(shù)第32頁當切片時，假如發(fā)覺冰凍過分時，可將冰凍組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點。用于附貼切片載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出載玻片與冷凍箱中切片有一個溫度差，當溫度較高載玻片附貼上溫度較低切片時，因為兩種物質(zhì)間溫度差異，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一個吸附力，使切片與載玻片牢靠地附貼在一起。假如使用冷藏載玻片來附貼切片，因為溫度相同，沒有發(fā)生上述現(xiàn)象。冷凍切片技術(shù)第33頁2.7HE染色介紹蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining)，簡稱HE染色法，石蠟切片技術(shù)里慣用染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內(nèi)染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)核糖體著紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中成份著紅色。HE染色法是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛技術(shù)方法。冷凍切片技術(shù)第34頁染色結(jié)果細胞核被蘇木精染成鮮明藍色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍色，粘液呈灰藍色。細胞漿被伊紅染成深淺不一樣粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。著色情況與組織或細胞種類相關(guān)，也隨其生活周期及病理改變而改變。比如，很多細胞在新生時期胞漿對伊紅著色較淡或輕度嗜堿，當其衰老時或發(fā)生退行性變則展現(xiàn)嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現(xiàn)透明變性時，伊紅著色由淺變深。冷凍切片技術(shù)第35頁2.7.1試劑配置0.5~1%伊紅酒精溶液：稱取伊紅Y0.5~1g，加少許蒸餾水溶解后，再滴加冰醋酸直至漿糊狀。以濾紙過濾，將濾渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工業(yè)酒精，假如不怕浪費，用無水乙醇配制也可）100毫升溶解。冷凍切片技術(shù)第36頁蘇木素染液配方：(配制3000ml，可按比列降低)蘇木精6g無水乙醇100ml硫酸鋁鉀150g蒸餾水ml碘酸鈉1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：將蘇木素溶于無水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水，溶解后將甘油傾入一起混合，最終加入冰醋酸和碘酸鈉。冷凍切片技術(shù)第37頁1%鹽酸酒精分化液：將1毫升濃鹽酸加入99毫升70%酒精中即可。促藍液：1%濃氨水溶液（1：99）冷凍切片技術(shù)第38頁2.7.2改進冷凍切片HE染色步驟固定切好切片用95%乙醇95ml+