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文檔簡(jiǎn)介
第二節(jié)其他氨基酸發(fā)酵氨基酸的生物合成氨基酸生產(chǎn)工藝按照起始物可將氨基酸的合成分成幾個(gè)家族:
1.谷氨酸族(α-酮戊二酸族)谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴氨酸和脯氨酸;
2.丙酮酸族:丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸;
3.天冬氨酸族(草酰乙酸族)天冬氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸和異亮氨酸;
4.磷酸甘油酸族:甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸;
5.芳香族:苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸;另外,組氨酸的合成為單獨(dú)的一條途徑。氨基酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制
反饋抑制與優(yōu)先合成
氨基酸生物合成的基本調(diào)節(jié)機(jī)制有反饋抑制與在合成途徑分支點(diǎn)處的優(yōu)先合成。
反饋抑制:A→B→C→D
ED
優(yōu)先合成:A→B→CFG2)順序控制
EDA→B→CFGA→B→C→D
1)終產(chǎn)物控制
催化分支合成途徑共同部分的初始酶,在僅一種氨基酸終產(chǎn)物過(guò)剩時(shí),完全不受或微弱或部分地反饋抑制(或阻遏),只是在多數(shù)終產(chǎn)物共存下才強(qiáng)烈地控制。有以下幾種情況:①協(xié)同(或多價(jià))反饋抑制②合作(或增效)反饋抑制③同功酶控制④積累反饋抑制生產(chǎn)公司及國(guó)別
Archer
Daniels
Midland
Company
(USA)Biokyowa
Incorporated
Heartland
Lysine,
Inc.
法國(guó)歐洲氨基酸公司
意大利
Bio-Italia
S.P.A
斯羅法克
俄羅斯
日本味之素公司
印度尼西亞
韓國(guó)
泰國(guó)
生產(chǎn)能力(t/a)
12000013600
20000
50000
1500010000
1600015000
20000
3000010000
備注
日本公司在美國(guó)的工廠
日本公司在美國(guó)的工廠
與德國(guó)Degussa合資工廠
一、賴氨酸發(fā)酵我國(guó)賴氨酸主要生產(chǎn)單位及生產(chǎn)能力
企業(yè)名稱
生產(chǎn)能力(t/a)
原料路線
廣西桂元賴氨酸有限責(zé)任公司(原廣西賴氨酸廠)
10000
糖蜜,
1997年底擴(kuò)建完成
川化味之素有限公司
10000
玉米淀粉,1997底擴(kuò)建完成
福建大泉賴氨酸公司
6500
玉米淀粉
吉林長(zhǎng)春大成生化工程開(kāi)發(fā)有限公司
15000
引進(jìn)技術(shù),2000年建成
谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌突變類型:缺陷型、敏感型、抗結(jié)構(gòu)類似物和組合型突變株。1.天冬氨酸族生物合成途徑
天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸為原料,合成蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸。甲硫氨酸琥珀酰高絲氨酸合成酶草酰乙酸→天冬氨酸→天冬氨酸磷酸→天冬氨酸-β-半醛→高絲氨酸→蘇氨酸
DAP合成酶異亮氨酸
二氨基庚二酸→賴氨酸2.天冬氨酸族生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制
在細(xì)菌中,雖然天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑是相同的,但是其代謝調(diào)節(jié)機(jī)制是多種多樣的。1)大腸桿菌K12(同功酶調(diào)節(jié))①天冬氨酸激酶(三個(gè))②天冬氨酸-β-半醛脫氫酶(兩個(gè))③DAP合成酶(賴氨酸分支的第一個(gè)酶)④高絲氨酸合成酶(HD)(通向蘇氨酸、蛋氨酸分支的第一個(gè)酶)2)黃色短桿菌(協(xié)同反饋抑制)
賴氨酸生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制中天冬氨酸激酶只有一種。3)乳糖發(fā)酵短桿菌賴氨酸合成調(diào)節(jié)微生物賴氨酸合成途徑不同:
1)為經(jīng)過(guò)二氨基庚二酸的生物合成途徑,如細(xì)菌,DAP;
2)是AAA,酵母菌、霉菌經(jīng)過(guò)α-氨基己二酸AAA途徑合成賴氨酸。3.賴氨酸生產(chǎn)菌的育種途徑出發(fā)菌株的選擇:
要求代謝比較簡(jiǎn)單的細(xì)菌(如黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳酸發(fā)酵短桿菌等)1)優(yōu)先合成的轉(zhuǎn)換:滲漏缺陷型的選育。2)切斷支路代謝:營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育。3)抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育(代謝調(diào)節(jié)突變)。4)代謝互鎖解除代謝互鎖的方法:
①選育亮氨酸缺陷型菌株,或者以抗AEC的賴氨酸的生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株,經(jīng)誘變得到抗AEC兼亮氨酸缺陷型菌株。②選育抗亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物的突變株,從遺傳上解除亮氨酸對(duì)DAP合成酶的阻遏。③選育對(duì)苯醌或喹啉衍生物敏感菌株,這是一種尋找亮氨酸滲漏缺陷型菌株的有效方法。5)增加前體物的生物合成和阻塞產(chǎn)物的生成6)改變細(xì)胞膜的透過(guò)性7)選育溫度敏感突變株8)應(yīng)用細(xì)胞工程和遺傳工程育種9)防止高產(chǎn)菌株回復(fù)突變4.賴氨酸發(fā)酵條件控制溶氧:不足,賴氨酸生產(chǎn)受到不可逆抑制;PH:補(bǔ)加氨水;溫度:32℃;前體:甘氨酸或絲氨酸。(短小假單胞菌)二、蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)具有多重標(biāo)記的缺陷型菌株蘇氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株(AHVr)三、異亮氨酸、亮氨酸生產(chǎn)工藝1.異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的生物合成途徑:圖23-4
2.異亮氨酸發(fā)酵兩種方法:添加前體發(fā)酵法和直接發(fā)酵法添加前體發(fā)酵法:
蘇氨酸脫水酶受異亮氨酸的反饋抑制;添加前體物質(zhì)D-蘇氨酸、α-酮基異戊酸;繞過(guò)異亮氨酸對(duì)蘇氨酸脫水酶的反饋抑制。直接發(fā)酵法:
抗反饋調(diào)節(jié)突變株,解除對(duì)蘇氨酸脫水酶的反饋抑制。四、新種分離與篩選的步驟
調(diào)查研究(包括資料查閱)
試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)
含微生物樣品的采集(如何使樣品中含所需微生物的可能性大?)
