提取RNA原理及其常遇到的問題

提取RNA原理及其常遇到的問題提取RNA原理及其常遇到的問題提取RNA原理及其常遇到的問題提取RNA原理及其常遇到的問題編制僅供參考審核批準生效日期地址：電話：傳真:郵編:RNA提取一般步驟總結(jié)RNA提取原理：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。

RNA提取的一般步驟

所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑:提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進入有機相而RNA留在水相。第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。

實驗步驟：

破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。

1、破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

2、分離RNA一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。

3、沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（）或異丙醇。

4、洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。

5、融解RNA一般使用TE。

6、保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至，12,000×g離心5分鐘。

氯化鋰法提取總RNA：

本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片斷丟失的缺陷。試驗試劑：

1、氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L，過濾滅菌】

2、懸浮液【10mMTris-HCL,1mMEDTA(pH8,0),%SDS】

試驗步驟：

1、對于大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細胞（107個細胞/ml），則每克組織或細胞加入氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。

2、勻槳液在0－4℃放置4小時后，12000g離心30分鐘。

3、取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復(fù)步驟2。

4、沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鐘并不時搖動混勻，4000g離心5分鐘。

5、取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心。

6、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。

植物RNA提取過程中難點的相應(yīng)對策酚類化合物的干擾及對策：

許多植物組織特別是植物的果實（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）和樹木類植物中富含酚類化合物。酚類物質(zhì)的含量會隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時，酚類物質(zhì)會釋放出來，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚?，并隨氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)（browningeffect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易程度與材料中酚類物質(zhì)的總量之間并無相關(guān)性，因此認為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認為所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)（如原花色素類物質(zhì)）是影響RNA提取的一類化合物。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然后再將其與RNA分開。

防止酚類化合物被氧化的方法：

1、還原劑法：一般在提取緩沖液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸來防止酚類物質(zhì)被氧化，有時提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達2％。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認為在過夜沉淀RNA時加入(-巰基乙醇（終濃度1％）可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醌的還原劑，用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減，醌類化合物可被還原成多酚化合物。

2、螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很強的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強。原花色素類物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使原花色素類物質(zhì)不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時pH值是一個重要的影響因素，在以上時PVP結(jié)合多酚的能力會迅速降低［11］。當(dāng)原花色素類物質(zhì)量較大時，單獨使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結(jié)合使用。

3、Tris-硼酸法：如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸（），其中的硼酸可以與酚類化合物依*氫鍵形成復(fù)合物，從而抑制了酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合。這一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過高（＞）則會影響RNA的回收率。

4、牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類似于抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物，減小了原花色素類物質(zhì)與RNA結(jié)合的機會，因此提高了RNA的產(chǎn)量。BSA與PVPP結(jié)合使用提取效果會更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用時要加入肝素以抑制RNase的活性。

5、丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA。

酚類化合物的去除：通過Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結(jié)合的多酚，可以直接通過離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50％）來沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認為即使多酚被氧化，其氧化產(chǎn)物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無需再用NaBH4來處理。

多糖的干擾及對策：

多糖的污染是提取植物RNA時常遇到的另一個棘手的問題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時RNA也被裹攜走了，造成RNA產(chǎn)量的減少；而在沉淀RNA時，也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)的方法中，通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過這些步驟仍會發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時多糖污染的問題。

用低濃度乙醇沉淀多糖是一個去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度10％～30％，可以使多糖沉淀下來，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質(zhì)莖中提取RNA時，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時，是在用CsCl超離心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30％乙醇來沉淀多糖的，進一步純化了RNA樣品。

另一個常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀（）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（）溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時是加1/3體積的醋酸鉀（）溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質(zhì)。在提取某些植物材料的RNA時，是將上述兩種方法結(jié)合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA時，是在勻漿液中加入體積的無水乙醇和體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質(zhì)。Su等在去除褐藻的多糖時，單獨使用乙醇或醋酸鉀都無效，只有兩者結(jié)合使用效果最佳。

