如何解決HPLC的殘留問題

Carryover是我們?nèi)粘Ｉ锓治龉ぷ髦薪?jīng)常遇到的問題，Carryover過大將會(huì)影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。糾其原因，個(gè)人認(rèn)為有與很多因素有關(guān)，下面我結(jié)合自己和其他老員工的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了一下Carryover的解決方法。1）首先要判斷Carryover的來源，對(duì)癥治療才能快速、高效的解決問題。在排除污染和interference等因素后，需要確定Carryover是來源于進(jìn)樣針、進(jìn)樣閥、色譜柱還是系統(tǒng)管線等組件，具體的方法是：進(jìn)樣針第一種方法是其他條件都不變，在Run了一針ULOQ后，再進(jìn)少量空氣，看看Carryover是否比先前的小，如果小了說明針上有殘留，根據(jù)減小的程度可判斷化合物在針上殘留的比例；如果不變，說明殘留不在針上。第二種方法是在Run了一針ULOQ后，用一根新針或洗干凈的舊針再進(jìn)一針Blank,看看Carryover對(duì)比先前的變化，同樣，如果小了說明針上有殘留；如果不變，說明殘留不在針上。第三種方法：在Run了一針ULOQ后，將CTC進(jìn)樣針卸掉，然后提交一針任何樣品，觀察Carryover的變化也能判斷針上是否有殘留。色譜柱第一種方法：在Run了一針ULOQ后，換一根同類型的柱子，然后進(jìn)一針Blank,看看Carryover對(duì)比先前的變化，同樣，如果小了說明柱上有殘留；如果不變，說明殘留不在色譜柱上。第二種方法：在采集方法液相梯度后再增加一個(gè)相同的梯度，然后進(jìn)一針ULOQ，如果在ULOQ出峰后特定的位置出現(xiàn)一個(gè)小峰，則說明柱子上有殘留，根據(jù)殘留對(duì)比之前Carryover的變化，確定化合物在柱上殘留的比例。進(jìn)樣閥確定針和柱子上的殘留后，再來判斷進(jìn)樣閥上的殘留，殘留的位置主要是進(jìn)樣閥的定子和轉(zhuǎn)子的磨合處，判斷的簡(jiǎn)單方法是在采集方法液相梯度G1后再增加一個(gè)相同的梯度G2，然后進(jìn)一針ULOQ，在G1運(yùn)行完后手動(dòng)切換進(jìn)樣閥，如果在相應(yīng)的位置出現(xiàn)一個(gè)小峰，則說明閥上有殘留（注意扣除柱子上的殘留）。另外還有一種方法就是在Run了一針ULOQ后，換一個(gè)干凈的同類型閥，然后進(jìn)一針Blank,看看Carryover的變化，也可確定閥上的殘留比例。（注意：不要輕易拆卸和更換進(jìn)樣閥，尤其是對(duì)進(jìn)樣閥結(jié)構(gòu)原理不大熟悉的同事，避免安裝不好帶來其他的不確定性，如有必要，請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系TDG組或者換臺(tái)儀器試試）。管線除了進(jìn)樣針、進(jìn)樣閥、色譜柱外，殘留還有可能存在于系統(tǒng)管線中（特別是柱前管線），管線彎曲的太厲害或者系統(tǒng)壓力過大，Peek管線會(huì)出現(xiàn)死角和裂縫，同時(shí)系統(tǒng)壓力過大可能會(huì)增加整個(gè)管路的死體積，這些都可能帶來Carryover和不好的色譜峰形。因此判斷Carryover的來源，可先從進(jìn)樣針和色譜柱開始然后再是閥，一般情況下，殘留應(yīng)該在這三個(gè)地方，為了提高判斷的準(zhǔn)確性，每個(gè)特定的來源（針，柱子，閥）最好應(yīng)用兩種方法加以確認(rèn)。2）如果Carryover來源于進(jìn)樣針，具體的解決方法有：A.換一口新針。（殘留可能是因?yàn)獒樌匣耍〣.換不同材質(zhì)的進(jìn)樣針。（我這邊可以嘗試從HPLC轉(zhuǎn)移到UPLC，但注意UPLC死體積小，相同條件下，出峰位置會(huì)靠前，而且UPLC有三種進(jìn)樣方式，每種進(jìn)樣方式對(duì)應(yīng)的靈敏度，峰形和Carryover很可能有所不同）。C.嘗試不同的洗針液，針對(duì)化合物的性質(zhì)，強(qiáng)弱洗針液可以高低有機(jī)相，高低酸堿性，一酸一堿或一堿一酸搭配，一般弱洗液（WASH2）應(yīng)與起始流動(dòng)相相當(dāng)。（洗針液中我們有時(shí)可考慮加入少許IPA和DMSO等溶劑以增加黏度和溶解強(qiáng)度，還可以加入一些揮發(fā)性的醋酸銨，甲酸銨等改善洗針液離子強(qiáng)度，萬不得已可加入少量表面活性劑試試看）。D.加大洗針次數(shù)。3）如果Carryover來源于色譜柱，具體的解決方法有：如果是柱子老化了或污染了，建議換一根新柱。如果殘留與柱子的性質(zhì)有關(guān)，可試試其它類型的色譜柱。在之前的梯度后增加一個(gè)類似的梯度（整個(gè)采集時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)）。更換不同的流動(dòng)相，調(diào)整液相梯度也是一個(gè)不錯(cuò)的方法，液相方法最好能有利于色譜柱再生。等度比梯度更有利于降低殘留。4）如果Carryover來源于進(jìn)樣閥，具體的解決方法有：有時(shí)前面項(xiàng)目所用的流動(dòng)相及其添加劑，洗針液，進(jìn)樣溶液等可能會(huì)在閥和系統(tǒng)管路中殘留而對(duì)當(dāng)前項(xiàng)目有所影響，建議有針對(duì)性的沖沖管路，最好沖管路的同時(shí)手動(dòng)切換進(jìn)樣閥，使定子與轉(zhuǎn)子之間的殘留物洗凈，必要時(shí)可將進(jìn)樣閥拆卸超聲清洗。換不同類型的進(jìn)樣閥，如金屬的換成Peek材質(zhì)的。有些殘留是我們?cè)谶B接管線時(shí)引起的，比如Peek頭切割的不規(guī)整，連接不夠緊密等，例如下圖兩個(gè)短的Peek頭相鄰連接，造成兩個(gè)Peek頭都無法與進(jìn)樣閥緊密相連，產(chǎn)生空隙，導(dǎo)致峰形不佳，殘留嚴(yán)重。正確的連接應(yīng)是：5）其它的解決方法有：在靈敏度允許的情況下，減小進(jìn)樣量可減少Carryover。反相色譜多用金屬進(jìn)樣閥，正相色譜多用Peek進(jìn)樣閥。洗針液的瓶子不應(yīng)密封且其放置高度最好高于出口端。待續(xù)?？偠灾?，Carryover的解決是一個(gè)系統(tǒng)工程，如能一招制敵，建議改天去買點(diǎn)彩票吧