樣品預(yù)處理
菌種分離
根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點(diǎn)分
選擇性分離方法 隨機(jī)分離方法
(定向篩選←選擇壓力)
(用篩選方案-檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行間接分離)
富集液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng)
(初篩)
菌種純化
復(fù)篩
菌種純化初步工藝條件摸索再?gòu)?fù)篩生產(chǎn)性能測(cè)試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)試驗(yàn)?zāi)承┍匾囼?yàn)和或作為育種的出發(fā)菌株毒性試驗(yàn)等
含微生物樣品的采集采樣時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度樣品的預(yù)處理目的:提高分離效率方法:物理方法:熱處理;膜過(guò)濾法;離心法化學(xué)方法誘餌法分離方法的選擇
根據(jù)目的菌有無(wú)選擇性特征來(lái)選擇分離方法菌種的營(yíng)養(yǎng)特征獨(dú)特
生長(zhǎng)特征獨(dú)特
無(wú)選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進(jìn)行
隨機(jī)分離選擇性分離
選擇性分離原理和技術(shù)生長(zhǎng)條件的選擇與控制原理控制營(yíng)養(yǎng)成分
控制培養(yǎng)基酸堿度
添加抑制劑
控制培養(yǎng)溫度
控制通氣條件
選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)施加選擇壓力,進(jìn)行定向篩選
A.富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式:以最大比生長(zhǎng)速率(μmax)篩選,存在選擇壓力的控制、移種時(shí)間和次數(shù)等問(wèn)題連續(xù)培養(yǎng)方式:以比生長(zhǎng)速率(μ)篩選
μ
ABS0基質(zhì)濃度對(duì)A、B兩種菌的比生長(zhǎng)速率(μ)的影響
當(dāng)S<S0時(shí),富集什么菌株?當(dāng)S>S0時(shí),富集什么菌株?B.固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌
選擇壓力:在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì)
隨機(jī)分離原理與技術(shù)從產(chǎn)物入手,設(shè)計(jì)高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法。技術(shù)關(guān)鍵:產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應(yīng)篩選方法的確定。高產(chǎn)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的幾個(gè)原則
制備一系列的培養(yǎng)基,其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長(zhǎng)限制因素;使用一聚合或復(fù)合形式的生長(zhǎng)限制養(yǎng)分;避免使用容易同化的碳源或氮源,防止分解代謝物阻遏;確定含有所需的輔因子(Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+);使用pH緩沖劑以減少pH變化;前體、促進(jìn)劑及抑制劑的采用。生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的篩選
篩選模型:營(yíng)養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌
篩選方法:利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌生長(zhǎng)氨基酸產(chǎn)生菌的篩選
樣品
預(yù)處理
初篩(除真菌)
在分離平板上生長(zhǎng)獲得多個(gè)單菌落復(fù)印平板(copy法)
平板培養(yǎng),其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對(duì)應(yīng)到copy前相應(yīng)
u.v線殺死長(zhǎng)好的菌落
位置,找到目的菌落
再鋪上一層含營(yíng)養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌的瓊脂
培養(yǎng)后
產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長(zhǎng)圈
目的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng),對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定篩選產(chǎn)物含量高的菌株菌種選育改良的具體目標(biāo)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度,減少副產(chǎn)物改良菌種性狀,改善發(fā)酵過(guò)程改變生物合成途徑,以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品
五、代謝工程
利用多基因重組技術(shù)有目的地對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造,改變細(xì)胞特性,并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合,為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑,生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新的學(xué)科領(lǐng)域。又稱作途徑工程,是多基因的基因工程。
代謝網(wǎng)絡(luò)理論:是把細(xì)胞的生化反應(yīng)以網(wǎng)絡(luò)整體,而不是孤立地來(lái)考慮。代謝網(wǎng)絡(luò)分流處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點(diǎn),其中對(duì)終產(chǎn)物合成起決定作用的少數(shù)節(jié)點(diǎn)稱為主節(jié)點(diǎn)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)下游分支的可變程度,節(jié)點(diǎn)分為:柔性節(jié)點(diǎn):解除一個(gè)分支的反饋抑制可提高該分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量。半柔性節(jié)點(diǎn):須降低主分支的酶活并同時(shí)提高次分支的酶活或解除其反饋抑制,才可提高次分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量。剛性節(jié)點(diǎn):其下游各分支的比例不易改變。
(一)代謝工程發(fā)展基礎(chǔ)相依網(wǎng)絡(luò):代謝網(wǎng)絡(luò)中各主節(jié)點(diǎn)集中于產(chǎn)物,為了避免中間物的過(guò)量積累,各分支的代謝流都必須保持平衡,各分支的分流相等,各節(jié)點(diǎn)的重要性相同。獨(dú)立網(wǎng)絡(luò):代謝網(wǎng)絡(luò)的主節(jié)點(diǎn)不集中,可以通過(guò)對(duì)代
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