Fang等認為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松樹RNA時，緩沖液中NaCl的濃度為和，通過氯仿抽提和乙醇沉淀RNA將RNA與多糖分離。Manning是將胡蘿卜種子等材料苯酚提取后的上清液稀釋，調(diào)節(jié)Na+離子濃度至80mM，然后加入體積的2-丁氧乙醇來沉淀去除多糖。

蛋白雜質(zhì)的影響及對策：

蛋白質(zhì)是污染RNA樣品的又一個重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)，因而要獲得完整的、高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。常規(guī)的方法是在冷凍的條件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等，這樣在勻漿時可以使蛋白質(zhì)變性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K來降解蛋白雜質(zhì)。進一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。Wilcockson利用蛋白質(zhì)與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70％高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大于蛋白質(zhì)的溶解度，因而將大部分蛋白質(zhì)沉淀下來。接著在離心上清液中加入兩倍體積的無水乙醇，這時RNA能沉淀下來而能溶于70％高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質(zhì)仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質(zhì)。

次級代謝產(chǎn)物的影響及對策：

從植物組織中提取高質(zhì)量RNA的另一個難點是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，所以，目前還沒有什么特殊的方法來解決這個問題。Baker等綜合Hughes等的選擇性沉淀法、Chirgwin的氯化銫梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹種子、成熟松樹針葉等植物組織的RNA。由于植物組織特別是高等植物組織細胞內(nèi)外組成成分的復(fù)雜多樣性，使得植物組織RNA的提取相對于其它生物材料來說要困難的多。實踐中經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)，即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會有很大的不同；含有某種干擾因素的不同植物材料，其適用的RNA提取方法可能不同；即使是同一種植物同一種組織材料，但來源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一樣。所以，對于某一植物或其組織來說，其相應(yīng)的RNA提取方法必需經(jīng)過摸索和實踐才能確立。隨著植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的拓寬，可以肯定地說，在作為其研究基礎(chǔ)的植物材料RNA提取過程中還會出現(xiàn)新的難點，但隨著不斷地探索和經(jīng)驗的積累，科學(xué)工作者們一定會迅速地解決這些難點，為植物分子生物學(xué)的發(fā)展鋪平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法多酚類植物的RNA提?。?/p>

蘋果棉花等多酚類植物提取RNA用TRIZOL一般提不出來。這個方法是驗證過有效的,提取的RNA純度不是特別高,但是用作northern足夠。

實驗試劑：

提取buffer200ml：NaCl100mM

Tris10mM(tris-HCl

EDTA10mM

SDS1%

NaOH調(diào)至,定至200ml,加200ulDEPC融解.

試驗步驟：

1、離心管用液N2冷凍吼加入樣品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,劇烈振蕩1-2min,冰上放置5min。

2、4度12000rpm離心15min,上清轉(zhuǎn)入新管,加氯仿異戊醇抽提一次。

3、取600ul異丙醇,-20度沉淀20min.

4、12000rpm離心10min。

5、沉淀用70度乙醇洗。

6、8000rpm5min。

7、沉淀晾干,溶于30ulDEPC水。

銀杏等木本裸子植物的RNA提取方法：

銀杏、香機等木本裸子植物，酚類和多糖等次生物質(zhì)含量較多，對RNA的分離和純化有很大干擾，嚴重影響了提取RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，給相關(guān)的分子生物學(xué)實驗的進行帶來阻礙。目前，RNA的提取方法很多，采取常規(guī)的Trizol試劑盒、SDS等方法不能提取銀杏RNA，而ShujunChang等(1993)的CTAB法，提取RNA質(zhì)量也較差，降解也十分嚴重。對其提取步驟進行改進，得到質(zhì)量較高的銀杏RNA樣品。

