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Carryover是我們?nèi)粘I锓治龉ぷ髦薪?jīng)常遇到的問(wèn)題,Carryover過(guò)大將會(huì)影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。糾其原因,個(gè)人認(rèn)為有與很多因素有關(guān),下面我結(jié)合自己和其他老員工的經(jīng)驗(yàn),總結(jié)了一下Carryover的解決方法。1)首先要判斷Carryover的來(lái)源,對(duì)癥治療才能快速、高效的解決問(wèn)題。在排除污染和interference等因素后,需要確定Carryover是來(lái)源于進(jìn)樣針、進(jìn)樣閥、色譜柱還是系統(tǒng)管線等組件,具體的方法是:進(jìn)樣針第一種方法是其他條件都不變,在Run了一針ULOQ后,再進(jìn)少量空氣,看看Carryover是否比先前的小,如果小了說(shuō)明針上有殘留,根據(jù)減小的程度可判斷化合物在針上殘留的比例;如果不變,說(shuō)明殘留不在針上。第二種方法是在Run了一針ULOQ后,用一根新針或洗干凈的舊針再進(jìn)一針Blank,看看Carryover對(duì)比先前的變化,同樣,如果小了說(shuō)明針上有殘留;如果不變,說(shuō)明殘留不在針上。第三種方法:在Run了一針ULOQ后,將CTC進(jìn)樣針卸掉,然后提交一針任何樣品,觀察Carryover的變化也能判斷針上是否有殘留。色譜柱第一種方法:在Run了一針ULOQ后,換一根同類(lèi)型的柱子,然后進(jìn)一針Blank,看看Carryover對(duì)比先前的變化,同樣,如果小了說(shuō)明柱上有殘留;如果不變,說(shuō)明殘留不在色譜柱上。第二種方法:在采集方法液相梯度后再增加一個(gè)相同的梯度,然后進(jìn)一針ULOQ,如果在ULOQ出峰后特定的位置出現(xiàn)一個(gè)小峰,則說(shuō)明柱子上有殘留,根據(jù)殘留對(duì)比之前Carryover的變化,確定化合物在柱上殘留的比例。進(jìn)樣閥確定針和柱子上的殘留后,再來(lái)判斷進(jìn)樣閥上的殘留,殘留的位置主要是進(jìn)樣閥的定子和轉(zhuǎn)子的磨合處,判斷的簡(jiǎn)單方法是在采集方法液相梯度G1后再增加一個(gè)相同的梯度G2,然后進(jìn)一針ULOQ,在G1運(yùn)行完后手動(dòng)切換進(jìn)樣閥,如果在相應(yīng)的位置出現(xiàn)一個(gè)小峰,則說(shuō)明閥上有殘留(注意扣除柱子上的殘留)。另外還有一種方法就是在Run了一針ULOQ后,換一個(gè)干凈的同類(lèi)型閥,然后進(jìn)一針Blank,看看Carryover的變化,也可確定閥上的殘留比例。(注意:不要輕易拆卸和更換進(jìn)樣閥,尤其是對(duì)進(jìn)樣閥結(jié)構(gòu)原理不大熟悉的同事,避免安裝不好帶來(lái)其他的不確定性,如有必要,請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系TDG組或者換臺(tái)儀器試試)。管線除了進(jìn)樣針、進(jìn)樣閥、色譜柱外,殘留還有可能存在于系統(tǒng)管線中(特別是柱前管線),管線彎曲的太厲害或者系統(tǒng)壓力過(guò)大,Peek管線會(huì)出現(xiàn)死角和裂縫,同時(shí)系統(tǒng)壓力過(guò)大可能會(huì)增加整個(gè)管路的死體積,這些都可能帶來(lái)Carryover和不好的色譜峰形。因此判斷Carryover的來(lái)源,可先從進(jìn)樣針和色譜柱開(kāi)始然后再是閥,一般情況下,殘留應(yīng)該在這三個(gè)地方,為了提高判斷的準(zhǔn)確性,每個(gè)特定的來(lái)源(針,柱子,閥)最好應(yīng)用兩種方法加以確認(rèn)。2)如果Carryover來(lái)源于進(jìn)樣針,具體的解決方法有:A.換一口新針。(殘留可能是因?yàn)獒樌匣耍〣.換不同材質(zhì)的進(jìn)樣針。(我這邊可以嘗試從HPLC轉(zhuǎn)移到UPLC,但注意UPLC死體積小,相同條件下,出峰位置會(huì)靠前,而且UPLC有三種進(jìn)樣方式,每種進(jìn)樣方式對(duì)應(yīng)的靈敏度,峰形和Carryover很可能有所不同)。C.嘗試不同的洗針液,針對(duì)化合物的性質(zhì),強(qiáng)弱洗針液可以高低有機(jī)相,高低酸堿性,一酸一堿或一堿一酸搭配,一般弱洗液(WASH2)應(yīng)與起始流動(dòng)相相當(dāng)。(洗針液中我們有時(shí)可考慮加入少許IPA和DMSO等溶劑以增加黏度和溶解強(qiáng)度,還可以加入一些揮發(fā)性的醋酸銨,甲酸銨等改善洗針液離子強(qiáng)度,萬(wàn)不得已可加入少量表面活性劑試試看)。D.加大洗針次數(shù)。3)如果Carryover來(lái)源于色譜柱,具體的解決方法有:如果是柱子老化了或污染了,建議換一根新柱。如果殘留與柱子的性質(zhì)有關(guān),可試試其它類(lèi)型的色譜柱。在之前的梯度后增加一個(gè)類(lèi)似的梯度(整個(gè)采集時(shí)間會(huì)延長(zhǎng))。更換不同的流動(dòng)相,調(diào)整液相梯度也是一個(gè)不錯(cuò)的方法,液相方法最好能有利于色譜柱再生。等度比梯度更有利于降低殘留。4)如果Carryover來(lái)源于進(jìn)樣閥,具體的解決方法有:有時(shí)前面項(xiàng)目所用的流動(dòng)相及其添加劑,洗針液,進(jìn)樣溶液等可能會(huì)在閥和系統(tǒng)管路中殘留而對(duì)當(dāng)前項(xiàng)目有所影響,建議有針對(duì)性的沖沖管路,最好沖管路的同時(shí)手動(dòng)切換進(jìn)樣閥,使定子與轉(zhuǎn)子之間的殘留物洗凈,必要時(shí)可將進(jìn)樣閥拆卸超聲清洗。換不同類(lèi)型的進(jìn)樣閥,如金屬的換成Peek材質(zhì)的。有些殘留是我們?cè)谶B接管線時(shí)引起的,比如Peek頭切割的不規(guī)整,連接不夠緊密等,例如下圖兩個(gè)短的Peek頭相鄰連接,造成兩個(gè)Peek頭都無(wú)法與進(jìn)樣閥緊密相連,產(chǎn)生空隙,導(dǎo)致峰形不佳,殘留嚴(yán)重。正確的連接應(yīng)是:5)其它的解決方法有:在靈敏度允許的情況下,減小進(jìn)樣量可減少Carryover。反相色譜多用金屬進(jìn)樣閥,正相色譜多用Peek進(jìn)樣閥。洗針液的瓶子不應(yīng)密封且其放置高度最好高于出口端。待續(xù)??偠灾?,Carryover的解決是一個(gè)系統(tǒng)工程,如能一招制敵,建議改天去買(mǎi)點(diǎn)彩票吧
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