DB15T 2555-2022原代奶牛乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)及鑒定技術規(guī)程-乳汁分離法

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB40內蒙古自治區(qū)地方標準DB15/T2555—2022原代奶牛乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)及鑒定技術規(guī)程-乳汁分離法Technicalregulationoftheisolation,primarycultureandTechnicalregulationoftheisolation,primarycultureandidentificationofBovineMammaryEpithelialCellsderivedfromfreshmilk2022-04-252022-05-25內蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標準化技術委員會（SAM/TC19）歸口。本文件起草單位：內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院、內蒙古大學。本文件主要起草人：杜瑞平、王瀟、特日格勒、張興夫、崔新潔、趙濛、云伏雨、張春華、羿靜、康長清。原代奶牛乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)及鑒定技術規(guī)程-乳汁分離法范圍本文件規(guī)定了乳汁分離法培養(yǎng)鑒定原代奶牛乳腺上皮細胞的術語與定義、材料、儀器和試劑耗材、操作步驟等技術要求與規(guī)范。本文件適用于從奶牛乳汁中分離培養(yǎng)和鑒定原代奶牛乳腺上皮細胞。本文件沒有規(guī)范性引用文件。下列術語和定義適用于本文件。原代原代牛腺皮胞 primarybovinemammaryepithelialcells從奶牛乳汁或乳腺中分離、培養(yǎng)并鑒定出來的上皮細胞。免疫光術 immunofluorescencetechnique染色組分析 karyotypeanalysis對不同生物的染色體組型（有絲分裂中期的染色體數目及其特征）進行定性和定量的分析和研究。4材料乳汁來源泌乳前期（22d～100d）健康奶牛。取樣用無菌水及75%酒精擦洗奶牛乳房，擠牛乳約500mL分裝于滅菌的藍蓋瓶中，37℃保溫瓶保溫帶回實驗室。儀器生物安全柜，CO2培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋（137℃，0.25MPa），普通光學顯微鏡，超低溫冰箱（-50℃～-86℃），PCR儀，電泳儀，凝膠成像儀，低速冷凍離心機（2000g，-8℃～10℃），低溫高速臺式離心機（20000g，-8℃～10℃），酶標儀，恒溫水浴鍋，倒置熒光顯微鏡（40x～640x）。試劑PBS0.25，0.4%臺盼藍，MTT(0.5mg/mL(DMSO)，總RNADNA，PCR，Taq4（10IgG，DAPI（10μg/（5μg/mL），0.2%TritonX－100，10%Giemsa染色液等。完全培養(yǎng)液：10%FBS+DMEM/F12+100U青鏈霉素雙抗+氫化考的松（1μg/mL）+孕酮（1μg/mL）+轉鐵蛋白（5μg/mL）+胰島素（5μg/mL）+谷氨酰胺（200mmol/L）+EGF（10ng/mL）。核型分析固定液：甲醇：冰醋酸為3:1。耗材T25細胞培養(yǎng)瓶，96孔細胞培養(yǎng)板，90mm培養(yǎng)皿，0.22μM濾膜，15mL/50mL離心管，2mL細胞凍存管，無酶PCR管，移液器，血球計數板等。分離200mL（100U/mL）PBS2：115mL，500g20min，（100U/mL）PBS500g15min1mL15mLPBS重懸，500g5min，1mL培養(yǎng)向細胞層中加入5mL完全培養(yǎng)液，接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48h換液。待細胞形成單克隆后，原瓶胰酶消化，長至80%匯集時，傳代培養(yǎng)。80PBS；T251mL37℃消化10min200μL300g5min，1:337℃、5CO24880凍存離心52×106/mL，用吸管輕輕吹打，令細胞處于重1mL8024h復蘇401min375CO2808818β根據NCBI上公布的?；蛐蛄性O計引物，引物序列符合附錄A。RT-PCR80RNARNADNADNAPCRPCR95℃，5min；95℃，30s；62℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；30個循環(huán)。擴增體系符合附錄B。細胞免疫熒光染色法鑒定角蛋白8固定細胞復蘇培養(yǎng)，生長到80%匯集時，吸棄培養(yǎng)液并用PBS清洗細胞2～3次，常溫下多聚甲醛固定30min，用PBS清洗細胞3次，每次5min～10min。封閉TritonX－100處理5min，用PBS清洗細胞3次，每次5min～10min；山羊血清封閉30min。100PBS于37℃下振蕩孵育1或4PBS35min～10min（50FITCIgG）30minPBS35min～10min。6.6.4鑒定加入DAPI10C。復蘇步驟同6.3.2，生長到80%匯集時，向培養(yǎng)液中加入秋水仙素使其終濃度為0.1μg/mL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3h～4h；消化步驟同6.2。緩緩加入5mL低滲KCl（0.075M，37℃預熱），并輕吹細胞使其懸浮，37℃孵育30min，加入1mL新鮮配制的核型分析固定液預固定3min，300g離心5min，棄上清，加入新鮮配制的核型分析固定液6mL，并輕吹細胞使其懸浮，室溫孵育30min，重復固定細胞2次并離心后，小心吸除大部分上清液，余下0.5mL固定液，輕吹細胞使其懸浮。用滴管吸取少量細胞懸液，從1m高處滴落在潔凈載玻片上（-20℃預冷），迅速于酒精燈上過火烤干，將制作的標本浸入Giemsa染色液浸染10min，流水沖洗至水流無色并自然風干。用滴管吸取少量細胞懸液，從1m高處滴落在潔凈載玻片上（-20℃預冷），迅速于酒精燈上過火烤干，將制作的標本浸入Giemsa染色液浸染10min，流水沖洗至水流無色并自然風干。29。附錄A（規(guī)范性）PCR擴增反應引物?；蛐蛄性O計引物見表A.1。表A.1PCRGeneBank序列號基因引物序列(5’-3’)產物長度NM_001033610.1角蛋白8F:TGGAAGGGCTGACTGATGAG540bpR:GCTTCCTGTAGGTGGCAATCNM_001192095.1角蛋白18F:CAGGGCGAGAAGGAGACCAT504bpR:TAAGGTCCTGAGGTTTGGGGNM_181008.2β-酪蛋白F:ATCCCTAACAGCCTCCCAC303bpR:AGAAAGGGACAGCACGGAC附錄B（規(guī)范性）PCR擴增反應體系PCR擴增反應體系見表B.1。表B.1PCR無酶水7.2μL上游引物（10μmol/L）0.4μL下游引物（10μmol/L）0.4μLSYBRPremixExTaqＴＭⅡ(2×)10μLcDNA模板2μL總計20μL附錄C（資料性）奶牛乳腺上皮細胞CK-8鑒定及染色體組型分析參照圖AACDC.1。圖C.1細胞免疫熒光組化鑒定奶牛乳腺上皮細胞角蛋白8A：鏡下染色體原圖；B：染色體組型的排列見圖C.2。圖C.2奶牛乳腺上皮細胞染色體組型分析參考文獻JingjingWang,ChangmingGuo,ZhengkaiWei,etal.Morinsuppressesinflammatorycytokineexpressionbydownregulationofnuclearfactor-κB