試驗試劑：

1、1Mtris:1Tris，溶于60mL水中，用濃鹽酸調(diào)至Ph8.0，定容至lOOmL.用滅菌的DEPC水溶解。

2、500mMEDTA:1EDTA"H2O加入80mL水中，攪拌溶解，用NaOH調(diào)pH至，定容至100mL。

3、10mol/LLiCL:gLiCL,100mL水溶解即可。

4、提取緩沖液(DEPC水處理):2%CTAB（蛋白質(zhì)變性劑）.2%PVPK30（去除多酚類物質(zhì)）100mMTris-HCL25mMEDTA（金屬鰲合劑）MNaCL（去除多糖和CTAB）配法:2gCTAB,2gPVP,10mL1mol/Ltris,5mL500mMEDTA,,定容到100mL。

5、亞精胺(提取時加少量)（RNA酶抑制劑）

6、4%0一疏基乙醇(提取時加)（去除多酚類物質(zhì)）

7、氯仿異戊醇(24:1)（抽提蛋白質(zhì)）

8、10MLiCL（沉淀大分子RNA）

9、SSTE（溶解RNA）MNaCL

0.5%SDS

1mMEDTA

10mMTrisHCL(pH8）配法:gNaCL,gSDS,mL1Mtris,100uL500mMEDTA,,定容至50mL。

試驗準備：

1、研缽和玻璃器皿用錫紙包好，200℃以上向溫烘烤2小時以上，或180*C高溫烘烤4小時。

2、塑料制品(槍頭和離心管)最好用新的，并且用報紙包好，121'C高壓滅菌，滅菌40min，或連續(xù)兩次121'C高壓滅菌，每次滅菌20min，然后用烘箱烘千。

3、所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPCuJ濃度為%,37℃過夜，1211C高壓滅菌40min.(其中Tris因為不能用DEPC處理，所以Tris用DEPC處理的水溶液滅菌后配制。)

試驗步驟：

【根據(jù)文獻(ShujunChang,1993)CTAB法，稍作改進?！?/p>

1、將4mL提取液加入到lOmL離心管c卜650C水域加熱。

2、用液氮冷卻研缽，在研缽中加入少量的抗氧化劑PVP，取1g低溫冷凍的銀杏葉片，迅速置于研缽中，不時加入液氮以防止研磨過程中葉片融化，充分研磨后，立即加入到預(yù)熱好的提取緩沖液中，用手搖功混勻。

3、65℃，水域1min后冷卻至室溫。

4、加入等體積(4mL)的氯仿:異戊X17(2=L:1)，混勻，10000rpm,40C，離心10min。

5、小心吸取上清液，加入等體積(4mL)的仿:異戊醇(24:1),混勻，10000rpm,40C,離心10min。

6、吸取上清液，加1/4體積的IOMLiCL,混合，4℃沉淀過夜，然后10000rpm離心20min。

7、用槍吸干，用500uLSSTE溶解沉淀，轉(zhuǎn)到L離心管.加等體積氯仿:異戊醇混勻，10000rpm,40C，離心10min。

8、離心吸取取上清液，加兩倍體積的無水乙醉，-70℃沉淀至少30min，或一200C下沉淀2h。

9、12000rpm,40C,離心20min，去上請用70%的乙醇洗兩次，吹干沉淀。

10、用40uLDEPC處理的水溶解沉淀，得到RNA樣品。

11、除用于電泳和紫外檢測外，其余RNA-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

改良Krapp提取法：

試驗試劑：

1、RNA抽提掖：母液：4mol異硫氰酸胍20mmolEDTA

20mmolMESpH。工作液：取400ml母液加入2-ME貯存在4℃條件下備用。

2、RNA重懸液：2molLiCl

10mmolNaAc調(diào)整終體積為250ml，pH，滅菌后貯存在4℃條件下備用。試驗步驟：

1、取新鮮植物材料~1g，冷凍干燥。如果必要可加入砂一起研磨，然后加入10mlRNA抽提掖充分混勻。

2、4℃條件下8000rpm離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入等體積的酚/氯仿抽提掖，在4℃條件下8000rpm離心10min。

