102例急性白血病的細胞形態(tài)學、免疫學及分子生物學分型

102例急性白血病的細胞形態(tài)學、免疫學及分子生物學分型唐艷萍;張力圖;蔡政民;唐亞梅;蘇程琳;譚曉玉;謝雨萱;利基林102RT-PCR102102FABALL51AML45（UAL）6FAB6UAL2B-ALL、3B／T1（髓系／B），96B-ALL36T-ALL15AML45102例急性白血病患者中檢出融合基因36例（35．3％），包括PML／RARα、CBFβ／MYH11、AML1／ETO、TLS／ERG、TEL／AML1、E2A／PBX1、MLL／AF9、MLL／AF4、BCR／ABL9種融合基因。結(jié)論FAB分型對UAL無法確診時，與細胞免疫學及分子生物學分型聯(lián)合，可使白血病分型更為精確、客觀?！酒诳Q】《山東醫(yī)藥》【年(卷),期】2015(000)003【總頁數(shù)】3頁(P38-40)【關(guān)鍵詞】急性白血病;形態(tài)學分型;免疫學分型;融合基因【作者】唐艷萍;張力圖;蔡政民;唐亞梅;蘇程琳;譚曉玉;謝雨萱;利基林【作者單位】530021;廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤530021530021;廣西醫(yī)科大學附530021530021;廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南寧530021;廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南寧530021;廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南寧530021【正文語種】中文【中圖分類】R733.71血病，難以準確分型，其診斷有一定的局限性[1]。目前，WHO102RT-PCR20118～20131272302～80WHOFABALL51AML45主要儀器及試劑 Beckman-CoulterEpicsXL流式細胞儀(Beckman-Coulter公司)；TProfessional熱循環(huán)儀(biometra公司)；UVIFireReader凝膠成像系統(tǒng)(UVITEC公司)；MK-20干式恒溫儀(杭州奧盛)。單克隆抗體：異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人單克隆抗體 CD20、sIgM、cIgM、CD5、CD7、TdT、HLA-DR、CD13、MPO；藻紅蛋白熒光素(PE)標記的鼠抗人單克隆抗體CD2、CD10、CD22、CD33、CD117、cCD79a；藻紅蛋白—得克薩斯(ECD)標記的鼠抗人單克隆抗體CD3、CD14、CD19、CD34、cCD3；藻紅蛋白—花青素(PE-Cy5)標記的鼠抗人單克隆抗體CD45；溶血劑、破膜劑、固定劑、鞘液(PBS)均購自Beckman-Coulter公司。方法標本處理 嚴格按無菌操作規(guī)程，取患者骨髓，每管2～3mL，EDTA凝，混勻，分別行細胞形態(tài)學檢查、流式細胞學免疫分型及融合基因檢測。細胞形態(tài)學檢查 患者骨髓涂片，行免疫組化染色分析白血病的分型分型)。流式細胞學免疫分型 采用四色熒光素(FITC、PE、PC5、ECD)標記法進行骨髓血細胞免疫表型分析。細胞膜抗體標記：取15μL樣品與單抗5μL混勻后室溫避光孵育15min，加入600μL溶血劑混勻避光孵育15min，鞘液洗滌2次，100μL鞘液重懸即可上機檢測。胞質(zhì)內(nèi)抗體標記：取15μL樣品與5μLCD45混勻后室溫避光孵育15min，加固定劑避光孵育15min后鞘液洗滌，加40μL破膜劑避光孵育15min，加入待測抗體各5μL，鞘液洗滌2次，100μL鞘液重懸即可上機檢測。結(jié)果判定以膜抗原≥20%，胞質(zhì)內(nèi)抗原≥10%為陽性。多重巢式RT-PCR檢測 ①細胞總RNA提?。悍蛛x患者骨髓的單個核細胞，采用血液總RNA提取試劑盒(天根，貨號：DP433)提取總RNA，并通過微量紫外分光光度儀測定RNA濃度及純度。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反應(yīng)體系20μL，含OligodT18Primer、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP、RNasin、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶。42℃、1h,70℃、5min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。③PCR擴增：采用融合基因篩查試劑盒(北京思爾成公司，貨號：F103)進行多重巢式PCR。第1輪擴增條件：95℃、5min；95℃、30s，59℃、1min，72℃、1min，共25個循環(huán)；72℃、8min。第2輪擴增條件：95℃、5min；95℃、30s，59℃、1min，72℃、1min，共29個循環(huán)；72℃、8min。④PCR產(chǎn)物電泳：取第2輪PCR產(chǎn)物，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。