3、上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混勻后，在4℃條件下8000rpm離心10min.）。

4、小心將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中，加入1/10vol3molNaAc和2vol冷無水乙醇，在-80℃條件下沉淀2小時。

5、在4℃條件下8500rpm離心30min.，小心棄去上清液，沉淀重懸于RNA重懸液中，置于4℃條件下1小時。

6、4℃條件下8500rpm離心10min.，棄去上清液，沉淀溶于適當(dāng)體積的DEOC處理水中。檢測后分裝，置于-70℃條件下保存。一些特殊組織的RNA提取1、纖維組織：

心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于徹底破碎組織。這些組織細胞密度低，單位重量的組織RNA的含量就少，建議用盡可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纖維組織終RNA，由于纖維組織終RNA含量較少，可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量，并在液氮中將組織徹底磨碎，同時適當(dāng)減少溶解RNA的溶液體積。

2、蛋白/脂肪含量高的組織：

動物的腦和某些特殊的植物組織中，脂肪或者蛋白的含量很高，可以采用TRNzol來提取此類樣品中的RNA。在該提取過程中，用氯仿抽提后，如上清仍含白色絮狀物，必須用氯仿再次對上清進行抽提。使用TRNzol提取脂肪含量高的組織中RNA時，使用氯仿抽提后會分成油滴、水相（含RNA）、DNA中間層、有機相四層，應(yīng)用移液管小心吸取水相液體，避免吸到油滴層和DNA層。

3、核酸/RNase含量高的組織：

脾、胸腺、胰臟等組織的核酸和核酸酶含量很高，可以在液氮中碾磨組織，再快速勻漿。如果裂解液太粘稠（因為核酸含量高的緣故），酚/氯仿抽提不能有效分層，可以加入更多裂解液以解決此類問題。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成則表明有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提，去除DNA污染。

4、植物組織和真菌組織：

植物組織和真菌組織比動物組織更為復(fù)雜，因此為了避免出現(xiàn)內(nèi)源酶作用使RNA降解的現(xiàn)象，一般選擇在液氮條件下對植物或者真菌材料進行碾磨。如果降解問題不能解決，基本上是由于樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。許多植物和真菌中的內(nèi)含雜質(zhì)如多糖、多酚等都會殘留，因為這些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可以與RNA同時沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的RNA提取過程中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑（RNAplant）來去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。RNA純化試驗步驟：

用酚氯仿抽提：這兩種有機溶劑合用，比單獨用酚抽提的除蛋白效果更佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚，先加入酚后加入氯仿。

1、核酸樣品置有蓋小離心管中，加入等體積的酚/氯仿（如有20ul樣品，則加入10ul酚10ul氯仿）。

2、旋渦混勻管內(nèi)容物，使呈乳狀。

3、12000×g室溫離心15秒。

4、水相移入另一離心管，棄去兩相界面和有機相。

5、重復(fù)步驟1－4步操作，直至兩相界面上見不到蛋白質(zhì)為止

6、按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。

7、2－8度，離心，10500rpm/min，15min,取上清，用200ul在20ul刻度使用，小心不要使界面混淆，剩余界面上不要）。

8、上清中加入等量的異丙醇(一般是:1),顛倒5次（用200ul槍加小心），室溫靜置10min。

9、

2-8度離心，10500rmp/min,10min,棄上清。

10、RNA洗滌：75％酒精（這次用的100％。未影響）1ml沉淀，輕輕彈其底部（直接放入－70度冰箱可以長期保存，靜置幾秒鐘。11、2－8度離心，8500rpm/min,5min,棄上清。12、取出濾紙，將EP管敞開放在濾紙上，管口向酒精燈（不要完全干燥，不好溶解）。13、DEPC水溶解（30ul,可變），分裝,2ul電泳，2ul比色，其余5ul分裝至于手套中凍于－20度中。植物組織mRNA提取由于mRNA末端含有多poly(A)+，當(dāng)總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。

實驗步驟：

1、用LNaOH懸浮oligo(dT)纖維素。

2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。

3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于。

4、將提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當(dāng)所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。

5、測定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。

6、測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。

7、加入1/10體積的3MNaAc，倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。

8、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。

9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。

10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。

注意事項：

1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。2、oligo(dT)纖維素柱用后可用lNaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復(fù)使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。mRNA純化mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。

寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA：

試劑試劑：

1、3M醋酸鈉（pH）

2、NaOH

3、1×上樣緩沖液：20mMTris-HCl(pH；NaCl；1MEDTA（pH）；%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH、NaCl、EDTA（pH）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為%。

4、洗脫緩沖液：10mMTris-HCl(pH；1mMEDTA(pH；%SDS

5、無水乙醇、70%乙醇

6、DEPC

試驗步驟：

1、將寡聚（dT）-纖維懸浮于的NaOH溶液中。

2、用DEPC處理的1ml注射器或適當(dāng)?shù)奈?，將寡聚（dT）-纖維素裝柱，用3倍柱床體積的DEPCH2O洗柱。

3、使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于。

4、將RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當(dāng)RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。

5、將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。

6、用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。

7、用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。

8、OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3MNaAc（）、倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。

9、4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。

10、用適量的DEPCH2O溶解RNA。

注意事項：

1、整個實驗過程必須防止Rnase的污染。

2、步驟4中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，尤其是mRNAPoly(A+)尾處的二級結(jié)構(gòu)，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。

3、十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內(nèi)液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。

4、寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌ddH2O、上樣緩沖液洗柱。5、一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細胞能提取1-5μgPoly(A+)RNA，約相當(dāng)于上柱總RNA量的1%-2%。RNA提取注意事項一些RNA提取方法，在進行具體實驗時，應(yīng)根據(jù)研究對象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。

1、在核酸提取時，為了增加細胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時間越長越好。

2、有時在使用蛋白酶時，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應(yīng)溫度提高到50－60℃，并將反應(yīng)時間縮短到15－25min，但酶用量必須提高10－20倍。溶菌酶使用時緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對酶有抑制。

3、許多植物材料中富含酚，在細胞破碎時，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的錕類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP和巰基乙醇對降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提取時將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。

4、許多生物材料在提取核酸時，都會遇到多糖的污染問題，具體表現(xiàn)為有機溶劑沉淀時，沉淀很多，但復(fù)溶時，大量沉淀不溶，電泳觀察時核酸含量很低。

克服多糖污染可采用以下一些辦法

1)CTAB多次抽提。

2)在有機溶劑沉淀時先稀釋樣品濃度（可到10倍左右），對低濃度樣品再進行沉淀。

3)在有機溶劑沉淀時選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑，此時氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到的體積。異丙醇沉淀核酸時，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會影響核酸的進一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。

5、在核酸提取時，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強于氯仿，但酚與水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸外，水相中還會殘留酚，而酚的存在將對核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在有機溶劑沉淀時一定要用氯仿從抽提。

6、在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA時，更要避免劇烈操作。

7、在沉淀核酸時可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。

8、在提取核酸時，如樣品濃度低，則應(yīng)增加有機溶劑沉淀時間，－70℃下>30min;－20℃過夜將有助于增加核酸的沉淀量。9、在核酸提取過程中有機溶劑沉淀后復(fù)溶時可加水因此時離子濃度可能較高，而到高度純化后低溫保存時最好復(fù)溶于TE緩沖液中，因溶于TE的核酸儲藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。10、核酸提取后可通過PCR、RT－PCR直接擴增出目的基因片斷，也可首先構(gòu)建文庫、然后由RACE、dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標記技術(shù)、差異雜交或文庫扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫中篩選出完整基因。11、在抽提過程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù).提取RNA請盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時間要盡可能的短。防止RNA酶污染的措施：

1、所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

2、塑料器皿可用%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3、有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用%DEPC水沖洗，晾干。