FAB分型102FABALL51L17L237L37AML45M11M214M310M46UAL6白血病流式細胞學免疫分型102B-ALLT-ALL15AML456FABUALALL(B/T3/B1296B-ALL36T-ALL15例，AML45例。38例B-ALL主要表達抗原依次為cCD79a(89.5%，34/38)、CD19(86.8%，33/38)、CD10(78.9%，30/38)、CD22(76.3%，29/38)，非特異HLA-DR(73.7%，28/38)表達率較高。B-ALLCD33(26.3%，10/38)，CD22(5.3%，2/38)，CD52(5.3%，2/38)。15例T-ALL患者最敏感的指標為cCD3(80.0%，12/15)、CD7(80.0%，12/15)，其次為CD2(73.3%，11/15)、CD5(66.7%，10/15)。T-ALL有4例CD10(26.7%，4/15)、2CD33(13.3%，2/15)交叉表達。45AMLCD33、cMPO、CD11797.8%(44/45)、84.4%(38/45)、73.3%(33/45)。AMLCD73(6.7%，3/45)、CD193多重巢式RT-PCR檢測白血病相關(guān)融合基因 102例急性白血病患者檢出融合基因36例，總檢出率為35.3%。在56例急性淋巴細胞白血病患者中檢出融合基因21例，總檢出率為37.5%，包括TLS/ERG、TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL/AF9、MLL/AF4、BCR/ABL6種融合基因，分別為3、6、42、1、5例，各占14.3%、28.6%19.0%、9.5%、4.8%、23.8%。8例ALL-L3未檢出融合基因。在45例急性髓細胞白血病患者,檢出融合基因14例，總檢出率為31.1%，包括PML/RARα、CBFβ/MYH11、AML1/ETO、MLL/AF94種融合基因，分別為7、4、1、2例，各占50.0%、28.6%、7.1%、14.3%。此外，1例急性混合型白血病檢出TLS/ERG融合基因。胞形態(tài)的多形性等特點，其診斷需進行明確分型[2]。伴隨科學技術(shù)的不斷發(fā)展，F(xiàn)ABMICM102FABALL51AML45UAL6FABALL，6UAL2B-、3ALL(B/T1/BALL56B-ALL38T-ALL15，B/T3例；AML45/B1CD13、CD33具有骨髓相對特異性；MPO為中性粒細胞內(nèi)嗜苯胺藍顆粒的主要成分，其蛋白于早幼粒階段開始合成，MPO是髓系特異性標志[3]。有研究[4]表明CD117是髓系較特異的表面標志，可作為輔助診斷AML的標志抗原。本研究發(fā)現(xiàn)，AML患者M1～M5各亞型廣泛表達CD33(97.8%)、CD117(73.3%)和胞質(zhì)內(nèi)抗原cMPO(84.4%)，但特異性有所差異。CD33在B-ALL、T-ALL中有交叉表達，表達率為26.3%、13.3%。而CD117(5.3%、6.7%)和cMPO(5.3%，0%)交叉表達少見，特異性較好。在較多文獻[5，6]中還報道了AML患者高表達CD13，但在本次研究中CD13的表達率僅為31.1%，并且6例M4無1例表達。B淋巴系最常見的抗原有cCD79、CD19、CD10、CD20、CD22。cCD79a是B淋巴系的特異性標志，只表達與胞質(zhì)內(nèi)，不表達于細胞膜。有文獻[7]CD10CD10B-ALLB-ALL(89.5%AML(4.4%T-ALLCD10(78.9%)、CD22(76.3%B-ALLCD20敏感性較差，表達率只有36.8%。cCD3抗原是T淋巴細胞的特異性標志，其在胞質(zhì)內(nèi)的出現(xiàn)早于細胞膜，因此檢測胞質(zhì)內(nèi)敏感性強于胞膜。T-ALL中cCD3(80.0%)、CD7(80%)、CD2(73.3%)和CD5(66.7%)的敏感性及特異性均較高，在AML和B-ALL中表達極低。多數(shù)白血病遺傳學異常與形態(tài)學的關(guān)系尚無明確關(guān)系，但已發(fā)現(xiàn)某些融合基因在FAB[8]。PML/RARαt(15;17)(q22；q21)AML-M37M3inv(16)(p13；q22)t(16；16)(p13；q22)染色體異M4M5M243M41M2TEL/AML125B-ALL64～15B-ALL。E2A/PBX3%～53ALLBALL254BALL5BCR/ABLB-ALL[9]相一致。此外，TLS-ERGMLL/AF9ALLAML本研究以FAB分型為基礎(chǔ)，應(yīng)用流式細胞術(shù)的免疫分型，采用單克隆抗體對白血病的細胞來源和分化階段進行更精細的檢測，從而提高了白血病診斷的準確率，彌補了FAB分型的不足。再聯(lián)合分子生物學檢測，以其靈敏、快速、準確的特點，使白血病分型更為精確、客觀，為臨床診斷、預后及治療方案的選擇提供更為可靠的依據(jù)?！鞠嚓P(guān)文獻】[1]劉志祥,姚忠紅,李瑞明,等.129例急性白血病流式細胞術(shù)免疫分型的特點分析[J].中國實驗診斷學,2013,17(1):124-126.[2]呂曉東.白血病分型進展[J].醫(yī)學與哲學,2009,30(11):46-47.張臣青,陳志哲,劉庭波,等.急性白血病細胞膜和細胞質(zhì)抗原的流式細胞術(shù)檢測[J].福建醫(yī)科大學學報,2005,39(4):419-422.饒若,姚紅霞,金麗華,等.CD117[J].熱帶醫(yī)學雜志,2011,11(10)