4、配制的溶液應(yīng)盡可能的用%DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)μm濾膜過濾除菌。

5、

操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。

6、設(shè)置RNA操作專用實驗室，所有器械等應(yīng)為專用。

7、DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理

8、加樣原則是DNA最后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個管子里面，混合均勻之后再分裝到各個管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。

9、普通實驗室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個房間里有比較大的關(guān)系，最容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。因此要格外注意一些。

常用的RNA酶抑制劑：

1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。

2、異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

3、氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

4、RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。

5、其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。因為DEPc不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA，因此在分離和純化RNA過程中不能使用，而且它與一些緩沖液(例如Tri)不能相容在所有RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

附確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法：

按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000ng的RNA加入至ml的離心管中,并且用的Tris緩沖液補充到10ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別，則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。RNA提取常見問題分析

用Trizol抽提的RNA，用瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)許多條帶(至少四條以上)，是哪些原因?qū)е碌模?/p>

參考見解：

1、是從組織里抽的還是細胞抽的組織的RNA電泳不理想，但目的條帶仍能跑出來。細胞的電泳相當(dāng)漂亮，但有時逆轉(zhuǎn)錄效果反而不好。組織經(jīng)常出現(xiàn)這種情況，組織抽提的RNA不純，而且多多少少有降解。不過下一步可以接著做逆轉(zhuǎn)錄，可能對后面的實驗影響不會很大。

2、是mRNA的話，這樣的效果挺不錯的。如果是總RNA，那是降解了。不過細胞的RNA應(yīng)該不容易降解，可以上樣少點再跑膠。

3、可以試試在70度加熱5分鐘,然后再跑跑電泳可能有意想不到的結(jié)果.

4、建再進行RNA精致的過程,也就是Trizol后,加氯仿,吸取上清盡量少吸,然后將其再按規(guī)程離心一次吸取上清后加入異丙醇,然后再用70%冰乙醇洗兩次可見RNA,如果還是不行的話最好用柱式吸附柱將上清與70%冰乙醇混合后過柱懷疑這種屬于基因組DNA污染在操作過和的preeogress降解.所以一定要按規(guī)程進行抽提.

所有的準備工作如干烤、DEPC浸泡等均按分子克隆上說的處理了，可是就是提取不出RNA來。異丙醇沉淀后在管底也有乳白色的東西，用DEPC水溶解卻溶解不了，很粘稠。電泳什么也看不見。用的組織是小鼠的肺和脾臟，TRIZOL用的是GIBCOL的。組織和TRIZOL的比例為每50mg用1mlTRIZOL。為什么？

參考見解：乳白色的東西有可能就是RNA,一定要溶解,實在不行就在70%乙醇洗過后迅速空氣干燥一下,加DEPC水,還溶解不了就65度加熱10分鐘.好象100mg組織加1mlTRIZOL足夠了。

在沒有液氮的條件下，直接研磨組織成粉末再加入TRizol中，對RNA提取的質(zhì)量會不會影響很大或者在研磨過程中直接加入TRizol研磨直到成粉末，這樣可不可?。?/p>

參考見解：在沒有液氮的條件下，直接研磨組織成粉末再加入TRizol中，這樣RNA早就沒有了。

要是在研磨過程中直接加入TRizol研磨直到成粉末，可以觀察組織,看研磨得什么樣子了,磨的差不多時加trizol,可試一下,鏡下觀察然后確定加入trizol試劑。

用Tiangen的TRNzol提的月見草（柳葉菜科）葉片RNA，跑電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA已經(jīng)降解了。后換了煙草的葉片，同樣的提取，出現(xiàn)18s,和28s的兩條帶，結(jié)果比月見草好。但是沒有到18s:28s=2:1的程度。而且下面還有多出來的條帶，不知道是5s，還是降解了的RNA。下面是電泳圖，第二道是煙草總RNA，OD260/280=，第三道是月見草總RNA，OD260/280=。普通瓊脂糖膠%，130v,20min請問：

1.煙草的RNA的結(jié)果足夠做RT-PCR了嗎想分析的是葉綠體上的幾個基因。

2.想換用TRNzol以外的RNA提取試劑和方法試試?；蛘邠Q用其它品牌的TRNzol。不同的物種差異還是很大，提月見草時沉淀出的RNA有淺淺的紫色，不知道是否有什么物質(zhì)影響了RNA的提取。參考見解：

從電泳圖分析：

1、月見草的RNA已經(jīng)降解了。

2、煙草的RNA可以做RT-PCR，質(zhì)量和純度都不錯?！跋旅孢€有多出來的條帶”應(yīng)是葉綠體RNA,是在植物RNA提取中常見的情況.

3、不用換Trizol，把條件控制嚴一點，應(yīng)該能提得好的，多摸摸條件。

4、用過Qiangen的RNAEasy效果極好.天為時代的RNAPlant也不錯,只是試劑味道大了點.聽說天為時代現(xiàn)在好像也有與QiagenRNAEasy類似的盒子.不過RNAEasy系列的試劑盒提取某些植物會有微量基因組DNA污染,需RNasefree的DNase處理.用過inventrogeTRizol,效果不錯.

黃曲霉rna提取（trizol法），加完異丙醇沉淀后得到的是接近透明的沉淀，加75％酒精洗滌后，加depc水能溶解，電泳后跑不出來帶，有的點樣孔很亮，是怎么回事另外，是不是rna即使降解了也能跑出smear帶參考見解：

1、可能是菌體量過大導(dǎo)致Trizol量嚴重不足，一般為100mg/1mlTrizol。

2、存在操作過程中蛋白質(zhì)殘留過多的現(xiàn)象是點樣口很亮，用氯仿抽提時，盡量不要吸到蛋白層，為保證RNA的質(zhì)量，水層可以稍稍多留點；照片說明RNA在提取過程中降解了，出現(xiàn)了一片Smear。

3、導(dǎo)致RNA降解的原因很多，過濾后的菌體用Pbs清洗后是不是用離心的方法收集的菌體。PBS洗滌后有沒有把PBS完全吸盡；沒吸盡的話可能導(dǎo)致trizol不能完全把菌體中的RNA酶抑制住從而導(dǎo)致RNA被完全降解。

4、液氮研磨的時間并不重要，最好是快速而充分的研磨才是最必要的，而且中途不能讓其解凍。覺得可以了就馬上加trizol一直研磨直至其變得像潤膚霜就可以繼續(xù)下面步驟了重要的是菌體量和Trizol加的量有多大，如果Trizol加量相對少，就不能很好的裂解組織和細胞，同時也不能很好的保護RNA,RNA會被RNAase降解掉，所以可以適當(dāng)增加Trizol的量。

5、再有操作過程是否規(guī)范，最好都是用過濾嘴槍頭，最好都是經(jīng)過depc處理tipandtube使用一次的橡膠手套，全程帶口罩等等細節(jié)。至于電泳的問題只要是RNA專用的電泳槽，電泳槽的問題不大，最主要是在提取的過程中RNA降解了。

陽性菌RNA提取可否用Trizol是否可用其他試劑？

參考見解：不可以，陽性菌細胞壁含有交聯(lián)的肽聚糖，Trizol沒有這個能力破碎?？梢試L試采用超聲波破碎再加Trizol提取的方法（一般是加入Trizol后再超聲波破碎），或者是研磨破碎再加Trizol，可以根據(jù)實驗室的條件都做一下，選擇其中效果比較好的方法。

做共同葉片RNA提取。在提取RNA后跑電泳后在點樣空和28S間總有一段DNA片段的亮帶。怎么除去ＤＮＡ污染呢用的是ＱＩＡＧＥＮ的植物ＲＮＡ提取試劑盒。

參考見解：反轉(zhuǎn)錄的時候第一步加DNase處理:RNA2ug加DNase1ul,10xbuffer1ul,補DEPC水至10ul.放到PCR儀里37度30min，接著拿出來加stopsolution1ul停止反應(yīng)。然后72度10min(這一步是讓RNA二級結(jié)構(gòu)打開)以下就進行反轉(zhuǎn)錄步驟。

RNA提取中的酚使用的是水飽和酚還是Tris酚PH值是多大？

參考見解：RNA提取一定要用酸飽和酚,pH在左右.水飽和酚是兩相的，上層是水。分子克隆上推薦用水飽和酚的。酸性條件下，DNA將進入有機相，可以與RNA分開。

提取植物病毒的RNA，用于反轉(zhuǎn)錄成cDNA，請問下面的試驗方案可行嗎存在什么問題應(yīng)該怎么樣改進？

1、稱取病葉，加液氮研磨，迅速轉(zhuǎn)入一支的離心管；

2、加入500ul酚/氯仿和500ul的RNA抽提緩沖液，振蕩2min，4度12000rpm離心5min；

3、上清用500ul酚/氯仿再抽提一次后4度12000rpm離心5min，加上與上清等體積的4M的Licl（有些資料中說用于反轉(zhuǎn)錄的RNA不能用Licl，對嗎），4度沉淀4hr以上；

4、4度12000rpm離心15min；

5、沉淀用70％的乙醇洗兩次（乙醇是用來沉淀核酸的，此處用來不知何用）；

6、真空干燥后，沉淀溶于20ulDEPC處理的雙蒸水中，－70度保存?zhèn)溆?/p>

參考見解：

1、平時抽提動物組織中的RNA使用Trizol--Invitrogen公司生產(chǎn)的一種即用型的抽提總RNA的試劑，使用非常方便，在液氮研磨組織時加上Trizol，后面的過程與所寫的相差不大，得率高，適合做RT。

2、70%乙醇含有一定的水，以其洗滌可以使鹽（此處為LiCl)溶解于上清中，從而去掉RNA中的鹽分，減少對后續(xù)步驟的影響。

3、

“4度沉淀4hr以上”會不會太久了，太久的話RNA很容易被降解掉。無水乙醇通常用來沉淀RNA/DNA。

4、實驗室做植物病毒RNA的，對常規(guī)的方法改進了許多效果特別好。

1)稱取克葉片，放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入預(yù)冷的1mlSTE緩沖液和8μlβ-巰基乙醇，研磨成勻漿。

2)轉(zhuǎn)移至離心管中振蕩混勻。

3)加入1ml水飽和酚，1ml氯仿/異戊醇(49:1)，充分混勻，冰浴中放置10分鐘，中間混勻2～3次。

4)臺式高速離心機10000rpm，室溫離心15分鐘。

5)小心吸取水相，加入1/10體積的3MNaAC(pH和等體積的異丙醇，上下顛倒混勻。在－20℃中沉淀3小時。

6)臺式高速離心機11000rpm，室溫離心20分鐘，棄去上清。加600μl冰預(yù)冷70%的乙醇洗滌沉淀2次，室溫干燥15分鐘，至乙醇揮發(fā)完全為止。

7)

用50μl無菌雙蒸水充分溶解提取的RNA。

提RNA，可是電泳后什么條帶都沒有，用的是REDzol，是因為細胞太少了還是別的什么原因，在加了氯仿后沒有出現(xiàn)3層，只有沉淀和上清，是不是因為加氯仿到離心隔的時間太久了？

參考見解：

1、樣品量太小；

2、操作時沒有嚴格按照提RNA的要求做，一般需要帶手套，最好帶上口罩，所有塑料用品需要用DEPC處理并高壓，要在超凈臺上操作，盡量不讓外源的RNA酶降解RNA。

3、RNA電泳的電泳液和膠必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且要用DEPC處理，電泳槽、制膠板先用蒸餾水洗滌然后用75％的酒精處理，還有，要單獨一個槽子跑，不要和其他膠一起跑。跑膠